Wieloelektrodowe zapisy nabłonka lemieszowo-nosowego
March 1st, 2010
Zapisy z matrycy wieloelektrodowej (MEA) dostarczają metody do badania aktywności elektrycznej dużych populacji neuronów. W tym miejscu przedstawiamy szczegóły preparatu MEA do rejestracji z nabłonka lemieszowo-nosowego myszy przy jednoczesnej stymulacji tkanki.
Planarne matryce wieloelektrodowe służą do nagrywania z narządu nosa UL. VNO jest usuwany z myszy tak, że nabłonek nerwowy pozostaje nienaruszony. Najpierw kapsułka VNO jest usuwana z myszy.
Następnie nabłonek nerwowy jest izolowany z torebki kostnej, naczynia krwionośnego i blaszki podstawnej. Tkankę umieszcza się w MEA dendrytyczną stroną z gałką do góry. Po zakończeniu tej konfiguracji używamy ramienia robota do podawania płynnych bodźców do tkanki.
Cześć, nazywam się Hannah Arnon i pracuję w laboratorium Tima Totala na Wydziale Anatomii i Neurobiologii w Washington University School of Medicine. Nazywam się Cheyenne Fu i również pochodzę ze Świętego Laboratorium. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę rejestracji narządu nosa w układzie wieloelektrodowym.
Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania właściwości czuciowych lub neuronów receptorowych w układzie pomocniczym. Więc zacznijmy. Zapisy elektryczne uzyskuje się za pomocą planarnego układu wieloelektrodowego lub MEA z płaskimi elektrodami z azotku tytanu o długości 10 mikrometrów izolowanymi azotkiem krzemu.
60 elektrod jest rozmieszczonych w dwóch polach składających się z siatki pięć na sześć z odstępami od środka do środka wynoszącymi 30 mikrometrów. Za pomocą wzmacniacza MEA 10 60 sygnały elektryczne są wzmacniane. Wymagane jest 1000 sygnałów krotnych przy 10 kilohercach.
Za pomocą karty akwizycji danych i niestandardowego oprogramowania do akwizycji danych, tkanka jest przytrzymywana na MEA przez nylonową siatkę, która jest przymocowana do niestandardowej wkładki, która ściśle przylega do wnętrza hodowli. Aby przybliżyć MEA, teraz, gdy widzieliśmy już pomiary, zobaczmy, jak przeprowadzić sekcję VNO. Przed wykonaniem sekcji należy dobrze napełnić MEA albuminą surowicy bydlęcej lub BSA, a następnie przepłukać MEA ciepłym roztworem dzwonka bąbelkowego i umieścić go na lodzie.
Aby przygotować się do sekcji, napełnij dwie szalki Petriego o wymiarach 60 na 15 milimetrów bąbelkowym roztworem dzwonka i umieść je na lodzie. Napełnij również dwie szalki Petriego pokryte osłoną progu tej samej wielkości roztworem pierścienia i umieść je na lodzie. Schłodź dodatkowe 50 mililitrów bąbelkowych dzwonków do użycia podczas sekcji.
Zacznij od ofiarowanej myszy, wykonując obustronne nacięcia od boku ust biegnące równolegle do linii szczęki do tyłu głowy. Połącz dwa nacięcia wzdłuż tyłu szyi i usuń grzbietową część głowy, pozostawiając dolną szczękę przymocowaną do myszy za pomocą cienkich nożyczek. Przeciąć między tkanką a po obu stronach górnej szczęki, aby oddzielić tkankę od kości.
Następnie użyj kleszczy numer trzy, aby oderwać tkankę podniebienia, odsłaniając jamę nosową za pomocą małych nożyczek lub skalpela przeciętego między i po obu stronach dwóch górnych przednich zębów, aby uwolnić wrażliwą torebkę nosową od kości za pomocą kleszczy numer trzy. Podnieś wrażliwą torebkę nosową za płaską kość i umieść ją na szalce Petriego na lodzie. Poprzednie kroki polegające na zanurzeniu VNO w schłodzonych dzwonkach powinny być wykonane w czasie krótszym niż trzy minuty.
