Name: Zabieg przeszczepu nabłonka sutka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Poznaj procedurę przeszczepu nabłonka sutka u myszy, obejmującą pobranie tkanki, oczyszczenie płata tłuszczowego i wszczepienie komórek. Ta metoda pozwala badać rozwój gruczołu mlekowego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Przygotowanie nabłonka do przeszczepu
Świeżą lub mrożoną tkankę nabłonkową dawcy można przeszczepić do oczyszczonej tkanki tłuszczowej, jednak wcześniejsze przygotowanie mrożonego nabłonka dawcy jest wygodniejsze, przy minimalnym spadku wydajności przeszczepu (&gt;85% wydajności). Protokół przygotowania mrożonego nabłonka dawcy jest następujący:
Przed przygotowaniem nabłonka dawcy do przeszczepu, należy przygotować medium do zamrażania nabłonka i rozdzielić około 1ml do krioprobówek. Medium to można przechowywać w temperaturze 4°C do 6 miesięcy do momentu użycia. Medium do zamrażania zawiera podłoże DMEM/F12 buforowane HEPES i NaHCO3, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) oraz 10% dimetylosulfotlenku (DMSO).
Pobierz nabłonek gruczołu mlekowego od niedawno uśmierconej samicy myszy.
<ol>
 <li>Przemyć mysz 70% EtOH.</li>
 <li>Wykonaj cięcie wzdłuż linii pośrodkowej w płaszczyźnie strzałkowej przez ścianę ciała, prowadząc je od spojenia łonowego do mostka, tak aby nie przebić błon surowiczych brzusznej jamy ciała. Wykonaj cięcie ukośne od początkowego nacięcia w okolicy spojenia łonowego w kierunku każdej z tylnych kończyn (Rysunek 1).</li>
 <li>Oddziel ścianę ciała od błon surowiczych, aby odsłonić 5th pachwinowy gruczoł mlekowy przytwierdzony do powięzi na wewnętrznej stronie ściany ciała. Najlepiej zrobić to, ostrożnie chwytając błony surowicze zakrzywioną częścią pęsety zakrzywionej, uważając, aby nie przebić brzusznej jamy ciała. Jednocześnie chwycić odciętą krawędź powłok skórnych pęsetą prostą z ząbkami i odsunąć ścianę ciała od błon surowiczych.</li>
 <li>Zidentyfikuj węzeł chłonny w obrębie gruczołu mlekowego. Węzeł chłonny znajduje się na przecięciu trzech głównych naczyń krwionośnych w gruczole mlekowym i jest wyczuwalny jako gęsty guzek w obrębie poduszki tłuszczowej (rycina 2). Za pomocą końcówki nożyczek okulistycznych odetnij tkankę tłuszczową otaczającą węzeł. Naciskając palcem wskazującym od strony naskórka skóry, unieś węzeł z poduszki tłuszczowej i chwyć go pęsetą zakrzywioną. Usuń węzeł chłonny.</li>
 <li> Trzymając brzegi skóry, chwyć tkankę tłuszczową gruczołu mlekowego zakrzywioną krawędzią zakrzywionej pęsety i stopniowo odrywaj tkankę tłuszczową od ściany ciała. Postępuj zgodnie z kierunkiem tkanki tłuszczowej w stronę powierzchni grzbietowej myszy, usuwając cały gruczoł mlekowy w jednym kawałku.</li>
 <li>Umieść gruczoł mlekowy na sterylnym plastikowym bloku do cięcia. Dodaj niewielką ilość pożywki, około 200 μl, na powierzchnię gruczołu, aby utrzymać jego wilgotność. Rozdrobnij gruczoł na kawałki o wielkości 1 mm za pomocą nowego ostrza do golenia. Podziel rozdrobniony gruczoł na cztery części i za pomocą pęsety rozdziel je pomiędzy cztery krioprobówki zawierające medium do mrożenia. Umieść krioprobówki w zamrażarce do komórek Nalgene „Mr. Frosty”, w której zewnętrznej komorze znajduje się 250 ml alkoholu izopropylowego. Umieść zamrażarkę Nalgene w -70°C zamrażarkę na 24 godziny. Zamrożone probówki z fragmentami gruczołu mlekowego należy przechowywać w ciekłym azocie do czasu ich wykorzystania w transplantacji. Każda krio-probówka będzie zawierać wystarczającą liczbę fragmentów gruczołu mlekowego do transplantacji do oczyszczonych poduszek tłuszczowych od 4 do 8 myszy biorców.</li>
</ol>
2. Przygotowanie komórek do transplantacji
W naszym laboratorium przeprowadzaliśmy transplantacje różnych typów komórek, w tym unieśmiertelnionych linii komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego, linii komórek nowotworowych gruczołu mlekowego lub pierwotnych komórek gruczołu mlekowego, do oczyszczonej poduszki tłuszczowej myszy. Protokół przygotowania komórek Comma-D do transplantacji przedstawia się następująco:
<ol>
 <li>Komórki Comma-D hoduje się w standardowym medium MECL składającym się z DMEM:F12 uzupełnionego o 2% surowicy bydlęcej dla dorosłych (ABS), mEGF, insulinę oraz antybiotyk/antybiotyk przeciwgrzybiczy (AB/AM).</li>
