Identyfikacja fenotypów zahamowania wzrostu indukowanych przez ekspresję efektorów bakteryjnych typu III w drożdżach

Aby rozpocząć ten protokół, wybierz wektor ekspresji swojego ulubionego efektora bakteryjnego. W drożdżach i szczepach drożdży wektor jest następnie przekształcany w komórki drożdży. Następna ekspresja efektora jest indukowana.

Indukowane komórki są poddawane lizie w celu późniejszej analizy western blot w celu sprawdzenia ekspresji efektora. Po potwierdzeniu ekspresji komórek efektorowych hoduje się i dziesięciokrotnie, seryjne rozcieńczanie jest nakrapiane na pożywki tłumiące i indukujące. Wreszcie po dwóch do trzech dniach analizuje się wzrost drożdży.

Cześć, nazywam się Do Solomon i pracuję w laboratorium dr Guido Cesa na Wydziale Nauk o Roślinach Uniwersytetu w Tel Awiwie. Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę identyfikacji fenotypów zahamowania wzrostu indukowanych ekspresją efektorów bakteryjnych typu trzy w drożdżach. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania funkcji efektorów typu trzeciego z bakterii chorobotwórczych Gram-ujemnych i jest narzędziem, które pomaga nam w identyfikacji efektorowych celów TIC.

Więc zacznijmy. Kilka ważnych czynników powinno być wziętych pod uwagę i zoptymalizowanych podczas projektowania systemu drożdży odpowiedniego do ekspresji interesujących efektorów typu trzeciego. Pierwszym z nich jest promotor napędzający ekspresję efektorów.

Ponieważ efektory bakteryjne typu trzeciego mogą być toksyczne dla komórek drożdży, do kontrolowania ich ekspresji należy stosować indukowalny promotor. W tym eksperymencie użyjemy promotora GAL one. Drugim czynnikiem jest liczba kopii genu efektorowego.

Wysokie poziomy ekspresji osiąga się, gdy gen efektorowy jest przenoszony przez plazmid o wielkości dwóch mikronów. Ekspresję pośrednią uzyskuje się za pomocą centromeru zawierającego plazmid, a niską ekspresję uzyskuje się, gdy gen efektorowy jest zintegrowany z genomem drożdży przez rekombinację homologiczną. Trzecim czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest znacznik epitopowy używany do weryfikacji ekspresji białka w przypadkach, gdy przeciwciała przeciwko efektorowi będącemu przedmiotem zainteresowania nie są dostępne.

Powszechnie stosowanymi znacznikami są M, hemaglutynina, HA lub flaga, na które dostępne są wiarygodne przeciwciała komercyjne. Sugerujemy użycie tylko jednej kopii znacznika, aby zminimalizować niepożądany szkodliwy wpływ na strukturę i aktywność białka efektorowego. Wreszcie, co nie mniej ważne, szczep drożdży, który ma być użyty do ekspresji, musi być tropikalny w stosunku do wybieralnego markera wektora ekspresji.

Aby wyhodować komórki drożdży do transformacji, wybierz kolonię drożdży ze świeżego talerza i zaszczep trzy mililitry YPD w 15-mililitrowym wirze rurki polipropylenowej. Na krótko umieść probówkę hodowlaną w walcu i inkubuj przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza ze stałą rotacją. Następnego ranka wyjmij kulturę z wałka i odwiruj w temperaturze 800 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po odwirowaniu całkowicie usuń supernatant i ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze buforu zawiesinowego Resus zmieszanego przez wirowanie z maksymalną prędkością przez około 10 sekund. Dla każdego plazmidu, który ma zostać przekształcony i dodatkowej transformacji kontrolnej, przenieś 100 mikrolitrów zawiesiny komórki do probówki z mikrofuge. Dodaj pięć mikrolitrów jednoniciowego nasienia łososia, DNA i 250 do 500 nanogramów DNA osocza do każdej probówki z wyjątkiem probówki kontrolnej.

Następnie ostrożnie dodaj 650 mikrolitrów roztworu transformacyjnego do każdej probówki i wiruj. Inkubować probówki w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez 30 minut na wałku. Po zakończeniu inkubacji dodaj 70 mikrolitrów DMSO do każdej probówki i wymieszaj, odwracając probówki od 10 do 15 razy, aby uniknąć pęknięcia komórek.

Nie obracaj rurek. Umieść probówki w ciepłej łaźni wodnej o temperaturze 42 stopni Celsjusza i inkubuj przez 15 minut. Po 15 minutach wyjmij probówki z łaźni wodnej i natychmiast umieść je na lodzie na dwie minuty.

Gdy probówki ostygną, zbierz komórki przez odwirowanie, a następnie użyj pipetera, aby ostrożnie usunąć lepki supernatant. Zawiesić każdą osadkę w 150 mikrolitrach sterylnej, podwójnie destylowanej wody i rozprowadzić zawiesinę komórkową na płytce z odpowiednią pożywką selektywną. Pozostaw płytki otwarte na dwie minuty i pozwól im wyschnąć w okapie z przepływem laminarnym.

Następnie umieść płytki w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza na dwa do trzech dni, aby wyhodować komórki drożdży. Aby przygotować ekstrakt białkowy, zaszczepić trzy mililitry odpowiedniej pożywki represyjnej kolonią drożdży ze świeżej płytki i wirować. Następnego dnia na krótko umieść probówkę hodowlaną w wałku w temperaturze 30 stopni Celsjusza.