Aby zapobiec śmierci tkanek, umieść naczynie pod mikroskopem stereoskopowym oświetlonym odbitym światłem. Użyj kleszczy numer trzy, aby usunąć kostną kapsułkę z jednego VNO na raz. Jedną ręką ustabilizuj torebkę kostną, chwytając ją od końca rozpieszczonego, a drugą ręką oderwij kość od VNO, uważając, aby nie uszkodzić VNO.
Po usunięciu kości przenieś v i o na pokrytą cygarem szalkę Petriego. Użyj pozostałego naczynia dla drugiego VNO. Przełącz oświetlenie na światło przechodzące za pomocą mikronożyczek.
Albo kleszcze numer pięć. Oddziel VNO od naczynia krwionośnego, przecinając wzdłuż krawędzi VNO. W tym momencie arkusz nerwowy będzie całkowicie oddzielony od naczynia krwionośnego.
Umieść VNO wewnętrzną stroną do góry za pomocą kleszczy numer trzy. Zakotwicz VO do osłony S w rogu tkanki za pomocą małego fragmentu maszynki do golenia pokrytej teflonem przytrzymującego zacisk. Oderwij nabłonek nerwowy od blaszki podstawnej, trzymając ostrze pod płytkim kątem mniejszym niż 30 stopni od powierzchni naczynia.
Działa najlepiej. Za pomocą szklanej pipety. Przenieś kawałek nabłonka nerwowego z naczynia do MEA, umieść VNO na górze pola elektrody stroną dendrytyczną do góry.
Usuń nadmiar roztworu dzwonka za pomocą pipety, a następnie umieść uchwyt na chusteczki siatkowe w dołku matrycy, aby utrzymać vno na miejscu. Napełnij studzienkę schłodzonym roztworem dzwonka z zakończoną sekcją. Zobaczmy, jak nagrać Aby rozpocząć sesję nagraniową, umieść MEA w MEA 10 60 amplifier i umieść sondę grzałki bezpośrednio nad tkanką, aby potwierdzić poprawność grzałki.
Umieszczenie sondy stymulować roztworem Ringera zawierającym 50 milimolowy potas przez dwie sekundy. Dostosuj położenie, aby zminimalizować opóźnienie odpowiedzi neuronalnej na roztwór potasu. Tkanka wymaga ciągłej superfuzji, którą uzyskuje się poprzez dostarczanie roztworu pierścienia z pompy HPLC.
Super połącz tkankę z podgrzanym roztworem dzwonka przez 45 minut do jednej godziny przed nagraniem, aby umożliwić tkance aklimatyzację. Bodźce są dostarczane za pomocą ramienia robotycznego Gilson two 15 liquid handler. Są one prezentowane poprzez wykonanie wstrzyknięć do zaworu HPLC i przełączanie między przepływem a pętlą Pod kontrolą oprogramowania Gilson ramię robota dostarcza bodźce do linii profuzji, przy jednoczesnym utrzymaniu stałego natężenia przepływu i ciśnienia.
Stan zaworu HPLC jest reprezentowany przez napięcie elektryczne, które jest rejestrowane przez komputer akwizycyjny jako dodatkowy kanał. Aby zapewnić synchronizację z aktywnością neuronalną, sygnały elektryczne są zapisywane na dysku za pomocą niestandardowego oprogramowania do nagrywania. Teraz pokażemy Ci kilka reprezentatywnych wyników układu wieloelektrodowego VNO. Nagranie.
Procedura ta pozwala uzyskać duże ilości danych ze względu na dużą liczbę elektrod, a preparat zwykle pozostaje stabilny przez około sześć godzin. Oto przykład 400 milisekund danych z jednej połowy MEA. Ta procedura jest przydatna do pomiaru odpowiedzi neuronów czuciowych na ligandy, pokazana tutaj jest odpowiedź na 100-krotnie rozcieńczony mocz samicy myszy zarejestrowany z jednej elektrody.
Mocz był oddawany przez 10 sekund, jak wskazywał czarny pasek. Zwróć uwagę, że wzrost odpalania po prezentacji bodźca. Właśnie pokazaliśmy, jak wykonać nagrania multi electro array na myszy VNO podczas wykonywania tej procedury.
