Name: Identyfikacja fenotypów zahamowania wzrostu indukowanych przez ekspresję efektorów bakteryjnych typu III w drożdżach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-30T16:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Poznaj metodę ekspresji bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach i identyfikacji fenotypów zahamowania wzrostu. Technika ta umożliwia badanie funkcji efektorów w modelu eukariotycznym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez Izraelską Fundację Naukową (Israel Science Foundation).

I. Projektowanie systemu ekspresji drożdżowej dla efektorów typu III
Kalibracja systemu drożdżowego odpowiedniego do ekspresji interesujących efektorów typu III jest istotnym zadaniem i może wymagać pewnych prób i błędów. Czynniki o kluczowym znaczeniu, które należy rozważyć i zoptymalizować podczas projektowania takiego systemu, to: 1) promotor sterujący ekspresją efektora(ów), 2) liczba kopii genu efektora, 3) znacznik epitopowy użyty do weryfikacji ekspresji białka oraz 4) szczep drożdży.
1) Promotor
Ponieważ bakteryjne efektory typu III mogą być toksyczne dla komórek drożdży, do kontrolowania ich ekspresji należy użyć promotora indukowalnego. W tym celu powszechnie stosuje się promotor GAL1, którego aktywność jest regulowana przez źródło węgla obecne w pożywce: jest on represowany przez glukozę i indukowany przez galaktozę. Zgłaszano jednak, że promotor ten wykazuje niewielką nieszczelność w warunkach represji, co prowadzi do niepożądanej toksyczności. W przypadku wystąpienia podobnego problemu zaleca się zminimalizowanie liczby kopii genu efektora, zgodnie z opisem poniżej, lub zastosowanie alternatywnych promotorów indukowalnych, takich jak promotory MET3 lub CUP11. W niniejszej pracy opisujemy procedury ekspresji białek efektorowych z promotora indukowalnego galaktozą.
2) Liczba kopii genu
Dodatkowym parametrem wpływającym na poziom ekspresji białka jest liczba kopii genu efektora obecnych w komórce. Wysokie poziomy ekspresji osiąga się, gdy gen efektora jest przenoszony przez plazmid 2-mikronowy (40-60 kopii na komórkę). Pośrednią ekspresję uzyskuje się poprzez zastosowanie plazmidu zawierającego centromer (1-3 kopie na komórkę), natomiast niską ekspresję osiąga się, gdy gen efektora zostanie zintegrowany z genomem drożdży poprzez rekombinację homologiczną. Łącząc wektor zawierający centromer z promotorem GAL1, pomyślnie wyekspresowaliśmy około 50 efektorów patogenów roślin Xanthomonas campestris pv. vesicatoria oraz Pseudomonas syringae pv. tomato na poziomach wykrywalnych w analizie immunoblottingowej i z pomijalnym przeciekiem w warunkach represyjnych (Salomon i Sessa, niepublikowane).
3) Znacznik epitopowy
Jeśli przeciwciała przeciwko badanemu efektorowi nie są dostępne, do białka efektorowego przyłącza się znacznik epitopowy, aby monitorować jego ekspresję za pomocą immunoblottingu. Powszechnie stosowane znaczniki to Myc, hemaglutynina (HA) lub Flag, do których dostępne są niezawodne przeciwciała komercyjne. Sugerujemy stosowanie tylko jednej kopii znacznika, aby zminimalizować niepożądane, szkodliwe efekty wpływające na strukturę i aktywność białka efektorowego.
4) Szczep drożdży
Podstawowym wymaganiem dla szczepu drożdży wykorzystywanego do ekspresji jest auksotrofia w odniesieniu do markera selekcyjnego wektora ekspresyjnego. Należy zauważyć, że różne szczepy drożdży mogą wykazywać różną wrażliwość na ekspresję określonych efektorów. Na przykład zaobserwowano, że szczepy BY4741 i W303 wykazują różną wrażliwość na kilka efektorów Xanthomonas campestris pv. vesicatoria (Salomon i Sessa, nieopublikowane). Dlatego też zaleca się testowanie interesujących efektorów w różnych szczepach drożdży.
