Procedura transplantacji nabłonka gruczołu mlekowego

W niniejszym filmie zaprezentowano procedury pozyskiwania nabłonka gruczołu mlekowego, usuwania tkanki tłuszczowej z okolic gruczołu oraz transplantacji egzogennego nabłonka w celu badania rozwoju gruczołu mlekowego u trzytygodniowych myszy. Wzrost drzewa nabłonkowego gruczołu mlekowego jest ograniczony do bezpośredniego sąsiedztwa sutka, a tkanka tłuszczowa jest w przeważającej mierze pozbawiona nabłonka gruczołu mlekowego. W miarę dojrzewania myszy drzewo nabłonkowe rozrasta się przez tkankę tłuszczową.

Do siódmego tygodnia życia nabłonkowe drzewo przewodowe rozprzestrzenia się w całej tkance tłuszczowej. Jeśli w trzecim tygodniu życia usunie się niewielką część tkanki tłuszczowej zawierającą nabłonek, endogenny nabłonek nigdy nie zasiedli pamięciowej tkanki tłuszczowej, która zostanie wówczas określona jako oczyszczona i pozostanie w tym stanie do osiągnięcia dojrzałości. Przeszczepiona pamięciowa tkanka tłuszczowa, nabłonek lub komórki nabłonkowe mają jednak potencjał do rozbudowy pamięciowych drzew przewodowych w całym oczyszczonym organizmie biorcy.

Poduszka tłuszczowa. Histologia może być następnie wykorzystana do monitorowania postępów w rozwoju pamięci w tkankach przeszczepionych od zwierząt transgenicznych lub testowych. Witam, nazywam się Joseph Jerry i pracuję w Departamencie Nauk Weterynaryjnych i Zootechnicznych na Uniwersytecie Massachusetts.

Witajcie, nazywam się Karen Dunphy. Pracuję w laboratorium Jerry'ego. Dzisiaj przeprowadzimy transplantację nabłonka gruczołu mlekowego.

Stosujemy tę procedurę do badania molekularnych i komórkowych podstaw powstawania guzów nabłonka mlecznego oraz w celu stworzenia modelu raka piersi. Przejdźmy zatem do realizacji. Pierwszym krokiem procedury transplantacji jest pobranie tkanki nabłonka mlecznego od myszy dawcy.

Zacznij od opłukania niedawno uśmierconej myszy żeńskiej 70% etanolem, uważając, aby nie przebić błon SRU w brzusznej jamie ciała. Wykonaj cięcie wzdłuż linii pośrodkowej skóry, rozciągając je od łonka do mostka. Następnie wykonaj cięcie ukośne od początkowego nacięcia przy łonku w kierunku każdej z tylnych kończyn.

Za pomocą pęsety zakrzywionej chwyć błony SRU. Następnie, używając prostej pęsety z ząbkami, chwyć przecięty brzeg skóry i ostrożnie oddziel ścianę ciała od błon S cs.

Aby odsłonić czwarty gruczoł pamięci pachwinowy przytwierdzony do dolnej strony ściany ciała, należy zlokalizować węzeł chłonny wewnątrz gruczołu pamięci, który znajduje się na przecięciu trzech wyraźnych naczyń krwionośnych w gruczole pamięci i jest wyczuwalny jako gęsty guzek wewnątrz poduszki tłuszczowej. Za pomocą końcówki nożyczek okularowych należy naciąć tkankę tłuszczową otaczającą węzeł chłonny. Następnie, opierając palec wskazujący o stronę naskórkową skóry, należy wywrzeć nacisk, aby wypchnąć węzeł z poduszki tłuszczowej i go odciąć.

Za pomocą zakrzywionej pęsety usuń węzeł chłonny. Teraz, trzymając brzegi skóry, chwyć zakrzywioną krawędzią zakrzywionej pęsety podskórną tkankę tłuszczową i stopniowo oddziel ją od ściany ciała. Podążając zgodnie z kierunkiem tkanki tłuszczowej w stronę powierzchni grzbietowej myszy, usuń cały gruczoł mlekowy w jednym kawałku.