Ważne jest, aby pamiętać o cierpliwości. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
To badanie przedstawia metodę rejestracji aktywności elektrycznej z nabłonka węchowego myszy przy użyciu wieloelektrodowych tablic (MEAs). Preparat polega na odizolowaniu nabłonka neurosensorycznego i stymulacji tkanki za pomocą ramienia robotycznego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Elektrofizjologia
- Neurobiologia
Tło
- Wieloelektrodowe tablice umożliwiają rejestrację dużych populacji neuronów.
- Nabłonek węchowy (VNO) odgrywa kluczową rolę w wykrywaniu feromonów.
- Zrozumienie aktywności elektrycznej w VNO może dostarczyć informacji na temat przetwarzania sensorycznego.
- Ramiona robotyczne mogą zwiększyć precyzję stosowania stymulacji podczas rejestracji.
Cel badania
- Aby zademonstrować metodę przygotowania do rejestracji MEA z mysiego VNO.
- Aby zbadać elektryczne odpowiedzi nabłonka węchowego.
- Aby zbadać wpływ stymulacji ciekłych na izolowaną tkankę.
Stosowane metody
- Usunięcie torebki VNO z myszy.
- Izolowanie nabłonka neurosensorycznego od otaczających struktur.
- Umieszczenie tkanki w MEA z boczną stroną główki dendrytu skierowaną do góry.
- Administracja stymulacji ciekłych za pomocą ramienia robotycznego.
Główne wyniki
- Skuteczna rejestracja aktywności elektrycznej z VNO.
- Wykazanie reaktywności tkanki na stymulację ciekłą.
- Zapewniliśmy niezawodną metodę badania aktywności neuronów sensorycznych.
- Podkreśliliśmy potencjał dalszych badań nad przetwarzaniem sensorycznym.
Wnioski
- Preparat MEA jest skuteczny w badaniu nabłonka węchowego myszy.
- Stymulację robotyczną można zwiększyć precyzję eksperymentu.
- Ta metoda otwiera drogi dla przyszłych badań w dziedzinie biologii sensorycznej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables high-throughput functional screening of chemosensory receptors in a native epithelial preparation, supporting target validation in olfactory and vomeronasal pathways. By combining multielectrode array recording with robotic stimulus delivery, it provides quantitative, reproducible measurements of neuronal responses to diverse ligands. This approach aids in de-risking early-stage discovery programs focused on pheromone detection, social behavior modulation, and related neuroactive compound screening.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of hundreds of vomeronasal receptor types in their native epithelial context.
- Operational Value: Supports ligand screening campaigns by correlating chemical stimulation with multi-neuronal electrophysiological responses.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Delivers simultaneous, spatially resolved electrophysiological readouts from 60 electrodes across the vomeronasal epithelium.
- Operational Value: Enables automated, timed stimulus delivery via robotic liquid handler for consistent dose-response profiling.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates exploration of sensory neuron response properties to endogenous cues such as urinary ligands.
- Operational Value: Maintains tissue viability for up to six hours, allowing extended screening windows and replicate testing.
Pipeline & Workflow Integration
This technique fits within early discovery workflows where functional validation of sensory receptors precedes lead identification and assay optimization.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of receptor-ligand interactions through direct measurement of neuronal activation patterns.
- Screening: Provides a platform for primary screening of compound libraries against native receptor populations.
- Analytics: Generates multiplexed electrophysiological data suitable for quantifying response amplitude, latency, and frequency across neuronal subsets.
- Translational Research: Supports mechanistic understanding of accessory olfactory system function relevant to behavioral modulation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable electrophysiology platform for chronic or repeated ligand screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target engagement by measuring native tissue responses to physiological stimuli.
- Operational Value: Standardizes tissue preparation and stimulation protocols to improve inter-experiment reproducibility.
- Strategic Value: Reduces biological uncertainty in early target selection by validating receptor function in a native epithelial model.
- Portfolio Impact: Enables data-driven prioritization of chemosensory targets based on functional response profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neuroepithelial dissection and multielectrode array handling.
- Dependent on access to planar MEA systems with compatible amplifiers and data acquisition tools.
- Necessitates integration of robotic liquid handling for precise stimulus control and timing.
- Demands environmental control (temperature, perfusion) to maintain tissue stability during recordings.
- Limited to ex vivo preparations; not applicable to in vivo or high-throughput microfluidic formats without adaptation.