II. Przygotowanie pożywek dla drożdży
Do hodowli szczepów drożdży niezawierających wektora należy używać pożywki YPD (10 g/L ekstraktu drożdżowego, 20 g/L peptonu i 2% [w/v] glukozy). W przypadku pożywek stałych do roztworu należy dodać 2% [w/v] agaru (jeśli pożywka stała jest zbyt miękka, przed autoklawowaniem do pożywki należy dodać 0,05% [v/v] z roztworu stokowego 5 N NaOH). Zaleca się przygotowanie pożywki bez glukozy w 90% objętości końcowej i jej autoklawowanie. Tuż przed użyciem objętość należy uzupełnić do 100% za pomocą filtrowanego sterylnie 20% [w/v] roztworu glukozy (roztwór 20% glukozy należy przechowywać w temperaturze 4°C, aby zapobiec kontaminacji).
Do hodowli szczepów drożdży zawierających wektor zapewniający prototrofię dla markera selekcyjnego (leucyny, uracylu, histydyny lub tryptofanu), należy użyć syntetycznej pożywki drop-out bez leucyny, uracylu, histydyny i tryptofanu (6,7 g/L yeast nitrogen base bez aminokwasów, 1,4 g/L yeast synthetic drop-out medium supplement) zawierającej 2% [w/v] glukozy lub 2% [w/v] galaktozy i 1% [w/v] rafinozy. W celu przygotowania pożywek stałych do roztworu należy dodać 2% [w/v] agaru. Zaleca się przygotowanie pożywki w 90% objętości końcowej i jej autoklawowanie. Krótko przed użyciem objętość należy uzupełnić do 100% za pomocą filtrowanego sterylnie 20% roztworu glukozy lub filtrowanego sterylnie roztworu 20% galaktozy + 10% rafinozy, w zależności od pożądanego źródła węgla (roztwory 20% glukozy oraz 20% galaktozy + 10% rafinozy należy przechowywać w 4°C, aby zapobiec kontaminacji). W zależności od markera selekcyjnego wektora ekspresyjnego, przed użyciem należy dodać pozostałe aminokwasy lub uracyl (10 ml/L z roztworu zapasowego leucyny 1 g/100 ml, 10 ml/L z roztworu zapasowego uracylu 200 mg/100 ml, 2 ml/L z roztworu zapasowego histydyny 1 g/100 ml lub 2 ml/L z roztworu zapasowego tryptofanu 1 g/100 ml). Roztwory zapasowe leucyny i uracylu należy sterylizować w autoklawie i przechowywać w temperaturze pokojowej. Roztwory zapasowe histydyny i tryptofanu należy sterylizować przez filtrowanie, owinąć butelkę folią aluminiową w celu ochrony przed światłem i przechowywać w 4°C. W procedurach opisanych poniżej syntetyczna pożywka drop-out uzupełniona o leucynę, uracyl, histydynę i tryptofan jest określana jako syntetyczna pożywka kompletna (synthetic complete medium).
Płytki z podłożem stałym można przechowywać do dwóch miesięcy w temperaturze 4°C. Przed użyciem należy osuszyć płytki przez 20 min w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej.
III. Transformacja drożdży
<ol>
<li>Przed rozpoczęciem procedury transformacji drożdży należy przygotować trzy następujące roztwory: 50% [w/v] roztwór glikolu polietylenowego (PEG) 3350, 1 M roztwór LiAc o pH=8,0 oraz roztwór TE (100 mM Tris pH=6,85 i 10 mM EDTA pH=8,0). Roztwory należy wysterylizować poprzez filtrację i przechowywać w temperaturze 4°C.
</li><li>Używając długiego drewnianego patyczka lub sterylnej pętli do szczepień, należy pobrać kolonię drożdży (o średnicy 1-2 mm) ze świeżonej płytki i zaszczepić do 3 ml pożywki YPD w 15 ml probówce polipropylenowej. Próbkę należy krótko wymieszać na wortexie. Probówkę z kulturą należy umieścić w rotatorze i inkubować przez noc w temperaturze 30°C przy ciągłej rotacji.
</li><li>Rano należy wyjąć kulturę z rotatora i odwirować przy 800 g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu należy całkowicie usunąć supernatat.
</li><li>Komórki należy zawiesić w 1 ml buforu do resuspensji (10% [v/v] roztwór TE, 10% [v/v] roztwór 1 M LiAc) i wymieszać za pomocą wortexa. 
</li><li>Dla każdego plazmidu przeznaczonego do transformacji oraz dla dodatkowej transformacji kontrolnej należy przenieść 100 μl zawiesiny komórkowej do mikroprobówki.
