Procedura transplantacji nabłonka gruczołu mlekowego

W niniejszym filmie zaprezentowano procedury pozyskiwania nabłonka gruczołu mlekowego, usuwania tkanki tłuszczowej z okolic gruczołu oraz transplantacji egzogennego nabłonka w celu badania rozwoju gruczołu mlekowego u trzytygodniowych myszy. W tym stadium wzrost drzewa nabłonkowego ograniczony jest do okolic sutka, a tkanka tłuszczowa jest w przeważającej mierze pozbawiona nabłonka gruczołu mlekowego. Wraz z dojrzewaniem myszy drzewo nabłonkowe przerasta tkankę tłuszczową.

Do siódmego tygodnia życia nabłonkowe drzewo przewodowe rozprzestrzenia się w całej tkance tłuszczowej. Jeśli w trzecim tygodniu życia usunie się niewielką część tkanki tłuszczowej zawierającą nabłonek, endogenny nabłonek nigdy nie zasiedli pustej tkanki tłuszczowej, która zostanie wówczas opisana jako oczyszczona i pozostanie w tym stanie do osiągnięcia dojrzałości. Przeszczepiony donorowy nabłonek lub komórki nabłonkowe mają jednak potencjał do rozbudowy drzew przewodowych w całej oczyszczonej tkance tłuszczowej biorcy.

Poduszka tłuszczowa. Histologia może być następnie wykorzystana do monitorowania postępu rozwoju pamięci w tkankach przeszczepionych od zwierząt transgenicznych lub testowych. Dzień dobry, nazywam się Joseph Jerry i pracuję w Departamencie Nauk Weterynaryjnych i Zootechnicznych na Uniwersytecie Massachusetts.

Witam, nazywam się Karen Dunphy. Pracuję w laboratorium Jerry'ego. Dzisiaj przeprowadzimy transplantację nabłonka gruczołu mlekowego.

Niniejszą procedurę stosujemy do badania molekularnych i komórkowych podstaw genezy guzów nabłonka mlecznego oraz jako model raka piersi. Przejdźmy zatem do działania. Pierwszym krokiem procedury transplantacji jest pobranie tkanki nabłonka mlecznego od myszy dawcy.

Zacznij od przemycia niedawno uśmierconej myszy żeńskiej 70% ethanolem, uważając, aby nie przebić błon SRU w brzusznej jamie ciała. Wykonaj cięcie pośrodkowe wzdłuż skóry, rozciągając je od łóneczka do mostka. Następnie wykonaj cięcie skośne od początkowego nacięcia przy łóneczku w kierunku każdej z tylnych kończyn.

Za pomocą pęsety zakrzywionej chwyć błony SRU. Następnie, używając pęsety prostej z ząbkami, chwyć cięty brzeg skóry i ostrożnie oddziel ścianę ciała od błon S cs.

Aby odsłonić czwarty gruczoł pamięci pachwinowy przymocowany do dolnej strony ściany ciała, należy zlokalizować węzeł chłonny w obrębie gruczołu pamięci; znajduje się on na przecięciu trzech wyraźnych naczyń krwionośnych w tym gruczole i jest wyczuwalny jako gęsty guzek w poduszce tłuszczowej. Za pomocą końcówki nożyczek okularowych należy naciąć tkankę tłuszczową otaczającą węzeł chłonny. Następnie, opierając palec wskazujący o stronę naskórkową skóry, należy wywrzeć nacisk, aby unieść węzeł z poduszki tłuszczowej i go oddzielić.

Za pomocą zakrzywionej pęsety usuń węzeł chłonny. Trzymając brzegi skóry, chwyć zakrzywioną krawędzią zakrzywionej pęsety podskórną tkankę tłuszczową i stopniowo oddziel ją od ściany ciała. Kierując się wzdłuż tkanki tłuszczowej w stronę grzbietowej powierzchni myszy, usuń cały gruczoł mlekowy w jednym kawałku.

