Ocena zdolności rozpuszczalnych cząsteczek sygnałowych do zmiany orientacji embrionalnych aksonów komisuralnych rdzenia kręgowego

Eksplanty grzbietowej części rdzenia kręgowego są wycinane z embrionów szczura i hodowane w trójwymiarowym żelu kolagenowym w opozycji do komórek wykazujących ekspresję kandydującej cząsteczki sygnałowej. Zdolność cząsteczki sygnałowej do zmiany orientacji aksonów rosnących w obrębie eksplantu grzbietowej części rdzenia kręgowego jest oceniana za pomocą immunohistochemii.

Witajcie, jestem Virginia Hazen z laboratorium Samanthy Butler w Departamencie Nauk Biologicznych na Uniwersytecie Południowej Kalifornii. Jestem Keith Fun, również z laboratorium Butler. A ja jestem Ken Ya Mai z laboratorium Butler.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę hodowli implantów grzbietowej części rdzenia kręgowego oraz agregatów transfekowanych komórek COST w macierzy kolagenowej. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania zdolności cząsteczek sygnałowych do orientowania neuronów rdzenia kręgowego. W tym eksperymencie zbadamy zdolność białka morfogenetycznego kości, czyli BMP 7, do działania jako czynnik chemorepelentny.

Zacznijmy. Przygotuj agregaty komórek co, które posłużą do wyzwania trajektorii aksonów choralnych z komórek co. Przetransformowanych plazmidem ekspresyjnym dla interesującej nas cząsteczki, w tym przypadku białka morfogenetycznego kości lub BMP seven.

Odssać pożywkę z szalki i wypłukać komórki 1 mL 1x PBS. Usunąć PBS i inkubować komórki z 0,5 mL bezenzymatycznego medium do dysocjacji komórek przez 15 minut. Zatrzymać reakcję poprzez dodanie 1 mL pożywki z płodową surowicą bydlęcą.

Za pomocą końcówki do pipety 1000 µL zdejmij komórki, aż żadne nie pozostaną na powierzchni naczynia hodowlanego. Przenieś komórki do stożkowej probówki 15 ml i odwiruj je przez dwie minuty. Przy 2000 RPM usuń nadsącz i pipetuj w górę i w dół, aby resuspender osad.

W 100 µL pożywki nanieś kilka 20 µL kropli zawiesiny komórek na wewnętrzną stronę pokrywki szalki hodowlanej o średnicy 35 mm. Zamknij pokrywkę na szalce i umieść ją w inkubatorze na kilka godzin, aby umożliwić agregację komórek. W celu przygotowania implantów grzbietowej części rdzenia kręgowego należy zachować świeżo pobrany materiał.

Umieść 11 embrionów szczura na lodzie. W medium L 15, za pomocą zaostrzonej igły wolframowej, usuń fragment obejmujący od czterech do sześciu segmentów roztoczy z obszaru tułowia bezpośrednio poniżej pąka kończyny przedniej każdego embrionu. Używając plastikowej pipety, zbierz tkankę do jednej z czterech studni.

Przygotuj szalkę na lodzie. Po wycięciu wszystkich segmentów, za pomocą pipety przenieś fragmenty do drugiej studni szalki zawierającej medium L 15 z dodatkiem pasty dyskowej. Inkubuj tkankę w temperaturze pokojowej nie dłużej niż przez pięć minut.

Aby zapobiec śmierci komórek, nie należy nadmiernie trawić tkanki. Do trzeciej studni płytki należy dodać 1 mL świeżego medium L 15 z 5% inaktywowaną ciepłem surowicą kozią, a następnie przenieść do tej studni fragmenty tkanki.

Po zakończeniu inkubacji w przestrzeni dis, pozostaw tkankę na lodzie na jedną godzinę. Aby ułatwić późniejszą dysekcję w probówce do mikrocentryfugi, dodaj 40 µL 10 x minimal essential medium do 360 µL kolagenu. Następnie krótko wymieszaj na wirówce typu vortex i odwiruj w mikrowirówce.

Roztwór będzie miał żółty kolor i należy go w miarę możliwości przechowywać w lodzie, aby zapobiec żelowaniu kolagenu. Dla każdej partii kolagenu należy przeprowadzić miareczkowanie, dodając 0,8 M wodorowęglanu sodu do momentu, aż roztwór kolagenu stanie się lekko pomarańczowy. Roztwór należy mieszać po każdej porcji. Gdy roztwór kolagenu uzyska taki kolor, pozostanie on w stanie ciekłym podczas przechowywania w lodzie, ale będzie gotowy do żelowania po doprowadzeniu do temperatury pokojowej. Jeśli po wymieszaniu roztwór stanie się różowy, należy rozpocząć procedurę od nowa, używając nowej probówki z kolagenem. Nanieść 20 µL kolagenu do każdej studzienki czystej płytki czterostudzienkowej.

Za pomocą końcówki pipety rozprowadź kolagen, tworząc mały plaster. Pozostaw kolagen do zastygnięcia w temperaturze pokojowej na około 10 minut. Pod mikroskopem sekcyjnym, używając świeżo zaostrzonej igły wolframowej i pęsety precyzyjnej, usuń igłą wolframową mezodermę otaczającą rdzeń kręgowy z jednego embrionu, a następnie usuń brzuszną część rdzenia kręgowego, którą można rozpoznać po obecności płytki dna.

