Identyfikacja fenotypów hamowania wzrostu indukowanych przez ekspresję bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach

Aby rozpocząć ten protokół, należy wybrać wektor do ekspresji wybranego efektora bakteryjnego. W przypadku drożdży oraz szczepów drożdży wektor ten jest następnie transformowany do komórek drożdży. Następnie indukuje się ekspresję efektora.

Zindukowane komórki poddaje się lizie w celu przeprowadzenia późniejszej analizy western blot, aby zweryfikować ekspresję efektora. Po potwierdzeniu ekspresji efektora komórki są hodowane, a następnie ich dziesięciokrotne rozcieńczenia szeregowe są nanoszone na podłoża represyjne i indukcyjne. Ostatecznie, po dwóch do trzech dniach, analizowany jest wzrost drożdży.

Witajcie, nazywam się Do Solomon i pracuję w laboratorium dr. Guido Cesy na Wydziale Nauk o Roślinach Uniwersytetu w Tel Awiwie. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę identyfikacji fenotypów zahamowania wzrostu wywołanych ekspresją bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania funkcji efektorów typu III pochodzących z gram-ujemnych bakterii patogennych; jest ona narzędziem, które pomaga nam w identyfikacji celów TIC efektora.

Zacznijmy zatem. Projektując system drożdżowy odpowiedni do ekspresji interesujących nas efektorów typu trzeciego, należy wziąć pod uwagę i zoptymalizować kilka istotnych czynników. Pierwszym z nich jest promotor sterujący ekspresją efektorów.

Ponieważ bakteryjne efektory typu trzeciego mogą być toksyczne dla komórek drożdży, do kontroli ich ekspresji należy użyć promotora indukowalnego. W tym eksperymencie zastosujemy promotor GAL1. Drugim czynnikiem jest liczba kopii genu efektora.

Wysoki poziom ekspresji uzyskuje się w przypadku, gdy gen efektora jest przenoszony przez plazmid 2 µm. Ekspresję pośrednią uzyskuje się przy użyciu plazmidu zawierającego centromer, natomiast niską ekspresję osiąga się, gdy gen efektora zostanie zintegrowany z genomem drożdży poprzez rekombinację homologiczną. Trzecim czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest znacznik epitopowy wykorzystywany do weryfikacji ekspresji białka w przypadkach, gdy niedostępne są przeciwciała przeciwko badanemu efektorowi.

Najczęściej stosowanymi znacznikami są hemaglutynina HA lub flag, do których dostępne są wiarygodne przeciwciała komercyjne. Sugerujemy stosowanie tylko jednej kopii znacznika, aby zminimalizować niepożądane, szkodliwe efekty wpływające na strukturę i aktywność białka efektorowego. Ostatnim, lecz równie ważnym elementem jest to, aby szczep drożdży użyty do ekspresji był tropowy w odniesieniu do markera selekcyjnego wektora ekspresyjnego.

Aby wyhodować komórki drożdży do transformacji, należy pobrać kolonię drożdży ze świeżej płytki i zaszczepić 3 ml pożywki YPD w 15 ml polipropylenowej probówce, a następnie wymieszać na wirówce typu vortex. Probówkę z kulturą należy na krótko umieścić w walcarku i inkubować przez noc w temperaturze 30 °C przy stałej rotacji. Następnego ranka kulturę należy wyjąć z walcarka i odwirować przy 800 G przez 5 minut w temperaturze pokojowej.

Po wirowaniu całkowicie odlej nadsącz i resuspenduj komórki w 1 ml buforu do resuspensji Resus, mieszając na wirówce typu vortex z maksymalną prędkością przez około 10 s. Dla każdego plazmidu przeznaczonego do transformacji oraz dla dodatkowej transformacji kontrolnej przenieś 100 µl zawiesiny komórkowej do probówki do mikrocentryfugi. Do każdej probówki, z wyjątkiem probówki kontrolnej, dodaj 5 µl jednoniciowego DNA nasienia łososia oraz od 250 do 500 ng DNA plazmidowego.

Następnie ostrożnie dodaj 650 µL roztworu do transformacji do każdej probówki i wymieszaj w wstrząsarku typu vortex. Inkubuj probówki w temperaturze 30 °C przez 30 minut na walcarku. Po zakończeniu inkubacji dodaj 70 µL DMSO do każdej probówki i wymieszaj, odwracając probówki od 10 do 15 razy, aby uniknąć rozbicia komórek.

Nie wstrząsać probótek w wirówce typu vortex. Umieścić probótki w łaźni wodnej wstępnie podgrzanej do 42 °C i inkubować przez 15 minut. Po 15 minutach wyjąć probótki z łaźni wodnej i natychmiast umieścić je w lodzie na dwie minuty.

Po ostygnięciu probówek należy zebrać komórki poprzez wirowanie, a następnie za pomocą pipety ostrożnie usunąć lepki nadsącz. Każdy osad należy resuspender w 150 µl sterylnej wody dwukrotnie destylowanej i rozsiać zawiesinę komórkową na płytce z odpowiednią pożywką selektywną. Płytki należy pozostawić otwarte przez dwie minuty, aby wyschły w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

Następnie płytki należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 30 °C na dwa do trzech dni w celu hodowli komórek drożdży. W celu przygotowania ekstraktu białkowego należy zaszczepić 3 mL odpowiedniego medium represyjnego kolonią drożdży ze świeżej płytki i wymieszać na wirówce vortex. Następnego dnia probówkę z kulturą należy umieścić na krótko w inkubatorze obrotowym w temperaturze 30 °C.