Umieścić gruczoł pamięci na sterylnym plastikowym bloku do cięcia, dodając niewielką ilość pożywki, około 200 µl na powierzchnię gruczołu, aby utrzymać jego wilgotność. Następnie posiekać gruczoł na kawałki o wielkości 1 mm za pomocą świeżej żyletki. Posiekaną tkankę gruczołu podzielić na cztery porcje.

Następnie za pomocą pęsety rozdzielić materiał do czterech probówek kriogenicznych z medium do mrożenia. Umieścić probówki w zamrażarce do komórek Nalgene, w której zewnętrzna komora zawiera 250 milliliters alkoholu izopropylowego. Następnie zamrażarkę do komórek umieścić w temperaturze minus 70 degrees Celsius na 24 godziny.

Po 24 godzinach przenieść zamrożone probówki z fragmentami pamięci do ciekłego azotu do czasu rozpoczęcia transplantacji. Każda probówka kriogeniczna zawiera wystarczającą ilość fragmentów gruczołu pamięci, aby przeszczepić je do oczyszczonych poduszek tłuszczowych od czterech do ośmiu myszy biorców. Po zweryfikowaniu głębokości znieczulenia u trzytygodniowej myszy biorcy poprzez uciśnięcie palca u stopy, mocno unieruchomić mysz brzuchem do góry z wyciągniętymi kończynami na stole chirurgicznym w taki sposób, aby brzuch był napięty.

Należy podać przeciwbólowy lek przedoperacyjny, bupiwakainę lub buprenorfinę, drogą podskórną. Pole operacyjne należy zdezynfekować alkoholem oraz środkiem myjącym na bazie jodu przy użyciu pęsety. Chwyć skórę kilka milimetrów powyżej miednicy i unieś ją od strony brzucha.

Ostrożnie naciąć skórę, upewniając się, że początkiecie cięcie nie znajduje się zbyt blisko cewki moczowej, gdzie umieszczenie klipsów do ran mogłoby utrudnić myszy oddawanie moczu. Następnie, uważając, aby nie przebić błon SRU, wykonać cięcie wzdłuż linii pośrodkowej skóry, rozciągając je od łonka do mostka.

Następnie, zaczynając od początkowego nacięcia, wykonaj skośne cięcia skóry od linii pośrodkowej przez miednicę w kierunku każdej z tylnych kończyn. Za pomocą zakrzywionych pęset delikatnie chwyć błony S ceros brzusznej ściany ciała. Następnie użyj pęsety anatomicznej, aby chwycić przecięty brzeg skóry i odsunąć ścianę ciała od błon ceros.

Aby odsłonić czwarty pachwinowy gruczoł pamięci, należy zidentyfikować czwarty gruczoł pamięci. Następnie należy zidentyfikować piąty gruczoł pamięci, a potem wypalić węzeł sutkowy oraz dwie tętnice prowadzące do węzła. Należy rozdzielić czwarty i piąty gruczoł, a następnie wypalić brzeg piątego gruczołu.

Następnie, używając nożyczek, należy przeciąć poduszeczkę tłuszczową tuż brzusznie od węzła, aby oddzielić poduszeczkę tłuszczową czwartego gruczołu pamięciowego. Za pomocą zakrzywionych pęsety należy mocno chwycić brzuszną część poduszeczki tłuszczowej i odsunąć ją od ściany ciała. Zaleca się, aby wyciętą tkankę docisnąć w całości pomiędzy dwa opisane szkiełka i utrwalić w fiksatywie Carnoy.

Następnie tkankę można zabarwić, osadzić na szkiełku i ocenić pod kątem czystości marginesów. Za pomocą pęsety usuń wszystkie pozostałości gruczołu pamięci wokół obszaru usuniętej części poduszeczki tłuszczowej. Zwierzę jest teraz gotowe do transplantacji tkanek lub komórek.