Umieść gruczoł pamięciowy na sterylnym plastikowym bloku do cięcia i dodaj niewielką ilość pożywki, około 200 µL, na powierzchnię gruczołu, aby utrzymać go w stanie wilgotnym. Następnie posiekaj gruczoł na fragmenty o wielkości 1 mm za pomocą nowej żyletki. Podziel posiekany gruczoł na cztery części.

Następnie za pomocą pęsety rozdzielić materiał do czterech probówek kriogenicznych z medium do mrożenia. Umieścić probówki w zamrażarce do komórek Nalgene, w której zewnętrznej komorze znajduje się 250 milliliters izopropanolu. Następnie umieścić zamrażarkę do komórek w temperaturze minus 70 degrees Celsius na 24 hours.

Po 24 godzinach przenieś zamrożone probówki z fragmentami pamięci do ciekłego azotu i przechowuj do czasu transplantacji. Każda probówka kriogeniczna zawiera wystarczającą ilość fragmentów gruczołu pamięci, aby przeprowadzić transplantację do oczyszczonych poduszek tłuszczowych u od czterech do ośmiu myszy biorców. Po zweryfikowaniu głębokości znieczulenia u trzytygodniowej myszy biorcy poprzez uciśnięcie palca, mocno unieruchom mysz na stole operacyjnym stroną brzuszną do góry z rozpostartymi kończynami, tak aby brzuch był napięty.

Należy podać przedoperacyjny lek przeciwbólowy, bupiwakainę lub buprenorfinę, drogą podskórną. Obszar operacyjny należy zdezynfekować alkoholem i preparatem do mycia na bazie jodu za pomocą pęsety. Chwyć skórę kilka milimetrów powyżej miednicy i unieś ją znad brzucha.

Ostrożnie nacinamy skórę, upewniając się, że początkowe nacięcie nie znajduje się zbyt blisko cewki moczowej, ponieważ rozmieszczenie klipsów do ran mogłoby utrudnić myszy oddawanie moczu. Następnie, uważając, aby nie przebić błon SRUs, wykonujemy cięcie wzdłuż płaszczyzny pośrodkowej skóry, rozciągając je od łonka do mostka.

Następnie od miejsca początkowego nacięcia wykonaj skośne cięcia skóry od linii pośrodkowej przez miednicę w kierunku każdej z tylnych kończyn. Za pomocą zakrzywionych pęset delikatnie chwyć błony S ceros brzusznej ściany ciała. Następnie użyj pęsety anatomicznej, aby uchwycić przeciętą krawędź skóry i odsunąć ścianę ciała od błon ceros.

Aby odsłonić czwarty pachwinowy gruczoł pamięciowy, należy zlokalizować czwarty gruczoł pamięciowy. Po zidentyfikowaniu piątego gruczołu pamięciowego należy wypalić węzeł sutkowy oraz dwie tętnice prowadzące do węzła. Następnie należy oddzielić czwarty i piąty gruczoł, a potem wypalić brzeg piątego gruczołu.

Następnie, używając nożyczek, przetnij poduszeczkę tłuszczową tuż brzusznie od węzła, aby oddzielić poduszeczkę tłuszczową czwartej gruczoły pamięciowej. Za pomocą zakrzywionych pęsety mocno chwyć brzuszną część poduszeczki tłuszczowej i odsun ją od ściany ciała. Zaleca się, aby wyciętą tkankę w całości docisnąć pomiędzy dwoma opisanymi szkiełkami i utrwalić w utrwalaczu Carnoy.

Następnie tkankę można zabarwić, osadzić na szkiełku i ocenić pod kątem czystości marginesów. Za pomocą pęsety usuń wszelkie pozostałości gruczołu pamięci wokół obszaru usuniętej części poduszki tłuszczowej. Zwierzę jest teraz gotowe do transplantacji tkanek lub komórek.