 <li>Komórki Comma-D zbiera się, gdy osiągną 85%-90% konfluencji.</li>
 <li>Zawiesinę komórkową wiruje się z prędkością 1200rpm przez 5 minut w celu utworzenia osadu komórkowego. Komórki resuspensuje się w świeżym medium MECL i dostosowuje ich stężenie do 5 x 106/ml.</li>
</ol>
W celu transplantacji pierwotnych komórek gruczołu mlekowego, pierwotne komórki nabłonka gruczołu mlekowego izoluje się z 5th par gruczołów mlekowych myszy poprzez dysocjację mechaniczną i enzymatyczną. Komórki resuspenduje się w pożywce DMEM:F12 i dostosowuje do pożądanego stężenia, zazwyczaj 5 x 106/ml.
3. Standardowa procedura oczyszczania tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego myszy
<ol>
 <li>Zanurz mysz gospodarza w wieku trzech tygodni w narkozie. Wybierz myszy o masie &lt;12 g, aby mieć pewność, że wzrost przewodów mlecznych nie został jeszcze zainicjowany. Stosujemy 200mg/kg masy ciała 2,2,2-tribromoetanolu. </li>
 <li>Po znieczuleniu myszy, unieruchom ją pewnie na stole chirurgicznym w pozycji brzusznej, z rozpostartymi kończynami, tak aby brzuch był napięty. Przed operacją podaj podskórnie leki przeciwbólowe: bupiwakainę (&lt;1mg/kg) lub buprenorfinę (0.05mg/kg).</li>
 <li>Chwyć skórę pęsetą kilka milimetrów powyżej miednicy i unieś ją od brzucha. Nacinając skórę nożyczkami, wykonaj cięcie w linii pośrodkowej wzdłuż sagi przez ścianę ciała, rozciągając je od łonka do mostka. Nie przebijaj błon surowiczych brzusznej jamy ciała. Nie wykonuj początkowego nacięcia zbyt blisko cewki moczowej, aby klipsy chirurgiczne nie utrudniały myszy oddawania moczu.</li>
 <li>Od miejsca początkowego nacięcia wykonaj ukośne cięcia skóry od linii środkowej przez miednicę w kierunku każdej z tylnych kończyn.</li>
 <li>Używając zakrzywionej części pęsety zakrzywionej, delikatnie chwyć błony surowicze. Użyj pęsety tkankowej, aby chwycić krawędź naciętej skóry i odsunąć ścianę ciała od błon surowiczych, odsłaniając 5tą gruczoł mlekowy pachwinowy znajdujący się na powięzi na spodniej stronie ściany ciała.</li>
 <li>Wypal elektrokoagulacyjnie suteczek, węzeł i dwie tętnice prowadzące do węzła (Rycina 2).</li>
 <li>Oddziel czwarty i piąty gruczoł. Wypal krawędź piątego gruczołu, aby zapobiec wrośnięciu tkanki z 6tego gruczołu.</li>
 <li>Podziel poduszeczkę tłuszczową czwartego gruczołu mlekowego, przecinając ją nożyczkami w poprzek, tuż brzusznie (od strony suteczka) od węzła. Użyj pęsety zakrzywionej, aby pewnie chwycić brzuszną część poduszeczki tłuszczowej i odsunąć ją od ściany ciała w jednym kawałku. Przyciśnij brzuszną część poduszeczki tłuszczowej między dwa szkiełka i umieść w szklanej kuwecie do barwienia histologicznego zawierającej utrwalacz Carnoy'a. Tkanka ta zostanie później utrwalona i zabarwiona roztworem karminu ałunowego w celu sprawdzenia czystości marginesów (Rycina 3). Oczyść powięź wokół obszaru usuniętej części poduszeczki tłuszczowej za pomocą pęsety zakrzywionej, aby usunąć wszelkie pozostałości gruczołu mlekowego. </li>
</ol>
4. Alternatywna „procedura oszczędzająca” usuwania tkanki tłuszczowej z poduszeczki tłuszczowej
Po opanowaniu standardowej procedury oczyszczania tkanki tłuszczowej poduśmielkowej myszy, można spróbować zastosować mniej inwazyjną procedurę oszczędzającą opracowaną przez Brill et al. (2008)2.
<ol>
 <li>Przygotować mysz zgodnie ze standardową procedurą.</li>
 <li>Chwycić sutek czwartej pachwinowej gruczołu mlekowego i wyciąć końcówką nożyczek okrąg o obwodzie 3-5 mm wokół sutka.</li>
 <li>Odciągnąć sutek od ciała, aby oddzielić wycięty fragment skóry, a następnie wyciągnąć czwarty pachwinowy gruczoł mlekowy przez otwór.</li>
 <li>Zidentyfikować węzeł. Użyć kauteryzatora, aby wypalić węzeł oraz 6th gruczoł mlekowy przez otwór.</li>
 <li>Wyciąć i oddzielić najbardziej powierzchowną część 5th gruczołu mlekowego bezpośrednio przed węzłem. Sutek, kolisty obszar skóry oraz część tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego zawierająca nabłonek zostają usunięte w jednym kawałku.</li>
</ol>
5. Transplantacja tkanek/komórek
<ol>
 <li>W przypadku przeszczepiania fragmentów nabłonka, rozmrozić krio probówkę z nabłonkiem i przenieść fragmenty nabłonka do szalki Petriego zawierającej świeże medium w celu rozcieńczenia DMSO. Końcówką nożyczek wykonać mały otwór lub kieszeń w oczyszczonej poduszce tłuszczowej dla nowego nabłonka. Za pomocą pęsety igłowej umieścić 1 mm fragment nabłonka dawcy w kieszeni. Podczas wycofywania pęsety igłowej, zamknąć kieszeń za pomocą pęsety tkankowej, aby tkanka pozostała na miejscu.</li>