Świeżą lub błyskawicznie zamrożoną tkankę nabłonkową donora można przeszczepić do oczyszczonej tkanki tłuszczowej. Alternatywnie można przeszczepić unieśmiertelnione linie komórkowe nabłonka, linie komórkowe nowotworów lub komórki pierwotne. Szczegóły dotyczące przygotowania komórek znajdują się w towarzyszącym protokole pisemnym dotyczącym transplantacji fragmentów nabłonka.Przygotowano.

Film rozpoczyna się od rozmrożenia krioprobówki z nabłonkiem i przeniesienia fragmentów do szalki Petriego zawierającej świeże medium. Aby rozcieńczyć DMSO, należy za pomocą nożyczek wykonać kieszonkę w oczyszczonym nabłonku poduszki tłuszczowej myszy biorcy. Następnie, używając pęsety igłowej, należy umieścić jednอมilimetrowy fragment nabłonka dawcy wewnątrz kieszonki.

W razie potrzeby zamknąć kieszeń za pomocą pęsety tkankowej i wycofać pęsetę do igieł, aby tkanka pozostała na miejscu. Chwycić przeciwległe brzegi skóry. Przytrzymać je razem za pomocą pęsety.

Odsuń je od błon otrzewnej brzusznej jamy ciała i zamknij za pomocą klipsów chirurgicznych. Użyj dwóch klipsów do zamknięcia nacięcia w linii pośrodkowej oraz jednego klipsa dla każdego nacięcia skośnego. W razie potrzeby unikaj blokowania cewki moczowej.

Zamknąć luki w skórze na przecięciu nacięć pośrodkowego strzałkowego i skośnego za pomocą szwu. Umieścić mysz w klatce i trzymać klatkę pod lampą grzewczą do czasu odzyskania przez mysz przytomności. Klamry ran należy usunąć po dwóch tygodniach.

Na następnych slajdach przedstawiono reprezentatywne obrazy tego, czego można spodziewać się w gruczole pamięci gospodarza po oczyszczeniu poduszki karmiącej i przeszczepieniu nabłonka; ten obraz przedstawia endogenny nabłonek pamięci usunięty z trzytygodniowej myszy. W procedurze oczyszczania gruczołu należy zwrócić uwagę na czyste marginesy przy krawędzi cięcia. Po każdej procedurze należy przygotować preparat całego organu, taki jak ten, aby ocenić czystość marginesów.

Na tym obrazie przedstawiono oczyszczoną tkankę tłuszczową myszy siedem tygodni po procedurze oczyszczania. Należy zauważyć, że cała tkanka tłuszczowa jest pozbawiona nabłonka, hematyny i acynów. Barwienie oczyszczonej tkanki tłuszczowej siedem tygodni po procedurze oczyszczania wykazuje również, że gruczoł jest pozbawiony nabłonka.

Przedstawiono reprezentatywny preparat całego organu przejrzystej poduszki tłuszczowej z przeszczepionym nabłonkiem pamięci od 10-tygodniowej myszy. Należy zwrócić uwagę, że przeszczepiony nabłonek wytworzył prawidłowe drzewa przewodowe nabłonka, hematynę i acynusy. Barwienie przejrzystej poduszki tłuszczowej i pamięci.

Przeszczep nabłonkowy w tym samym wieku wykazuje prawidłową produkcję przewodów nabłonkowych z nabłonka egzogennego. Tutaj, barwienie hematoksyliną i eozyną oczyszczonej poduszki tłuszczowej pokazuje przeszczep nabłonkowy, który rozwinął się w guz gruczołu mlekowego. Przedstawiliśmy właśnie sposób pobierania nabłonka gruczołu mlekowego oraz przeprowadzania przeszczepu nabłonka gruczołu mlekowego.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przerwać połączenia między czwartym a piątym gruczołem w celu wypalenia węzła i sutka oraz usunąć wszelkie ślady nabłonka endogennego. Należy upewnić się, że nie ma możliwości wrośnięcia nabłonka endogennego w oczyszczoną poduszkę tłuszczową. Dodatkowo zaleca się pobranie całej usuniętej części gruczołu mlekowego w celu sprawdzenia, czy marginesy są wolne od zmian.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.