Świeżą lub błyskawicznie zamrożoną tkankę nabłonkową dawcy można przeszczepić do oczyszczonej poduszki tłuszczowej. Alternatywnie można przeszczepić unieśmiertelnione linie komórkowe nabłonkowe, linie komórkowe nowotworowe lub komórki pierwotne. Szczegóły dotyczące przygotowania komórek znajdują się w towarzyszącym protokole pisemnym dotyczącym transplantacji fragmentów nabłonka. Przygotowano.

Film rozpoczyna się od rozmrożenia krioampułki z nabłonkiem i przeniesienia fragmentów do szalki Petriego zawierającej świeże medium. Aby rozcieńczyć DMSO, należy za pomocą nożyczek wykonać kieszonkę w oczyszczonym nabłonku tkanki tłuszczowej myszy biorcy. Następnie, używając pęsety igłowej, należy umieścić jednofilimetrowy fragment nabłonka dawcy w wykonanej kieszonce.

W razie potrzeby przytrzymać zamkniętą kieszeń pęsetą anatomiczną i wycofać pęsetę chirurgiczną, tak aby tkanka pozostała na miejscu. Chwycić przeciwległe brzegi skóry. Przytrzymać je razem za pomocą pęsety.

Odsuń je od błon otrzewnych brzusznej jamy ciała i zamknij za pomocą klipsów chirurgicznych. Użyj dwóch klipsów do zamknięcia nacięcia w linii pośrodkowej i po jednym klipsie dla każdego nacięcia skośnego. W razie potrzeby unikaj zablokowania cewki moczowej.

Zamknąć szczeliny w skórze na przecięciu nacięć pośrodkowego strzałkowego i ukośnego za pomocą szwu. Umieścić mysz w klatce i trzymać ją pod lampą grzewczą do czasu odzyskania przez zwierzę przytomności. Klamry ranne należy usunąć po dwóch tygodniach.

Poniższe slajdy przedstawiają reprezentatywne obrazy tego, czego można spodziewać się w gruczole pamięci biorcy po oczyszczeniu podkładki z paszą i przeszczepieniu nabłonka; ten obraz przedstawia endogenny nabłonek pamięci usunięty z trzymiesięcznej myszy. W procedurze oczyszczania gruczołu należy zwrócić uwagę na wyraźne marginesy na krawędzi cięcia. Po każdej procedurze należy przygotować preparat całego narządu, taki jak ten, aby ocenić oczyszczenie marginesów.

Na tym obrazie przedstawiono prześwietloną poduszeczkę tłuszczową myszy siedem tygodni po procedurze prześwietlania. Należy zauważyć, że cała poduszeczka tłuszczowa jest pozbawiona nabłonka pamięciowego, hematyny i acynusów. Barwienie prześwietlonej poduszeczki tłuszczowej siedem tygodni po procedurze prześwietlania wykazuje również, że gruczoł jest pozbawiony nabłonka pamięciowego.

Przedstawiono reprezentatywny preparat całego organu z prześwietlonej poduszki tłuszczowej, do której przeszczepiono nabłonek pamięci od myszy w wieku 10 tygodni. Należy zauważyć, że przeszczepiony nabłonek wytworzył prawidłowe drzewa przewodowe nabłonka, hematynę i pęcherzyki. Barwienie prześwietlonej poduszki tłuszczowej i pamięci.

Przeszczep nabłonkowy w tym samym wieku wykazuje prawidłową produkcję przewodów nabłonkowych z nabłonka egzogennego. Tutaj, barwienie hematoksyliną i eozyną oczyszczonej poduszki tłuszczowej pokazuje przeszczep nabłonkowy, który rozwinął się w guz piersi. Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak pobrać nabłonek gruczołu mlekowego i przeprowadzić przeszczep nabłonka gruczołu mlekowego.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przeciąć połączenia między czwartym a piątym gruczołem w celu wypalenia węzła oraz sutka, a także usunąć wszelkie ślady nabłonka endogennego. Należy upewnić się, że nie ma możliwości wrastania nabłonka endogennego w oczyszczoną poduszkę tłuszczową. Dodatkowo zaleca się pobranie w całości usuniętej części gruczołu mlekowego, aby sprawdzić, czy marginesy są wolne od zmian.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentów.