Name: Oznaczanie zdolności dyfuzyjnych cząsteczek sygnałowych do reorientacji embrionalnych aksonów spoidła rdzeniowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-08T16:41:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Poznaj metodę oceny zdolności BMP7 do reorientacji aksonów komisuralnych w eksplantatach grzbietowej części rdzenia kręgowego szczura przy użyciu immunohistochemii. Ta technika pozwala badać mechanizmy kierowania aksonami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Protokół ten został opracowany w laboratoriach Jane Dodd, Thomasa Jessella i Andrew Lumsdena. Wiele osób, w tym Konrad Basler, Ann Calof, Thomas Edlund, Phil Hamilton, Domna Karagogeos, Ariel Ruiz i Altaba oraz Toshiya Yamada, opracowało metodę hodowli eksplantów rdzenia kręgowego w kolagenie. Marysia Placzek i Marc Tessier-Lavigne zapoczątkowali technikę wykorzystania wzrostu aksonów z eksplantów in vitro jako sposobu identyfikacji cząsteczek kierujących wzrostem aksonów. Prace w laboratorium Butlera są wspierane przez granty March of Dimes oraz R01 NS063999 z NIH/NINDS.

Część 1: Przygotowanie agregatów transfektowanych komórek COS przy użyciu metody wiszących kropli
<ol>
 <li>Wysiać komórki COS-7 (COS) w szalkach hodowlanych o średnicy 35 mm. Po osiągnięciu 80% konfluencji przeprowadzić transfekcję komórek 1 μg plazmidu ekspresyjnego przy użyciu Lipofectamine2000 zgodnie z protokołem producenta.</li>
 <li>Aby przygotować krople wiszące, odessać medium do transfekcji i opłukać przetransfekowane komórki COS 1 ml 1x roztworu buforu fosforanowego (PBS). Traktować komórki 0,5 ml medium do dysocjacji komórek bez enzymów przez 15 minut. Dodać 1 ml roztworu Opti-MEM + 1x Penicylina/Streptomycyna/Glutamina (P/S/G) + 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), aby zatrzymać reakcję.</li>
 <li>Poddać komórki tryturacji w celu usunięcia ich z powierzchni szalki hodowlanej i przenieść do stożkowej probówki o objętości 15 ml. Wirować przez 2 minuty przy 2000 g, aby uzyskać osad komórkowy. Usunąć nadosad i resuspendować osad w 100 μl Opti-MEM + 1x P/S/G + 10% FBS.</li>
 <li>Nanieść kilka kropel o objętości 20 μl na wewnętrzną stronę pokrywki szalki hodowlanej 35 mm, odwrócić pokrywkę, położyć ją na dnie szalki i pozostawić w inkubatorze w temperaturze 37°C przez kilka godzin aż do zagregowania komórek.</li>
</ol>
Część 2: Przygotowanie eksplantów grzbietowej części rdzenia kręgowego
<ol>
 <li>Wypreparuj embriony szczura w stadium E11 z macicy matki i przechowuj na lodzie w medium L15 do momentu użycia.</li>
 <li>Za pomocą zaostrzonej igły wolframowej usuń odcinek obejmujący 4–6 segmentów z tułowia każdego embrionu, z obszaru bezpośrednio poniżej pączka kończyny przedniej. Używając plastikowej pipety, zbierz fragmenty tkanki do jednej studni 4-studziennej płytki Nunc i przechowuj na lodzie.</li>
 <li>Po wypreparowaniu wszystkich segmentów embrionów, za pomocą plastikowej pipety przenieś fragmenty do roztworu 1 ml L15 + 1 mg dyspazy w drugiej studni płytki Nunc. Inkubuj w temperaturze pokojowej nie dłużej niż 5 minut. Nie inkubuj fragmentów tkanki z dyspazą zbyt długo.</li>
 <li>W czasie inkubacji dodaj 0,5 ml uprzednio inaktywowanego termicznie normalnego surowicy koziej (HIGS) do około 10 ml L15 w czalce Petriego i wymieszaj przez delikatne potrząsanie. Przenieś 1 ml tego roztworu do trzeciej studni płytki Nunc i po zakończeniu inkubacji przenieś do niej fragmenty tkanki. Przechowuj na lodzie. Uwaga: późniejsza dyssekcja będzie łatwiejsza, jeśli fragmenty tkanki „odpoczywają” na lodzie przez godzinę.</li>
</ol>
Część 3: Przygotowanie kolagenu
<ol>
 <li>Do 360μl kolagenu dodać 40μl 10x Minimal Essential Medium, wymieszać szybko i dokładnie poprzez potrząsanie probówką lub krótkie wirowanie w wiertaku. Szybko odwirować w picofuge. Roztwór będzie miał żółty kolor. Przechowywać na lodzie tak długo, jak to możliwe.</li>
 <li>Dodać odpowiednią ilość 0,8M wodorowęglanu sodu (NaHCO3), aby roztwór kolagenu stał się lekko pomarańczowy (patrz uwaga poniżej). Ponownie wymieszać szybko i dokładnie przez potrząsanie, a następnie krótko odwirować w picofuge. Jeśli po wymieszaniu roztwór pozostaje różowy, oznacza to, że dodano zbyt dużo NaHCO3 i należy powtórzyć procedurę z nową probówką kolagenu.</li>
 <li>W tym momencie roztwór kolagenu jest przygotowany. Pozostanie on w stanie ciekłym na lodzie, ale zestali się w ciągu około 5 minut (przybierając różowy kolor) po doprowadzeniu do temperatury pokojowej.</li>
 <li>Nanieść 20μl kolagenu do każdej studzienki 4-dołkowej płytki Nunc. Za pomocą końcówki pipety rozprowadzić kolagen, aby utworzyć małą „podkładkę”. Pozostawić kolagen do zastygnięcia w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
Uwaga: Dokładna ilość NaHCO3 musi zostać wymCtitrowana dla każdej partii kolagenu. Należy zacząć od małej ilości (11μl), a następnie dodawać po 0,5-1μl stopniowo, aż roztwór uzyska lekko pomarańczowy odcień. „Właściwa” ilość to zazwyczaj 1ul mniej niż najmniejsza ilość NaHCO3, która sprawiłaby, że kolagen stałby się różowy. Ilość NaHCO3 nie skaluje się liniowo w górę ani w dół.
Część 4: Disekcja eksplantów grzbietowej części rdzenia kręgowego i ich rozmieszczenie z agregatami komórek COS w macierzy kolagenowej
<ol>
 <li>Używając nowo zaostrzonej igły wolframowej i precyzyjnej pęsety (#5 lub #55), usunąć mezodermę otaczającą rdzeń kręgowy.</li>
 <li>Przecinając równolegle do płytki podłoża za pomocą igły wolframowej, ostrożnie usunąć brzuszną piątą część rdzenia kręgowego.</li>
 <li>Przeciąć grzbietowy eksplant rdzenia na pół, dbając o to, aby krawędzie były odcięte jak najdokładniej. W razie potrzeby ponownie przyciąć krawędzie. Przenieść każdy grzbietowy eksplant rdzenia na oddzielne podkładki kolagenowe, używając pipety ustnej z dopasowaną szklaną kapilarą o średnicy ok. 0,5mm.</li>
 <li>Wyciąć agregat transfekowanych komórek COS w kwadraty o szerokości zbliżonej do szerokości bocznej krawędzi grzbietowego eksplantu rdzenia.</li>
 <li>Przenieść jeden z tych kwadratów na podkładkę kolagenową z grzbietowym eksplantem rdzenia, używając pipety ustnej.</li>
 <li>Za pomocą pipety ustnej odessać nadmiar cieczy. Nie odsysać zbyt dużego wolumenu.</li>
 <li>Nanieść 4μl przygotowanego kolagenu na podkładkę, a następnie za pomocą igły wolframowej rozprowadzić kolagen nad eksplantami, nie dotykając bezpośrednio tkanki. Przesuwając igłę wolframową w kolagenie wokół eksplantów, ustawić je tak, aby agregat komórek COS znajdował się przylegać do bocznej krawędzi grzbietowego eksplantu rdzenia.</li>
 <li>Po zastygnięciu kolagenu powtórzyć aplikację 4μl kolagenu, aby upewnić się, że eksplanty są całkowicie zatopione w kolagenie.</li>
 <li>W komorze z laminarnym przepływem powietrza dodać 0,5ml Opti-MEM + 1xP/S/G i inkubować przez 30-40 godzin.</li>
 <li>Utrwalić eksplanty przez 45 minut w 0,5ml 4% paraformaldehydu w 1xPBS, trzymając płytkę na lodzie.</li>
 <li>Przemyć dwukrotnie 0,5ml roztworu blokującego składającego się z 1xPBS + 0,1% Triton-X100 + 1% HIGS (PBTN). Blokować w temperaturze 4°C przez co najmniej kilka godzin (preferowana inkubacja nocna), a następnie poddać analizie immunohistochemicznej.</li>
</ol>
Część 5: Wizualizacja aksonów komisuralnych za pomocą immunohistochemii
<ol>
 <li>Po blokowaniu w PBTN, wyciąć eksplanty z płytki 4-dołkowej za pomocą pęsety i umieścić je w płytce 48-dołkowej.</li>
 <li>Do każdej dołki dodać 200μl przeciwciał pierwszorzędowych i inkubować przez noc w temperaturze 4°C. W celu wizualizacji aksonów komisuralnych należy użyć roztworu przeciwciał mysich anty-Tag1 w rozcieńczeniu 1:6. Aby sprawdzić, czy transfekcja przebiegła pomyślnie, należy również zastosować przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko testowanej cząsteczce sygnałowej lub odpowiedniemu epitopowi, jeśli cząsteczka sygnałowa została znakowana epitopem.</li>
 <li>Każdą próbkę płukać 5 razy przez 1 godzinę w PBTN w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Do każdej dołki dodać 200μl przeciwciał drugorzędowych i inkubować przez noc w temperaturze 4°C. Jeśli jako przeciwciało pierwszorzędowe zastosowano przeciwciała anty-Tag1, należy użyć kozich przeciwciał drugorzędowych anty-mysich IgM sprzężonych z FITC lub Cy3. W przypadku użycia światłoczułych przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z FITC lub Cy3, od tego momentu płytkę 48-dołkową należy trzymać przykrytą folią aluminiową.</li>
 <li>Każdą próbkę płukać 5 razy przez 1 godzinę w PBTN w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Przenieść eksplant na szkiełko z 3 wgłębieniami, usunąć nadmiar cieczy, zamontować w medium Vectashield i przykryć szkiełkiem cover-slip. Przechowywać w ciemnym pudełku w temperaturze 4°C lub -20°C.</li>
</ol>
Część 6: Reprezentatywne obrazy eksplantów
W udanym eksperymencie eksplant i agregat COS pozostaną przylegać do siebie i nie rozdzielą się podczas zestalania kolagenu. Przerost aksonów będzie minimalny; znaczny przerost aksonalny wskazuje na zbyt długą hodowlę eksplantu grzbietowej części rdzenia kręgowego. Z eksplantu nie będą wyrastać pęcherzyki; pęcherzykowanie występuje, gdy tkanka wejdzie w bezpośredni kontakt z pożywką hodowlaną.
Zdolność cząsteczki sygnałowej do reorientacji aksonów ocenia się za pomocą mikroskopii konfokalnej. Stopień reorientacji aksonów można określić ilościowo, mierząc średni kąt reorientacji aksonów znajdujących się najbliżej agregatu komórek COS3. Jak pokazano na Ryc. 1, komórki COS wykazujące ekspresję BMP7 z tagiem myc (niebieskie) reorientują aksony komisuralne Tag1+ (zielone) w kierunku przeciwnym do źródła BMP7 (Ryc. 1B), podobnie jak dzieje się w przypadku eksplantu płyty dachowej, który odpycha aksony komisuralne (Ryc. 1A). Komórki COS wykazujące ekspresję wektora kontrolnego nie mają wpływu na orientację aksonów komisuralnych3,4. Eksplanty te zostały również znakowane przeciwciałami przeciwko czynnikowi transkrypcyjnemu Isl1/2 (czerwone), który barwi neurony ruchowe i interneurony grzbietowe. Wynik ten był pierwszą wskazówką, że jeden z członków rodziny BMP pośredniczy w aktywności chemorepellentu płyty dachowej3.
<img src="/files/ftp_upload/1853/1853fig1tmb.jpg" border="0" alt="Schemat eksplantu neuronalnego; ekspresja Tag1, Isl1/2, Myc; analiza wpływu BMP7 na komórki COS." data-altupdatedat="1787630408000"> Rysunek 1: Prosimy <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1853/1853fig1.jpg">kliknąć tutaj</a>, aby zobaczyć powiększoną wersję rysunku 1.

<ol><li>Altman, J., Bayer, S. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAltman%2C+J+%22The+development+of+the+rat+spinal+cord%22">The development of the rat spinal cord</a>. , (1984).</li>
<li>Placzek, M. Tissue recombinations in collagen gels. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPlaczek%2C+M+%22Methods+in+molecular+biology%22">Methods in molecular biology</a>. , Springer. Clifton, N.J. 461 vol 325-335 (2008).</li>
<li>Augsburger, A., Schuchardt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMPs+as+mediators+of+roof+plate+repulsion+of+commissural+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">BMPs as mediators of roof plate repulsion of commissural neurons.</a> Neuron. 24, 127-141 (1999).</li>
<li>Butler, S. J., Dodd, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+BMP+heterodimers+in+roof+plate-mediated+repulsion+of+commissural+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A role for BMP heterodimers in roof plate-mediated repulsion of commissural axons.</a> Neuron. 38, 389-401 (2003).</li>
<li>Kennedy, T. E., Serafini, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Netrins+are+diffusible+chemotropic+factors+for+commissural+axons+in+the+embryonic+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord.</a> Cell. 78, 425-435 (1994).</li>
<li>Charron, F., Stein, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphogen+sonic+hedgehog+is+an+axonal+chemoattractant+that+collaborates+with+netrin-1+in+midline+axon+guidance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The morphogen sonic hedgehog is an axonal chemoattractant that collaborates with netrin-1 in midline axon guidance.</a> Cell. 113, 11-23 (2003).</li>
<li>Lumsden, A. G., Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotropic+effect+of+specific+target+epithelium+in+the+developing+mammalian+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemotropic effect of specific target epithelium in the developing mammalian nervous system.</a> Nature. 323, 538-539 (1986).</li>
<li>Dodd, J., Morton, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+regulation+of+axonal+glycoprotein+expression+on+subsets+of+embryonic+spinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Spatial regulation of axonal glycoprotein expression on subsets of embryonic spinal neurons.</a> Neuron. 1, 105-116 (1988).</li>
<li>Yamauchi, K., Phan, K. D., Butler, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+type+I+receptor+complexes+have+distinct+activities+mediating+cell+fate+and+axon+guidance+decisions%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">BMP type I receptor complexes have distinct activities mediating cell fate and axon guidance decisions.</a> Development. 135, 1119-1128 (2008).</li>
</ol>

Kluczowymi czynnikami warunkującymi powodzenie tego testu są po pierwsze: tkanka nie powinna być traktowana dyspazą przez zbyt długi czas, ponieważ takie działanie spowoduje, że tkanka stanie się bardzo lepka, a jej żywotność spadnie. Po drugie: kolagen musi być idealnie przygotowany i w miarę możliwości przechowywany w lodzie. W przypadku rozpoczęcia procesu żelowania (zmiany barwy na różową) jego manipulacja stanie się coraz trudniejsza. Po trzecie: igła wolframowa musi być zawsze bardzo ostra.

<table><tbody><tr><td>Kolagen z ogona szczura typu 1</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Komórki COS-7</td><td>ATCC</td><td>CRL-1651</td><td></td></tr><tr><td>10x Minimal Essential Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11430-030</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Invitrogen</td><td>51985-034</td><td></td></tr><tr><td>L15</td><td>Invitrogen</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>1166-8019</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>35-016-CV</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór do dysocjacji komórek</td><td>EMD Millipore</td><td>S-004-C</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 0.25% EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>2520-0056</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep/Glutamate</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Baker/VWR</td><td>JTS898-7</td><td></td></tr><tr><td>Dyspaza</td><td>Roche Group</td><td>10241750001</td><td></td></tr><tr><td>mysi przeciwciało anty-Tag1 IgM (4D7)</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mysi przeciwciało anty-Myc IgG (9E10)</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-40</td><td></td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty-mysie IgM FITC</td><td>Jackson</td><td>115-095-075</td><td></td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty-mysie Fcy Cy3</td><td>Jackson</td><td>115-165-071</td><td></td></tr><tr><td>Surowica kozia</td><td>Invitrogen</td><td>16210064</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Szybka Nunclon 4-dołkowa</td><td>Nalge Nunc international</td><td>62407-068</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełko z 3 wgłębieniami</td><td>VWR international</td><td>48339-009</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 48-dołkowa</td><td>Falcon BD</td><td>62406-195</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw rurki aspiracyjnej</td><td>FHC, Inc.</td><td>30-32-0</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont nr 55</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont nr 5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Igłotrzymacz</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena zdolności rozpuszczalnych cząsteczek sygnałowych do zmiany orientacji embrionalnych aksonów komisuralnych rdzenia kręgowego

Assaying the Ability of Diffusible Signaling Molecules to Reorient Embryonic Spinal Commissural Axons