 <li>W przypadku przeszczepiania komórek, wstrzyknąć 50 000 komórek w 10 μl medium do każdej poduszki tłuszczowej, używając strzykawki Hamiltona o pojemności 50 μl z igłą o rozmiarze 22g.</li>
</ol>
6. Uśpienie/wybudzenie myszy
<ol>
 <li>Przygotuj skórę do zamknięcia. Chwyć przeciwległe brzegi skóry, przytrzymaj je pęsetą, unieś je znad błon surowiczych brzusznej jamy ciała i zamknij za pomocą klipsów ranowych. Typowo, w standardowej procedurze, konieczne jest użycie dwóch klipsów do zamknięcia nacięcia w linii pośrodkowej oraz jednego klipsa dla każdego nacięcia ukośnego. Unikaj blokowania cewki moczowej. Może być konieczne zamknięcie przerw w skórze na przecięciu nacięć pośrodkowego i ukośnych za pomocą szwu. Procedura oszczędzająca wymaga użycia tylko jednego klipsa ranowego na każdą stronę.</li>
 <li>Umieść mysz w klatce i trzymaj klatkę pod lampą grzewczą, aż mysz dojdzie do siebie.</li>
 <li>Klipsy ranowe należy usunąć po 2 tygodniach.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig1.jpg" alt="Przewodnik po sekcji szczura, pokazujący ścieżki nacięć w linii środkowej i ukośnie, schemat anatomiczny." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Prezentacja schematu nacięć.
<img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2.jpg" alt="Schemat procedury gruczołu mlekowego; wycięcie gruczołu, kauteryzacja, proces usuwania nabłonka." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Lokalizacja węzła chłonnego, naczyń krwionośnych, sutka i nabłonka endogennego. Przeprowadzić kauteryzację w zaznaczonych miejscach.
<img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3.jpg" alt="Endogenna ekspresja genów; schemat; analiza mikroskopowa; anatomia komórkowa w próbce tkanki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Preparat całego organu wykazuje, że endogenne nabłonkowe ograniczone jest do obszaru wewnątrz koła, w związku z czym marginesy są „czyste”.
7. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig1_r.jpg" alt="Obraz mikroskopowy tkanki roślinnej, analiza struktury komórkowej dla badania botanicznego, szczegóły histologiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 4"> 
 Rysunek 4. Preparat całego usuniętego płata tłuszczowego od 3-tygodniowej myszy, wykazujący oczyszczone krawędzie.
<img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig2_r.jpg" alt="Obraz mikroskopowy komórki roślinnej przedstawiający ścianę komórkową i organelle do badania struktury komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
 Rysunek 5. Preparat całego organu od 10-tygodniowej myszy, przedstawiający poduszkę tłuszczową oczyszczoną z endogennego nabłonka gruczołu mlekowego.
<img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig3_r.jpg" alt="Przekrój histologiczny tkanki tłuszczowej; obraz mikroskopowy przedstawiający strukturę komórkową i zapasy lipidów." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 6"> 
 Rysunek 6. Przekrój podkładki tłuszczowej myszy w wieku 10 tygodni, barwiony hematoksyliną i eozyną.
<img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig4_r.jpg" alt="Obraz mikroskopowy naczyń włosowatych w tkance liścia, struktura naczyniowa, badanie biologiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 7"> 
 Rycina 7. Preparat całego organu od 10-tygodniowej myszy, przedstawiający prawidłowo rozwinięte drzewo przewodów mlecznych powstałe z przeszczepionego nabłonka.
<img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig5_r.jpg" alt="Histologia tkanki tłuszczowej i włókna mięśniowego pod mikroskopem; analiza struktury komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 8"> 
 Rycina 8. Przekrój przewodów mlecznych wykształconych z przeszczepionego nabłonka, barwiony hematoksyliną i eozyną.
<img src="/files/ftp_upload/1849/1849fig6_r.jpg" alt="Przekrój histologiczny tkanki, obraz mikroskopowy, analiza struktury komórkowej, badania patomorfologiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 9"> 
 Rysunek 9. Przekrój guza piersi rozwiniętego z przeszczepionego nabłonka, barwiony hematoksyliną i eozyną.

<ol><li>DeOme, K. B., Faulkin, L. J. Jr, Bern, H. A., Blair, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+mammary+tumors+from+hyperplastic+alveolar+nodules+transplanted+into+gland-free+mammary+fat+pads+of+female+C3H+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Development of mammary tumors from hyperplastic alveolar nodules transplanted into gland-free mammary fat pads of female C3H mice.</a> Cancer Res. 19, 515-520 (1959).</li>
<li>Brill, B., Boecher, N., Groner, B., Shemanko, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sparing+procedure+to+clear+the+mouse+mammary+fat+pad+of+epithelial+components+for+transplantation+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">A sparing procedure to clear the mouse mammary fat pad of epithelial components for transplantation analysis.</a> Laboratory Animals. 42, 104-110 (2008).</li>
<li>Jerry, D. J., Kittrell, F. S., Kuperwasser, C., Laucirica, R., Dickinson, E. S., Bonilla, P. J., Butel, J. S., Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammary-specific+model+demonstrates+the+role+of+the+p53+tumor+suppressor+gene+in+tumor+development%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">A mammary-specific model demonstrates the role of the p53 tumor suppressor gene in tumor development.</a> Oncogene. 19, 1052-1058 (2000).</li>
<li>Shackleton, M., Vaillant, F., Simpson, K. J., Stingl, J., Smyth, G. K., Asselin-Labat, M. -L., Wu, L., Lindman, G. J., Visvader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+functional+mammary+gland+from+a+single+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a functional mammary gland from a single stem cell.</a> Nature. 439, 84-88 (2006).</li>
<li>Stingl, J., Eirew, P., Ricketson, I., Shackleton, M., Vaillant, F., Choi, D., Li, H. I., Eaves, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439, 993-997 (2006).</li>
<li>Medina, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preneoplastic+Lesions+in+Murine+Mammary+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Preneoplastic Lesions in Murine Mammary Cancer.</a> Cancer Res. 36, 2589-2595 (1976).</li>
<li>Wagner, K. -U., Boulanger, C. A., Henry, S. gagias, Hennighausen, M., Smith, G. H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adjunct+mammary+epithelial+cell+population+in+parous+females%3A+its+role+in+functional+adaptation+and+tissue+renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An adjunct mammary epithelial cell population in parous females: its role in functional adaptation and tissue renewal.</a> Development. 129, 1377-1386 (2002).</li>
<li>Dunphy, K. A., Blackburn, A. C., Haoheng, Y., O Connell, L. R., Jerry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+and+progesterone+induce+persistent+increases+in+p53-dependent+apoptosis+and+suppress+mammary+tumors+in+BALB%2Fc-Trp53%2B%2F-+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Estrogen and progesterone induce persistent increases in p53-dependent apoptosis and suppress mammary tumors in BALB/c-Trp53+/- mice.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R43-R43 (2008).</li>
</ol>