Usunąć kulturę z wałka i odwirować w temperaturze 800 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej, odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy. W trzech mililitrach sterylnego DDW zmieszanego za pomocą wirówki wirowej, ponownie wyrzuć supernatant i ponownie zawieś komórki w trzech mililitrach sterylnego DDW. Teraz przenieś 200 mikrolitrów zawiesiny komórek do nowej 15-mililitrowej probówki zawierającej trzy mililitry odpowiedniego podłoża indukującego zmieszanego przez wirowanie.

Umieść probówkę w wałku i inkubuj przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza następnego ranka. Przenieś jeden mililitr lub więcej kultury w przypadku kultur o niskiej gęstości do mikroprobówki wirówkowej. Zbierz komórki przez odwirowanie w temperaturze 800 g przez pięć minut w temperaturze pokojowej, a następnie pracuj w dygestorium, aby uniknąć wdychania toksycznych oparów etanolu Beamer capto.

Ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipetera i ponownie zawiesić osad komórek w 100 mikrolitrach lodowatego roztworu do lizy. Mieszaj energicznie przez wirowanie i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Podczas 30-minutowej inkubacji oznaczyć objętość sześciu normalnych kwasów solnych potrzebną do rozdrobnienia 100 mikrolitrów buforu do lizy do pH od 9 do 10.

W tym celu należy dodać różne objętości kwasu solnego do 100 mikrolitrów buforu do lizy w 10 różnych probówkach i sprawdzić pH roztworu za pomocą paska wskaźnika pH pod koniec inkubacji w odpowiedniej objętości kwasu solnego do lizatu i wymieszać przez wirowanie. Następnie dodać 50 mikrolitrów trzech x bufor do próbki do lizatu i wymieszać przez wirowanie, nakłuć igłą otwór w pokrywie probówki do mikrofuge i gotować roztwór lizatu na bloku grzewczym przez pięć minut. Po ugotowaniu pozostaw roztwór do ostygnięcia przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Następnie zmieszaj roztwór lizatu i wiruj go przez 10 sekund. Lisat jest teraz gotowy do analizy immunologicznej krwi w celu przygotowania komórek do testu plamienia. Wyhoduj trzy mililitrowe kultury każdego szczepu, jak pokazano wcześniej następnego dnia.

Przygotować dwie płytki zawierające kompletną pożywkę syntetyczną bez leucyny. Pożywkę z jednej płytki należy uzupełnić 2% glukozy, a drugą płytkę 2% aktozy i 1% rafinozy. Suszyć płytki w sterylnym okapie z przepływem laminarnym w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Zbierz komórki i ponownie zawieś każdą osadkę komórkową w trzech mililitrach sterylnego DDW. Powtórz etap wirowania i ponownie zawieś komórki w trzech mililitrach sterylnego DDW. Określić gęstość optyczną lub OD każdej hodowli, a następnie przygotować jednomililitrowe zawiesiny komórek z OD 600 lub jedną w sterylnych probówkach z mikrofisz.

Następnie przygotuj trzy dziesięciokrotne seryjne rozcieńczenia z każdej z zawiesin komórkowych za pomocą trzech sterylnych mikroprobówek wypełnionych 900 mikrolitrami sterylnego DDW. Umieść suche płytki na siatce i na każde miejsce hodowlane 10 mikrolitrów z czterech rozcieńczeń z rzędu. Po zauważeniu pozostaw płytki otwarte w kapturze na kilka minut.

Gdy plamy wyschną, przykryj płytki i umieść je w inkubatorze o temperaturze 30 stopni Celsjusza na dwa do trzech dni. Teraz pokażemy wyniki testu plamienia drożdży w celu wykrycia zahamowania wzrostu. Fenotypy indukowane przez ekspresję efektorów typu trzeciego tutaj, efektorów typu trzeciego, A-V-R-P-T-O hop, AA jeden jeden i AAV RE jeden z bakterii.

Ścieżka Pseudomona Riner naszego pomidora uległa ekspresji z centromeru zawierającego plazmid w szczepie drożdży na represjonujących szczepach drożdży zawierających plazmid do ekspresji A-V-R-P-T-O i HOP AA, z których jeden wykazywał podobny wzrost jak szczep kontrolny zawierający pusty wektor. Podczas gdy drożdże przenoszące AAV RE one wykazywały nieznacznie zmniejszony wzrost, prawdopodobnie z powodu wycieku promotora GAL one i wysokiej cytotoksyczności AV RE one, w warunkach indukujących ekspresja AV E one lub HOP AA one powodowała drastyczny fenotyp zahamowania wzrostu, odzwierciedlony przez brak kolonii w jakimkolwiek rozcieńczeniu. W przeciwieństwie do tego, ekspresja A-V-R-P-T-O nie wywierała żadnego działania hamującego wzrost.

Właśnie pokazaliśmy, jak zidentyfikować fenotypy zahamowania wzrostu spowodowane ekspresją efektorów bakteryjnych typu trzeciego w drożdżach. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać, aby starannie wybrać wektor ekspresji, a także ten szczep, ponieważ oba mogą dramatycznie wpłynąć na wyniki. Ponadto należy pamiętać o użyciu świeżo przekształconych tych kolonii na wszystkich etapach zabiegu.

Więc to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.