Aksony komisuralne grzbietowe w rdzeniu kręgowym kręgowców1 stanowiły nieoceniony system modelowy do identyfikacji sygnałów prowadzących aksony. W niniejszym opracowaniu opisujemy in vitro test, „test reorientacji”, który był szeroko stosowany do badania wpływu sygnałów zewnętrznych i wewnętrznych na orientację aksonów komisuralnych2Test ten został opracowany przez wiele osób w laboratoriach Jane Dodd, Thomasa Jessella i Andrew Lumsdena (szczegóły znajdują się w podziękowaniach), a jego wersje wykorzystano do wykazania aktywności reorientacyjnej kluczowych cząsteczek kierujących wzrostem aksonów, w tym chemorepellentu BMP w płycie dachowej.3,4 or aktywność chemoattrakcyjna Netrin15 oraz Sonic Hedgehog (Shh)6 w płytce dna rdzenia kręgowego.
Eksplanty obejmujące 2-3 segmenty tylnych dwóch trzecich rdzenia kręgowego są wycinane od szczurów w 11. dniu embrionalnym (E11) i hodowane w trójwymiarowych żelach kolagenowych7. Eksplanty tylnej części rdzenia z E11 zawierają nowo powstałe neurony komisuralne, które można zidentyfikować po ekspresji glikoproteiny Tag1 w ich aksonach8. W ciągu 30-40 godzin hodowli w tych eksplantach tylnych odtwarzana jest trajektoria aksonów komisuralnych w czasie zbliżonym do tego, który obserwuje się in vivo. Trajektoria ta może zostać poddana badaniu poprzez umieszczenie tkanek testowych lub agregatu komórek COS wykazujących ekspresję kandydowanej cząsteczki sygnałowej w kontakcie z jedną z bocznych krawędzi eksplantu tylnego. Aksony komisuralne rozrastające się w sąsiedztwie dołączonej tkanki będą rosnąć pod wpływem zarówno endogennej płyty dachowej, jak i sygnałów z ektopowej tkanki bocznej. Stopień, w jakim aksony komisuralne zmieniają orientację w tych okolicznościach, można poddać kwantyfikacji. Dzięki zastosowaniu tego testu możliwe jest zbadanie zarówno wystarczalności konkretnego sygnału do zmiany orientacji aksonów komisuralnych3,4, jak i konieczności wystąpienia tego sygnału dla kierowania trajektorią komisuralną9.

Niniejszy test ocenia zdolność cząsteczki sygnałowej, w tym przypadku białka morfogenetycznego kostnego 7 (BMP7), do zmiany kierunku wzrostu aksonów komisuralnych. Eksplant embrionalnego grzbietowego rdzenia kręgowego jest hodowany obok agregatu komórek COS wydzielających badane czynniki wzrostu. Zmiana kierunku wzrostu aksonów komisuralnych w obrębie eksplantu jest wizualizowana za pomocą immunohistochemii.

Ocena zdolności rozpuszczalnych cząsteczek sygnałowych do zmiany orientacji embrionalnych aksonów komisuralnych rdzenia kręgowego

Aksony komisuralne grzbietowe w rdzeniu kręgowym kręgowców stanowiły nieoceniony system modelowy do identyfikacji sygnałów kierujących wzrostem aksonów. W niniejszej pracy...

Eksplanty grzbietowej części rdzenia kręgowego są wycinane z embrionów szczura i hodowane w trójwymiarowym żelu kolagenowym w opozycji do komórek wykazujących ekspresję kandydującej cząsteczki sygnałowej. Zdolność cząsteczki sygnałowej do zmiany orientacji aksonów rosnących w obrębie eksplantu grzbietowej części rdzenia kręgowego jest oceniana za pomocą immunohistochemii.Witajcie, jestem Virginia Hazen z laboratorium Samanthy Butler w Departamencie Nauk Biologicznych na Uniwersytecie Południowej Kalifornii. Jestem Keith Fun, również z laboratorium Butler. A ja jestem Ken Ya Mai z laboratorium Butler.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę hodowli implantów grzbietowej części rdzenia kręgowego oraz agregatów transfekowanych komórek COST w macierzy kolagenowej. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania zdolności cząsteczek sygnałowych do orientowania neuronów rdzenia kręgowego. W tym eksperymencie zbadamy zdolność białka morfogenetycznego kości, czyli BMP 7, do działania jako czynnik chemorepelentny.Zacznijmy. Przygotuj agregaty komórek co, które posłużą do wyzwania trajektorii aksonów choralnych z komórek co. Przetransformowanych plazmidem ekspresyjnym dla interesującej nas cząsteczki, w tym przypadku białka morfogenetycznego kości lub BMP seven.Odssać pożywkę z szalki i wypłukać komórki 1 mL 1x PBS. Usunąć PBS i inkubować komórki z 0,5 mL bezenzymatycznego medium do dysocjacji komórek przez 15 minut. Zatrzymać reakcję poprzez dodanie 1 mL pożywki z płodową surowicą bydlęcą.Za pomocą końcówki do pipety 1000 µL zdejmij komórki, aż żadne nie pozostaną na powierzchni naczynia hodowlanego. Przenieś komórki do stożkowej probówki 15 ml i odwiruj je przez dwie minuty. Przy 2000 RPM usuń nadsącz i pipetuj w górę i w dół, aby resuspender osad.W 100 µL pożywki nanieś kilka 20 µL kropli zawiesiny komórek na wewnętrzną stronę pokrywki szalki hodowlanej o średnicy 35 mm. Zamknij pokrywkę na szalce i umieść ją w inkubatorze na kilka godzin, aby umożliwić agregację komórek. W celu przygotowania implantów grzbietowej części rdzenia kręgowego należy zachować świeżo pobrany materiał.Umieść 11 embrionów szczura na lodzie. W medium L 15, za pomocą zaostrzonej igły wolframowej, usuń fragment obejmujący od czterech do sześciu segmentów roztoczy z obszaru tułowia bezpośrednio poniżej pąka kończyny przedniej każdego embrionu. Używając plastikowej pipety, zbierz tkankę do jednej z czterech studni.Przygotuj szalkę na lodzie. Po wycięciu wszystkich segmentów, za pomocą pipety przenieś fragmenty do drugiej studni szalki zawierającej medium L 15 z dodatkiem pasty dyskowej. Inkubuj tkankę w temperaturze pokojowej nie dłużej niż przez pięć minut.Aby zapobiec śmierci komórek, nie należy nadmiernie trawić tkanki. Do trzeciej studni płytki należy dodać 1 mL świeżego medium L 15 z 5% inaktywowaną ciepłem surowicą kozią, a następnie przenieść do tej studni fragmenty tkanki.Po zakończeniu inkubacji w przestrzeni dis, pozostaw tkankę na lodzie na jedną godzinę. Aby ułatwić późniejszą dysekcję w probówce do mikrocentryfugi, dodaj 40 µL 10 x minimal essential medium do 360 µL kolagenu. Następnie krótko wymieszaj na wirówce typu vortex i odwiruj w mikrowirówce.Roztwór będzie miał żółty kolor i należy go w miarę możliwości przechowywać w lodzie, aby zapobiec żelowaniu kolagenu. Dla każdej partii kolagenu należy przeprowadzić miareczkowanie, dodając 0,8 M wodorowęglanu sodu do momentu, aż roztwór kolagenu stanie się lekko pomarańczowy. Roztwór należy mieszać po każdej porcji. Gdy roztwór kolagenu uzyska taki kolor, pozostanie on w stanie ciekłym podczas przechowywania w lodzie, ale będzie gotowy do żelowania po doprowadzeniu do temperatury pokojowej. Jeśli po wymieszaniu roztwór stanie się różowy, należy rozpocząć procedurę od nowa, używając nowej probówki z kolagenem. Nanieść 20 µL kolagenu do każdej studzienki czystej płytki czterostudzienkowej.Za pomocą końcówki pipety rozprowadź kolagen, tworząc mały plaster. Pozostaw kolagen do zastygnięcia w temperaturze pokojowej na około 10 minut. Pod mikroskopem sekcyjnym, używając świeżo zaostrzonej igły wolframowej i pęsety precyzyjnej, usuń igłą wolframową mezodermę otaczającą rdzeń kręgowy z jednego embrionu, a następnie usuń brzuszną część rdzenia kręgowego, którą można rozpoznać po obecności płytki dna.Na najbardziej brzusznej krawędzi płyta podłogowa jest nieco grubsza niż płyta dachowa na krawędzi grzbietowej. W tym przykładzie rdzeń kręgowy jest skierowany stroną brzuszną do dołu. Ostrożnie przetnij tkankę, prowadząc cięcie równolegle do płyty podłogowej, a następnie usuń brzuszną piątą część rdzenia kręgowego.Za pomocą igły przetnij podłużnie i pionowo preparat rdzenia kręgowego z grzbietu. Upewnij się, że krawędzie są odcięte jak najdokładniej i w razie potrzeby je przytnij. Użyj pipety ustnej z dopasowaną szklaną kapilarą o średnicy 0,5 mm, aby przenieść każdy preparat na osobną podkładkę kolagenową.Za pomocą wolframowej igły należy pociąć agregat przetransfekowanych komórek na kwadraty o szerokości zbliżonej do szerokości krawędzi bocznej grzbietowej części rdzenia kręgowego. Za pomocą pipety ustnej należy przenieść jeden z kwadratów na podkład kolagenowy z x explan. Za pomocą pipety ustnej należy odessać nadmiar cieczy.Należy unikać nadmiernego odsysania, ponieważ niewielka ilość cieczy ułatwi późniejszą aplikację kolagenu; nanieś 4 µL przygotowanego kolagenu na podkładkę. Użyj igły wolframowej, aby przesunąć kolagen nad implantami, nie dotykając bezpośrednio tkanki. Przesuwając igłę w kolagenie, zorientuj każdy x explan tak, aby agregat komórek co znajdował się przy jego bocznej krawędzi.Pozostaw kolagen do stężenia przez 15 do 20 minut. Powtórz proces aplikacji, nakładając kolejne 4 µL kolagenu, aby upewnić się, że eksplant jest całkowicie otoczony kolagenem. Następnie, w komorze z laminarnym przepływem powietrza, przenieś kolejny zarodek do 0,5 mL medium i inkubuj przez 30 do 40 godzin w inkubatorze. W dygestorium utrwal eksplanty w 0,5 mL 4% roztworu paraformaldehydu w PBS przez 45 minut. Utrzymując tkankę w lodzie, przemyj ją dwukrotnie 0,5 mL roztworem blokującym i permeabilizującym PBTN.Inkubować eksplanty x w roztworze blokującym w temperaturze four degrees Celsius, najlepiej przez noc. Za pomocą pęsety wyciąć eksplant X z tacki i umieścić każdy z nich w osobnej studni płytki 48-dołkowej.Do każdego dołka należy dodać 200 µL przeciwciała pierwszorzędowego. W celu wizualizacji aksonów komórek choralnych należy zastosować przeciwciało mysie anty-ttag, a aby określić, czy transfekcja krzyżowa komórek przebiegła pomyślnie, należy dodać przeciwciało przeciwko badanej cząsteczce. Inkubować przez noc w temperaturze 4 °C.Każdą próbkę przemyć pięciokrotnie w roztworze blokującym PBTN, wykonując każde płukanie przez jedną godzinę w temperaturze 4°C. Usunąć PBTN i dodać 200 µL przeciwciała wtórnego do każdego dołka. Przykryć folią aluminiową, aby zapobiec blaknięciu, i inkubować przez noc w temperaturze 4°C.Próbki należy przemyć pięciokrotnie w PBTN, analogicznie jak poprzednio. Każdy preparat należy przenieść na szkiełko z trzema wgłębieniami. Po usunięciu nadmiaru cieczy nanosi się medium montażowe Invecta Shield i przykrywa całość szkiełkiem nakrywnym.Przechowywać preparaty w chronionym przed światłem folderze lub pudełku w temperaturze 4°C lub -20°C do momentu wizualizacji pod mikroskopem. Teraz zaprezentujemy reprezentatywne obrazy eksplantów x po ich hodowli, utrwaleniu, barwieniu i obrazowaniu za pomocą mikroskopii konfokalnej. Panel A pokazuje, że eksplant x płytki dachowej (obrysowany na biało) może przekierować dodatnie dla tagu 1 aksony chordalne z dala od siebie, co dowodzi, że płytka dachowa jest źródłem chemo repelentu aksonalnego. Panel B pokazuje, że komórki co wydzielające cząsteczkę sygnałową M tact, białko morfogenetyczne kości lub BMP 7, mogą odpychać aksony karceralne w sposób podobny do płytki dachowej.Aksony komórek wydzielających wyłącznie plazmid ekspresyjny nie wykazują żadnych zmian w orientacji. Przedstawiliśmy właśnie sposób wycinania, orientowania i hodowania eksplantów rdzenia kręgowego oraz rozmieszczania agregatów komórkowych, co pozwala określić, czy kandydująca cząsteczka sygnałowa posiada aktywność reorientującą aksony. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby kolagen w miarę możliwości utrzymywać w lodzie oraz całkowicie otoczyć eksplant kolagenem, tak aby nie miał on bezpośredniego kontaktu z pożywką hodowlaną.I na koniec, hoduj tkankę tylko przez czas niezbędny do wydłużenia się aksonów do brzegu brzusznego eksplantu. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