W niniejszym raporcie przedstawiamy dwie alternatywne metody usuwania tkanki tłuszczowej z poduszki tłuszczowej gruczołu mlekowego myszy w ramach przygotowania do przeszczepów nabłonka gruczołu mlekowego. Procedura standardowa jest stosowana od czasu jej opracowania w 1959 roku przez DeOme et al.1 Choć jest bardziej inwazyjna, metoda standardowa jest preferowana w szkoleniu osób początkujących, ponieważ pozwala na łatwą obserwację struktury i orientacji gruczołu mlekowego. Jednak bardziej doświadczony...

procedura transplantacji nabłonka gruczołu mlekowego

Mammary Epithelial Transplant Procedure

W niniejszym artykule opisano i porównano procedurę usuwania nabłonka z poduszki tłuszczowej opracowaną przez DeOme KB et al.1 oraz procedurę oszczędzającą opracowaną przez Brill B et al.2, a następnie przedstawiono procedurę transplantacji nabłonka gruczołu mlekowego. Procedura transplantacji gruczołu mlekowego jest powszechnie stosowana przez biologów badających gruczoły mlekowe, ponieważ wykorzystuje fakt, że znaczny rozwój nabłonka gruczołu mlekowego nie następuje przed okresem dojrzewania. W 3. tygodniu życia wzrost drzewa nabłonkowego gruczołu mlekowego ogranicza się do okolicy sutka, a poduszka tłuszczowa jest w znacznym stopniu pozbawiona nabłonka gruczołu mlekowego, natomiast do 7. tygodnia życia drzewo przewodowe nabłonka rozprzestrzenia się na całą poduszkę tłuszczową. W związku z tym, jeśli ta niewielka część poduszki tłuszczowej zawierająca nabłonek, czyli obszar między sutkiem a węzłem chłonnym, zostanie usunięta w 3. tygodniu życia, nabłonek endogenny nigdy nie zasiedli poduszki tłuszczowej gruczołu mlekowego, a taką poduszkę określa się jako „oczyszczoną”. W tym czasie do oczyszczonej poduszki tłuszczowej można przeszczepić nabłonek gruczołu mlekowego z innego źródła, gdzie ma on potencjał do rozbudowy drzew przewodowych w całej poduszce tłuszczowej. Procedura ta była wykorzystywana w wielu modelach eksperymentalnych, w tym do badania fenotypu guza w transgenicznej tkance nabłonkowej gruczołu mlekowego bez zakłócającego wpływu genotypu na cały organizm3, do identyfikacji komórek macierzystych gruczołu mlekowego poprzez transplantację komórek w ograniczonym rozcieńczeniu4,5, określania, czy guzki hiperplastyczne przekształcają się w guzy gruczołu mlekowego6, oraz do oceny wpływu wcześniejszej ekspozycji hormonalnej na zachowanie nabłonka gruczołu mlekowego7,8.
Trzytygodniowe myszy biorcy są znieczulane, oczyszczane i unieruchamiane na stole operacyjnym. Wykonuje się nacięcie wzdłuż linii pośrodkowej w skórze, nie przechodząc przez otrzewną, rozciągające się od kości łonowej do mostka. Wykonuje się skośne nacięcia skóry od linii pośrodkowej przez miednicę w kierunku każdej z kończyn. Skórę odsuwa się od otrzewnej, aby odsłonić 4. gruczoł mlekowy pachwinowy. Poduszka tłuszczowa jest oczyszczana poprzez usunięcie tkanki tłuszczowej przedwęzłowej. Fragmenty nabłonka lub komórki nabłonkowe są przeszczepiane do pozostałej oczyszczonej poduszki tłuszczowej, a następnie ranę myszy zszywa się.

Niniejszy artykuł prezentuje procedurę opracowaną przez DeOme KB et al. (1959) oraz procedurę oszczędzającą opracowaną przez Brill B et al. (2008), służące do oczyszczania 4. podskórnej tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego w pachwinie u myszy w okresie dojrzewania, w celu przygotowania do transplantacji fragmentów gruczołu mlekowego, komórek nabłonkowych gruczołu mlekowego lub komórek nowotworowych gruczołu mlekowego.

Procedura transplantacji nabłonka gruczołu mlekowego

Niniejszy artykuł opisuje i porównuje procedurę usuwania poduszki tłuszczowej opracowaną przez DeOme KB i wsp.1 oraz procedurę oszczędzającą opracowaną przez Brill B i wsp.2, ...