Na najbardziej brzusznej krawędzi płyta podłogowa jest nieco grubsza niż płyta dachowa na krawędzi grzbietowej. W tym przykładzie rdzeń kręgowy jest skierowany stroną brzuszną do dołu. Ostrożnie przetnij tkankę, prowadząc cięcie równolegle do płyty podłogowej, a następnie usuń brzuszną piątą część rdzenia kręgowego.

Za pomocą igły przetnij podłużnie i pionowo preparat rdzenia kręgowego z grzbietu. Upewnij się, że krawędzie są odcięte jak najdokładniej i w razie potrzeby je przytnij. Użyj pipety ustnej z dopasowaną szklaną kapilarą o średnicy 0,5 mm, aby przenieść każdy preparat na osobną podkładkę kolagenową.

Za pomocą wolframowej igły należy pociąć agregat przetransfekowanych komórek na kwadraty o szerokości zbliżonej do szerokości krawędzi bocznej grzbietowej części rdzenia kręgowego. Za pomocą pipety ustnej należy przenieść jeden z kwadratów na podkład kolagenowy z x explan. Za pomocą pipety ustnej należy odessać nadmiar cieczy.

Należy unikać nadmiernego odsysania, ponieważ niewielka ilość cieczy ułatwi późniejszą aplikację kolagenu; nanieś 4 µL przygotowanego kolagenu na podkładkę. Użyj igły wolframowej, aby przesunąć kolagen nad implantami, nie dotykając bezpośrednio tkanki. Przesuwając igłę w kolagenie, zorientuj każdy x explan tak, aby agregat komórek co znajdował się przy jego bocznej krawędzi.

Pozostaw kolagen do stężenia przez 15 do 20 minut. Powtórz proces aplikacji, nakładając kolejne 4 µL kolagenu, aby upewnić się, że eksplant jest całkowicie otoczony kolagenem. Następnie, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przenieś kolejny zarodek do 0,5 mL medium i inkubuj przez 30 do 40 godzin w inkubatorze. W dygestorium utrwal eksplanty w 0,5 mL 4% roztworu paraformaldehydu w PBS przez 45 minut. Utrzymując tkankę w lodzie, przemyj ją dwukrotnie 0,5 mL roztworem blokującym i permeabilizującym PBTN.

Inkubować eksplanty x w roztworze blokującym w temperaturze four degrees Celsius, najlepiej przez noc. Za pomocą pęsety wyciąć eksplant X z tacki i umieścić każdy z nich w osobnej studni płytki 48-dołkowej.

Do każdego dołka należy dodać 200 µL przeciwciała pierwszorzędowego. W celu wizualizacji aksonów komórek choralnych należy zastosować przeciwciało mysie anty-ttag, a aby określić, czy transfekcja krzyżowa komórek przebiegła pomyślnie, należy dodać przeciwciało przeciwko badanej cząsteczce. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.

Każdą próbkę przemyć pięciokrotnie w roztworze blokującym PBTN, wykonując każde płukanie przez jedną godzinę w temperaturze 4°C. Usunąć PBTN i dodać 200 µL przeciwciała wtórnego do każdego dołka. Przykryć folią aluminiową, aby zapobiec blaknięciu, i inkubować przez noc w temperaturze 4°C.

Próbki należy przemyć pięciokrotnie w PBTN, analogicznie jak poprzednio. Każdy preparat należy przenieść na szkiełko z trzema wgłębieniami. Po usunięciu nadmiaru cieczy nanosi się medium montażowe Invecta Shield i przykrywa całość szkiełkiem nakrywnym.

Przechowywać preparaty w chronionym przed światłem folderze lub pudełku w temperaturze 4°C lub -20°C do momentu wizualizacji pod mikroskopem. Teraz zaprezentujemy reprezentatywne obrazy eksplantów x po ich hodowli, utrwaleniu, barwieniu i obrazowaniu za pomocą mikroskopii konfokalnej. Panel A pokazuje, że eksplant x płytki dachowej (obrysowany na biało) może przekierować dodatnie dla tagu 1 aksony chordalne z dala od siebie, co dowodzi, że płytka dachowa jest źródłem chemo repelentu aksonalnego. Panel B pokazuje, że komórki co wydzielające cząsteczkę sygnałową M tact, białko morfogenetyczne kości lub BMP 7, mogą odpychać aksony karceralne w sposób podobny do płytki dachowej.

Aksony komórek wydzielających wyłącznie plazmid ekspresyjny nie wykazują żadnych zmian w orientacji. Przedstawiliśmy właśnie sposób wycinania, orientowania i hodowania eksplantów rdzenia kręgowego oraz rozmieszczania agregatów komórkowych, co pozwala określić, czy kandydująca cząsteczka sygnałowa posiada aktywność reorientującą aksony. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby kolagen w miarę możliwości utrzymywać w lodzie oraz całkowicie otoczyć eksplant kolagenem, tak aby nie miał on bezpośredniego kontaktu z pożywką hodowlaną.

I na koniec, hoduj tkankę tylko przez czas niezbędny do wydłużenia się aksonów do brzegu brzusznego eksplantu. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.