assaying-ability-diffusible-signaling-molecules-to-reorient-embryonic

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ocena zdolności dyfuzyjnych cząleczek sygnałowych do reorientacji osiowych włókien nerwowych rdzenia kręgowego zarodkowego

W tym filmie zaprezentowano metodę preparowania i hodowli neuronów komisuralnych z grzbietowej części rdzenia kręgowego szczura w 13. dniu embrionalnym (E13). Dysocjowane neurony komisuralne są użyteczne w badaniu komórkowych i molekularnych mechanizmów wzrostu i prowadzenia aksonów.

Disekcja i hodowla neuronów komisuralnych z embrionalnego rdzenia kręgowego

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób wizualizacji szlaków aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w embrionalnym rdzeniu kręgowym kurczaka, z wykorzystaniem elektroporacji in ovo genów reporterowych pod kontrolą specyficznych elementów enhancera.

Rozszyfrowanie dróg aksonalnych genetycznie zdefiniowanych grup neuronów w cewie nerwowej kurczaka z wykorzystaniem elektroporacji in ovo

Demonstrujemy sposób wycinania i hodowli eksplantów zwoju statoakustycznego w dniu E4 oraz rdzenia kręgowego w dniu E6 zarodka kurczaka. Eksplanty są hodowane w warunkach bezsurowiczych w trójwymiarowych żelach kolagenowych przez 24 godziny. Reaktywność neurytów jest badana przy użyciu pożywki uzupełnionej o czynniki wzrostu oraz koralików pokrytych białkiem.