W niniejszym filmie zaprezentowano procedury pozyskiwania nabłonka gruczołu mlekowego, usuwania tkanki tłuszczowej z okolic gruczołu oraz transplantacji egzogennego nabłonka w celu badania rozwoju gruczołu mlekowego u trzytygodniowych myszy. W tym stadium wzrost drzewa nabłonkowego ograniczony jest do okolic sutka, a tkanka tłuszczowa jest w przeważającej mierze pozbawiona nabłonka gruczołu mlekowego. Wraz z dojrzewaniem myszy drzewo nabłonkowe przerasta tkankę tłuszczową.Do siódmego tygodnia życia nabłonkowe drzewo przewodowe rozprzestrzenia się w całej tkance tłuszczowej. Jeśli w trzecim tygodniu życia usunie się niewielką część tkanki tłuszczowej zawierającą nabłonek, endogenny nabłonek nigdy nie zasiedli pustej tkanki tłuszczowej, która zostanie wówczas opisana jako oczyszczona i pozostanie w tym stanie do osiągnięcia dojrzałości. Przeszczepiony donorowy nabłonek lub komórki nabłonkowe mają jednak potencjał do rozbudowy drzew przewodowych w całej oczyszczonej tkance tłuszczowej biorcy.Poduszka tłuszczowa. Histologia może być następnie wykorzystana do monitorowania postępu rozwoju pamięci w tkankach przeszczepionych od zwierząt transgenicznych lub testowych. Dzień dobry, nazywam się Joseph Jerry i pracuję w Departamencie Nauk Weterynaryjnych i Zootechnicznych na Uniwersytecie Massachusetts.Witam, nazywam się Karen Dunphy. Pracuję w laboratorium Jerry'ego. Dzisiaj przeprowadzimy transplantację nabłonka gruczołu mlekowego.Niniejszą procedurę stosujemy do badania molekularnych i komórkowych podstaw genezy guzów nabłonka mlecznego oraz jako model raka piersi. Przejdźmy zatem do działania. Pierwszym krokiem procedury transplantacji jest pobranie tkanki nabłonka mlecznego od myszy dawcy.Zacznij od przemycia niedawno uśmierconej myszy żeńskiej 70% ethanolem, uważając, aby nie przebić błon SRU w brzusznej jamie ciała. Wykonaj cięcie pośrodkowe wzdłuż skóry, rozciągając je od łóneczka do mostka. Następnie wykonaj cięcie skośne od początkowego nacięcia przy łóneczku w kierunku każdej z tylnych kończyn.Za pomocą pęsety zakrzywionej chwyć błony SRU. Następnie, używając pęsety prostej z ząbkami, chwyć cięty brzeg skóry i ostrożnie oddziel ścianę ciała od błon S cs.Aby odsłonić czwarty gruczoł pamięci pachwinowy przymocowany do dolnej strony ściany ciała, należy zlokalizować węzeł chłonny w obrębie gruczołu pamięci; znajduje się on na przecięciu trzech wyraźnych naczyń krwionośnych w tym gruczole i jest wyczuwalny jako gęsty guzek w poduszce tłuszczowej. Za pomocą końcówki nożyczek okularowych należy naciąć tkankę tłuszczową otaczającą węzeł chłonny. Następnie, opierając palec wskazujący o stronę naskórkową skóry, należy wywrzeć nacisk, aby unieść węzeł z poduszki tłuszczowej i go oddzielić.Za pomocą zakrzywionej pęsety usuń węzeł chłonny. Trzymając brzegi skóry, chwyć zakrzywioną krawędzią zakrzywionej pęsety podskórną tkankę tłuszczową i stopniowo oddziel ją od ściany ciała. Kierując się wzdłuż tkanki tłuszczowej w stronę grzbietowej powierzchni myszy, usuń cały gruczoł mlekowy w jednym kawałku.Umieścić gruczoł pamięci na sterylnym plastikowym bloku do cięcia, dodając niewielką ilość pożywki, około 200 µl na powierzchnię gruczołu, aby utrzymać jego wilgotność. Następnie posiekać gruczoł na kawałki o wielkości 1 mm za pomocą świeżej żyletki. Posiekaną tkankę gruczołu podzielić na cztery porcje.Następnie za pomocą pęsety rozdzielić materiał do czterech probówek kriogenicznych z medium do mrożenia. Umieścić probówki w zamrażarce do komórek Nalgene, w której zewnętrzna komora zawiera 250 milliliters alkoholu izopropylowego. Następnie zamrażarkę do komórek umieścić w temperaturze minus 70 degrees Celsius na 24 godziny.Po 24 godzinach przenieść zamrożone probówki z fragmentami pamięci do ciekłego azotu do czasu rozpoczęcia transplantacji. Każda probówka kriogeniczna zawiera wystarczającą ilość fragmentów gruczołu pamięci, aby przeszczepić je do oczyszczonych poduszek tłuszczowych od czterech do ośmiu myszy biorców. Po zweryfikowaniu głębokości znieczulenia u trzytygodniowej myszy biorcy poprzez uciśnięcie palca u stopy, mocno unieruchomić mysz brzuchem do góry z wyciągniętymi kończynami na stole chirurgicznym w taki sposób, aby brzuch był napięty.Należy podać przeciwbólowy lek przedoperacyjny, bupiwakainę lub buprenorfinę, drogą podskórną. Pole operacyjne należy zdezynfekować alkoholem oraz środkiem myjącym na bazie jodu przy użyciu pęsety. Chwyć skórę kilka milimetrów powyżej miednicy i unieś ją od strony brzucha.Ostrożnie naciąć skórę, upewniając się, że początkiecie cięcie nie znajduje się zbyt blisko cewki moczowej, gdzie umieszczenie klipsów do ran mogłoby utrudnić myszy oddawanie moczu. Następnie, uważając, aby nie przebić błon SRU, wykonać cięcie wzdłuż linii pośrodkowej skóry, rozciągając je od łonka do