Zdjąć kulturę z rollera i wirować przy 800 Gs przez pięć minut w temperaturze pokojowej, odrzucić nadsącz i zawiesić ponownie osad komórkowy. W trzech mililitrach sterylnej wody DDW wymieszać za pomocą wortexa i ponownie wirować, odrzucić nadsącz i zawiesić komórki w trzech mililitrach sterylnej wody DDW. Następnie przenieść 200 µL zawiesiny komórkowej do nowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej trzy mililitry odpowiedniego pożywki indukcyjnej i wymieszać za pomocą wortexa.

Umieść probówkę w walcarku i inkubuj przez noc w temperaturze 30 °C. Następnego ranka przenieś 1 mL hodowli (lub więcej w przypadku hodowli o niskiej gęstości) do probówki do mikrocentryfugi. Zbierz komórki poprzez wirowanie przy 800 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej; od tego momentu pracuj w dygestorium, aby uniknąć wdychania toksycznych oparów etanolu z Beamer capto.

Ostrożnie usuń nadsącz za pomocą pipety i ponownie zawieś osad komórkowy w 100 µL lodowatego roztworu lizującego. Wymieszaj energicznie w wirówce typu vortex i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Podczas 30-minutowej inkubacji określ objętość kwasu solnego w stężeniu 6 N wymaganą do miareczkowania 100 µL buforu lizującego do pH od 9 do 10.

Aby to zrobić, należy dodać różne objętości kwasu solnego do 100 µL buforu do lizy w 10 różnych probówkach, a następnie sprawdzić pH roztworu za pomocą paska wskaźnika pH po zakończeniu inkubacji przy odpowiedniej objętości kwasu solnego dodanego do lizatu i wymieszać go za pomocą wortexa. Następnie do lizatu należy dodać 50 µL trzykrotnego buforu do próbek i wymieszać za pomocą wortexa, wykonać igłą otwór w zakrętce probówki do wirówki i gotować roztwór lizatu na bloku grzewczym przez pięć minut. Po gotowaniu należy pozostawić roztwór do ochłodzenia przez dwie minuty w temperaturze pokojowej.

Następnie należy wymieszać roztwór lizatu w wirówce vorex i odwirować go przez 10 sekund. Lizat jest teraz gotowy do immunologicznej analizy krwi w celu przygotowania komórek do testu plamkowego (spotting assay). Następnego dnia należy wyhodować kultury każdego szczepu o objętości trzech mililitrów, zgodnie z wcześniejszym opisem.

Przygotuj dwie płytki zawierające syntetyczną pożywkę kompletną bez leucyny. Pożywka na jednej płytce powinna być uzupełniona o 2% glucose, a na drugiej o 2% actose i 1% raffinose. Osusz płytki w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej przez 20 minut.

Zebierz komórki i zawieś każdy osad komórkowy w trzech mililitrach sterylnej DDW. Powtórz etap wirowania i ponownie zawieś komórki w trzech mililitrach sterylnej DDW. Wyznacz gęstość optyczną (OD) każdej hodowli, a następnie przygotuj w sterylnych probówkach mikrocentryfużkowych zawiesiny komórkowe o objętości jednego mililitra z OD 600 równym 1.

Następnie przygotuj trzy dziesięciokrotne rozcieńczenia szeregowe z każdej z zawiesin komórkowych, wykorzystując trzy sterylne mikroprobówki wypełnione 900 µl sterylnej DDW. Umieść suche płytki na siatce i dla każdej kultury nanieś 10 µl z czterech rozcieńczeń w jednym rzędzie. Po naniesieniu próbek pozostaw płytki otwarte w komorze z laminarem przez kilka minut.

Po wyschnięciu plamek przykryć płytki i umieścić je w inkubatorze w temperaturze 30 °C na dwa do trzech dni. Przedstawiamy teraz wyniki testu plamkowego na drożdżach w celu wykrycia zahamowania wzrostu. Fenotypy wywołane ekspresją efektorów typu trzeciego – w tym przypadku efektorów typu trzeciego AvrPto hop, AvrAA1 i AvrRe1 bakterii.

Białka Pseudomonas syringae z patogenu pomidora zostały wykazane z plazmidu zawierającego centromer w szczepie drożdży na podłożu represyjnym. Szczepy drożdży niosące plazmid do ekspresji AVRpto oraz HopAA1 wykazywały wzrost podobny do szczepu kontrolnego zawierającego pusty wektor. Podczas gdy drożdże niosące AvrRpt2 wykazały nieco zredukowany wzrost, prawdopodobnie z powodu nieszczelności promotora GAL1 i wysokiej cytotoksyczności AvrRpt2, w warunkach indukujących ekspresja AvrRpt2 lub HopAA1 spowodowała drastyczny fenotyp hamowania wzrostu, objawiający się brakiem kolonii w każdym rozcieńczeniu. W przeciwieństwie do tego ekspresja AVRpto nie wywarła żadnego hamującego wpływu na wzrost.

Właśnie przedstawiliśmy sposób identyfikacji fenotypów hamowania wzrostu wywołanych ekspresją bakteryjnych efektorów typu trzeciego w drożdżach. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby starannie dobrać wektor ekspresyjny oraz szczep, ponieważ oba te elementy mogą znacząco wpłynąć na wyniki. Ponadto należy pamiętać o wykorzystaniu świeżo transformowanych kolonii na wszystkich etapach procedury.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w przeprowadzaniu doświadczeń.