Disekcja i hodowla eksplantów zrazustatoakustycznego i rdzenia kręgowego kurczaka w żelach kolagenowych do testów wzrostu neurytów

Stereotypowe projekcje aferentów sensorycznych do rdzenia kręgowego gryzoni stanowią łatwo dostępny system eksperymentalny do badania rozgałęzień aksonalnych poprzez śledzenie pojedynczych aksonów.

Znakowanie neuronów ziewnięcia grzbietowego (DRG) barwnikiem DiI w celu badania rozgałęzień aksonalnych w preparacie całego rdzenia kręgowego zarodka myszy

Opisano metodę, która pozwala na specyficzne dla typu komórek i możliwe do śledzenia obniżenie ekspresji genów w rurce nerwowej. Wykazujemy, w jaki sposób elektroporacja in ovo plazmidów opartych na mikroRNA, które wywołują kontrolowaną przestrzennie i czasowo interferencję RNA, może być wykorzystana do badania prowadzenia aksonów komisuralnych w rozwijającej się rurce nerwowej.

In ovo elektroporacja plazmidów opartych na miRNA w rozwijającej się rurze neuronalnej i ocena fenotypów poprzez wstrzykiwanie DiI w preparatach typu open-book

Tutaj opisujemy test migracji komórek Schwanna (SC), w którym SC są w stanie rozwijać się wzdłuż rozszerzających się aksonów.

Analiza rozwoju mysich komórek Schwanna wzdłuż rosnących aksonów

Procesy rozwojowe, takie jak proliferacja, wzorzec, różnicowanie i prowadzenie aksonów, mogą być łatwo modelowane w rdzeniu kręgowym drobnicy danio pręgowanego.  W tym artykule opisujemy procedurę montowania zarodków danio pręgowanego, która optymalizuje wizualizację tych zdarzeń.

Rozwarstwienie i boczne dopasowanie zarodków danio pręgowanego: analiza rozwoju rdzenia kręgowego

Opisujemy tutaj użycie wrażliwego na pH wariantu białka zielonej fluorescencji, pHluorin, do badania czasoprzestrzennej dynamiki receptorów naprowadzania aksonów przemieszczających się na powierzchni komórki. Receptor znakowany pHluoryną ulega ekspresji zarówno w hodowli komórkowej, jak i in vivo, za pomocą elektroporacji zarodka pisklęcia.

Stosowanie pHluorin do oceny dynamiki receptorów kierowania aksonami w hodowli komórkowej i w zarodku piskląt

Płyta podłogowa jest kluczową strukturą rozwijającego się rdzenia kręgowego, dostarczającą dyfuzyjnych sygnałów do progenitorów i różnicujących neurony. Opisujemy metodę wytwarzania pożywki kondycjonowanej płytką podłogową, stosowania jej do świeżej tkanki rdzenia kręgowego oraz oceny wpływu na białka będące przedmiotem zainteresowania przez biochemię.

Hodowla izolowanej tkanki płytki podłogowej i produkcja kondycjonowanej pożywki w celu oceny właściwości funkcjonalnych sygnałów uwalnianych przez płytkę podłogową

Tutaj udostępniamy metodę analizy zachowania rosnących aksonów w matrycach 3D, naśladując ich naturalny rozwój.

Generowanie hydrożeli 3D na bazie kolagenu do analizy wzrostu i zachowania aksonów podczas rozwoju układu nerwowego

Test ex vivo pozwala na obrazowanie przerostu nerwu okoruchowego w czasie rzeczywistym. Plastry są generowane przez osadzenie zarodków E10.5 IslMN:GFP w agarozie, krojenie na wibratomie i wzrost w inkubatorze typu stage-top. Rolę szlaków naprowadzania aksonów ocenia się poprzez dodanie inhibitorów do pożywki hodowlanej.

Hodowla plastrów okulomotorycznych ex vivo od embrionalnych myszy z ekspresją GFP do obrazowania poklatkowego wzrostu nerwu okoruchowego

Poznaj metodę oceny zdolności BMP7 do reorientacji aksonów komisuralnych w eksplantatach grzbietowej części rdzenia kręgowego szczura przy użyciu immunohistochemii. Ta technika pozwala badać mechanizmy kierowania aksonami.

Ocena zdolności rozpuszczalnych cząsteczek sygnałowych do zmiany orientacji embrionalnych aksonów komisuralnych rdzenia kręgowego

Przeglądaj więcej filmów