mostka.Następnie, zaczynając od początkowego nacięcia, wykonaj skośne cięcia skóry od linii pośrodkowej przez miednicę w kierunku każdej z tylnych kończyn. Za pomocą zakrzywionych pęset delikatnie chwyć błony S ceros brzusznej ściany ciała. Następnie użyj pęsety anatomicznej, aby chwycić przecięty brzeg skóry i odsunąć ścianę ciała od błon ceros.Aby odsłonić czwarty pachwinowy gruczoł pamięci, należy zidentyfikować czwarty gruczoł pamięci. Następnie należy zidentyfikować piąty gruczoł pamięci, a potem wypalić węzeł sutkowy oraz dwie tętnice prowadzące do węzła. Należy rozdzielić czwarty i piąty gruczoł, a następnie wypalić brzeg piątego gruczołu.Następnie, używając nożyczek, należy przeciąć poduszeczkę tłuszczową tuż brzusznie od węzła, aby oddzielić poduszeczkę tłuszczową czwartego gruczołu pamięciowego. Za pomocą zakrzywionych pęsety należy mocno chwycić brzuszną część poduszeczki tłuszczowej i odsunąć ją od ściany ciała. Zaleca się, aby wyciętą tkankę docisnąć w całości pomiędzy dwa opisane szkiełka i utrwalić w fiksatywie Carnoy.Następnie tkankę można zabarwić, osadzić na szkiełku i ocenić pod kątem czystości marginesów. Za pomocą pęsety usuń wszystkie pozostałości gruczołu pamięci wokół obszaru usuniętej części poduszeczki tłuszczowej. Zwierzę jest teraz gotowe do transplantacji tkanek lub komórek.Świeżą lub błyskawicznie zamrożoną tkankę nabłonkową donora można przeszczepić do oczyszczonej tkanki tłuszczowej. Alternatywnie można przeszczepić unieśmiertelnione linie komórkowe nabłonka, linie komórkowe nowotworów lub komórki pierwotne. Szczegóły dotyczące przygotowania komórek znajdują się w towarzyszącym protokole pisemnym dotyczącym transplantacji fragmentów nabłonka.Przygotowano.Film rozpoczyna się od rozmrożenia krioprobówki z nabłonkiem i przeniesienia fragmentów do szalki Petriego zawierającej świeże medium. Aby rozcieńczyć DMSO, należy za pomocą nożyczek wykonać kieszonkę w oczyszczonym nabłonku poduszki tłuszczowej myszy biorcy. Następnie, używając pęsety igłowej, należy umieścić jednอมilimetrowy fragment nabłonka dawcy wewnątrz kieszonki.W razie potrzeby zamknąć kieszeń za pomocą pęsety tkankowej i wycofać pęsetę do igieł, aby tkanka pozostała na miejscu. Chwycić przeciwległe brzegi skóry. Przytrzymać je razem za pomocą pęsety.Odsuń je od błon otrzewnej brzusznej jamy ciała i zamknij za pomocą klipsów chirurgicznych. Użyj dwóch klipsów do zamknięcia nacięcia w linii pośrodkowej oraz jednego klipsa dla każdego nacięcia skośnego. W razie potrzeby unikaj blokowania cewki moczowej.Zamknąć luki w skórze na przecięciu nacięć pośrodkowego strzałkowego i skośnego za pomocą szwu. Umieścić mysz w klatce i trzymać klatkę pod lampą grzewczą do czasu odzyskania przez mysz przytomności. Klamry ran należy usunąć po dwóch tygodniach.Na następnych slajdach przedstawiono reprezentatywne obrazy tego, czego można spodziewać się w gruczole pamięci gospodarza po oczyszczeniu poduszki karmiącej i przeszczepieniu nabłonka; ten obraz przedstawia endogenny nabłonek pamięci usunięty z trzytygodniowej myszy. W procedurze oczyszczania gruczołu należy zwrócić uwagę na czyste marginesy przy krawędzi cięcia. Po każdej procedurze należy przygotować preparat całego organu, taki jak ten, aby ocenić czystość marginesów.Na tym obrazie przedstawiono oczyszczoną tkankę tłuszczową myszy siedem tygodni po procedurze oczyszczania. Należy zauważyć, że cała tkanka tłuszczowa jest pozbawiona nabłonka, hematyny i acynów. Barwienie oczyszczonej tkanki tłuszczowej siedem tygodni po procedurze oczyszczania wykazuje również, że gruczoł jest pozbawiony nabłonka.Przedstawiono reprezentatywny preparat całego organu przejrzystej poduszki tłuszczowej z przeszczepionym nabłonkiem pamięci od 10-tygodniowej myszy. Należy zwrócić uwagę, że przeszczepiony nabłonek wytworzył prawidłowe drzewa przewodowe nabłonka, hematynę i acynusy. Barwienie przejrzystej poduszki tłuszczowej i pamięci.Przeszczep nabłonkowy w tym samym wieku wykazuje prawidłową produkcję przewodów nabłonkowych z nabłonka egzogennego. Tutaj, barwienie hematoksyliną i eozyną oczyszczonej poduszki tłuszczowej pokazuje przeszczep nabłonkowy, który rozwinął się w guz gruczołu mlekowego. Przedstawiliśmy właśnie sposób pobierania nabłonka gruczołu mlekowego oraz przeprowadzania przeszczepu nabłonka gruczołu mlekowego.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przerwać połączenia między czwartym a piątym gruczołem w celu wypalenia węzła i sutka oraz usunąć wszelkie ślady nabłonka endogennego. Należy upewnić się, że nie ma możliwości wrośnięcia nabłonka endogennego w oczyszczoną poduszkę tłuszczową. Dodatkowo zaleca się pobranie całej usuniętej części gruczołu mlekowego w celu sprawdzenia, czy marginesy są wolne od zmian.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przeszczep nabłonka sutkowego

W niniejszym raporcie prezentujemy system izolacji i hodowli komórek donora z gruczołu mlekowego myszy oraz ich ortotopowego przeszczepienia do myszy biorców w celu analizy interakcji zrąb-nabłonek podczas rozwoju guza piersi.

Przeszczepienie komórek zrębowych i komórek raka do gruczołu mlekowego u myszy C57BL/6J

Obrazowanie poklatkowe służy do oceny zachowania pierwotnych komórek nabłonka sutka preneoplastycznego pochodzących z genetycznie modyfikowanych mysich modeli ryzyka raka piersi w celu określenia, czy istnieją korelacje między określonymi parametrami behawioralnymi a odrębnymi zmianami genetycznymi.

Obrazowanie poklatkowe pierwotnych przednowotworowych komórek nabłonka sutka pochodzących z genetycznie zmodyfikowanych mysich modeli raka piersi

Brakuje modeli przedklinicznych oceniających terapię adjuwantową ukierunkowaną na przerzuty raka piersi. Aby temu zaradzić, opracowaliśmy mysi model przerzutów de novo gruczolakoraka sutka do płuc, w którym terapie stosowane w trybie adjuwantowym (pooperacyjna resekcja guzów pierwotnych) mogą być oceniane pod kątem skuteczności w oddziaływaniu na wcześniej zasiane przerzuty do płuc.

Procedury chirurgiczne i metodyka przedklinicznego mysiego modelu przerzutów raka sutka de novo

Ten protokół opisuje metody oczyszczania, ilościowego i charakteryzowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV)/egzosomów z nieprzylegających/mezenchymalnych komórek nabłonka sutka oraz ich wykorzystania do transferu zdolności tworzenia gruczołów sutkowych do komórek nabłonka sutka świetlnego. EV / egzosomy pochodzące z komórek nabłonka sutka podobnych do łodyg mogą przenosić tę właściwość komórek do komórek, które spożywają EV / egzosomy.

Przenoszenie zdolności tworzenia gruczołu sutkowego między komórkami podstawnego nabłonka sutka a komórkami luminalnymi sutka za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów

Ta praca demonstruje nowatorskie podejście do oceny proliferacji, różnicowania i potencjału tworzenia naczyń krwionośnych komórek macierzystych śródbłonka (VESCs) poprzez przeszczep poduszeczki tłuszczowej sutka, a następnie przygotowanie całej tkanki do obserwacji mikroskopowej. Przedstawiono również strategię śledzenia linii w celu zbadania zachowania VESC in vivo.

Nowatorska technika przeszczepu poduszeczki tłuszczowej sutka w celu wizualizacji wytwarzania naczyń krwionośnych śródbłonka

Celem tego protokołu jest opisanie nowego podejścia do modelowania raka piersi opartego na doprzewodowym wstrzykiwaniu adenowirusa z ekspresją Cre do mysich gruczołów sutkowych. Takie podejście pozwala na manipulowanie zdarzeniami onkogennymi zarówno w zależności od typu komórki, jak i narządu, w sposób kontrolowany czasowo.

Modelowanie raka piersi poprzez doprzewodowe wstrzyknięcie adenowirusa z ekspresją Cre do mysiego gruczołu sutkowego

Ten artykuł opisuje metodę przeszczepiania komórek nabłonka sutka szczura dawcy do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami u zwierząt biorców. Metoda ta może być stosowana do badania wpływu gospodarza i/lub dawcy na rozwój nabłonka sutka i eliminuje potrzebę wstępnego oczyszczania, zwiększając w ten sposób przydatność tej techniki.

Przeszczep komórek nabłonkowych sutka szczura do białej poduszeczki tłuszczowej między łopatkami

Modele ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów (PDX) oraz genetycznie modyfikowane modele myszy do przeszczepu wiernie odwzorowują ludzką chorobę i są preferowanymi modelami do podstawowych i translacyjnych badań nad rakiem piersi. W tym miejscu opisano metodę ortotopowego przeszczepiania fragmentów guza piersi do poduszeczki tłuszczowej sutka w celu zbadania biologii guza i oceny odpowiedzi na lek.

Ortotopowe przeszczepy guzów piersi jako modele przedkliniczne raka piersi

Opisana tutaj metoda obrazowania intravital wykorzystuje generowanie drugiej harmonii kolagenu i endogenną fluorescencję z metabolicznego kofaktora NAD(P)H do nieinwazyjnej segmentacji nieoznaczonego mikrośrodowiska guza na przedziały guza, zrębu i naczyń krwionośnych w celu dogłębnej analizy obrazów 4D intravital.

Bezznacznikowe podejście do segmentacji w obrazowaniu przyżyciowym mikrośrodowiska guza sutka

Tutaj prezentujemy szczegółowe procedury chirurgiczne endoskopowej obustronnej mastektomii oszczędzającej brodawki sutkowe poprzez pojedyncze nacięcie pachowe z natychmiastową rekonstrukcją piersi na implantach przedpiersiowych. Procedura ta jest bezpieczną i opłacalną metodą dla pacjentek z rakiem piersi.

Endoskopowa obustronna mastektomia oszczędzająca brodawki sutkowe przez pojedyncze nacięcie pachowe z natychmiastową rekonstrukcją piersi opartą na implantach przedpiersiowych

Obecne badanie przedstawia łatwiejszy, oszczędzający czas i ekonomiczny protokół efektywnego izolowania i hodowania pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka (HMEC) z małych ilości tkanki sutka. Protokół ten jest odpowiedni do szybkiego wytwarzania pierwotnych HMEC zarówno do zastosowań laboratoryjnych, jak i klinicznych.

Izolacja i hodowla pierwotnych ludzkich komórek nabłonka sutka

Poznaj procedurę przeszczepu nabłonka sutka u myszy, obejmującą pobranie tkanki, oczyszczenie płata tłuszczowego i wszczepienie komórek. Ta metoda pozwala badać rozwój gruczołu mlekowego.

Procedura transplantacji nabłonka gruczołu mlekowego

Przeglądaj więcej filmów