</li><li>Do każdej probówki należy dodać 5 μl jednoniciowego DNA z plemników łososia (10 mg/ml) oraz 250-500 ng plazmidowego DNA do transformacji (z wyjątkiem probówki kontrolnej).
</li><li>Do każdej probówki należy ostrożnie dodać 650 μl roztworu do transformacji (10% [v/v] roztwór TE, 10% [v/v] roztwór 1 M LiAc, 80% [v/v] roztworu 50% [w/v] PEG) i wymieszać na wortexie.
</li><li>Inkubować w temperaturze 30°C przez 30 min na rotatorze.
</li><li>Wyjąć probówki z rotatora, dodać 70 μl DMSO i wymieszać poprzez odwrócenie probówek 10-15 razy (nie używać wortexa, aby uniknąć rozbicia komórek).
</li><li>Umieścić probówki w kąpieli wodnej uprzednio ogrzanej do 42°C i inkubować przez 15 min.
</li><li>Wyjąć probówki z kąpieli wodnej i natychmiast umieścić je na lodzie na 2 min. 
</li><li>Po ochłodzeniu probówek należy je odwirować przy 800 g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
</li><li>Wyjąć probówki z mikrowirówki i ostrożnie usunąć lepki supernatat za pomocą pipety.
</li><li>Osad komórkowy z każdej probówki należy resuspenderować w 150 μl sterylnej podwójnie destylowanej wody (DDW), a następnie wysiać zawiesinę komórkową na płytkę z syntetycznym medium kompletnym zawierającym 2% glukozy jako źródła węgla, pozbawioną aminokwasu lub nukleotydu, dla którego plazmid zapewnia prototrofię.
</li><li>Pozostawić płytki otwarte przez 2 min i pozwolić im wyschnąć w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Płytki należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 30°C na dwa lub trzy dni.
</li><li>Po pojawieniu się kolonii (o średnicy 1-2 mm) na płytkach należy pobrać około 10 pojedynczych kolonii z każdej transformacji i przenieść je na świeżą płytkę. Podczas przenoszenia kolonii należy tworzyć plamy o wymiarach 2 cm x 2 cm, aby umożliwić wzrost dużej ilości komórek drożdży. Płytki należy inkubować w inkubatorze w temperaturze 30°C przez dwa dni.
</li><li>Po wyrośnięciu plam drożdży należy wyjąć płytki z inkubatora i uszczelnić je parafilmem. Płytki można przechowywać w temperaturze 4°C. Kolonie należy przenosić na świeżą płytkę co 10-14 dni.</li>
</ol>
IV. Przygotowanie ekstraktu białkowego z drożdży w celu weryfikacji ekspresji efektora za pomocą immunoblottingu
<ol>
<li>Pobrać kolonię drożdży (o średnicy 1-2 mm) ze świeżej płytki do probówki z polipropylenu o pojemności 15 ml zawierającej 3 ml odpowiedniej syntetycznej pożywki kompletnej uzupełnionej o 2% glukozy jako źródła węgla i pozbawionej aminokwasu lub nukleotydu, dla którego wybrany plazmid zapewnia prototrofię. Umieścić probówkę z kulturą w walcarku i inkubować przez noc w temperaturze 30°C. 
</li><li>Następnego dnia wyjąć kulturę z walcarka i odwirować przy 800 g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Wyjąć probówki z wirówki i odrzucić nadsącz.
</li><li>Resuspendować osad komórkowy w 3 ml sterylnej wody DDW i wymieszać za pomocą wortexa.
</li><li>Ponownie odwirować, odrzucić nadsącz i resuspendować komórki w 3 ml sterylnej wody DDW.
</li><li>Przenieść 200 μl zawiesiny komórkowej do nowej probówki 15 ml zawierającej 3 ml syntetycznej pożywki kompletnej uzupełnionej o 2% galaktozy i 1% rafinozy jako źródła węgla, oraz pozbawionej aminokwasu lub nukleotydu, dla którego wybrany plazmid zapewnia prototrofię. Wymieszać za pomocą wortexa, umieścić w walcarku i inkubować przez noc w temperaturze 30°C.
</li><li>Następnego ranka przenieść 1 ml kultury (lub więcej w przypadku kultur o niskiej gęstości) do mikroprobówki. Zebrać komórki poprzez wirowanie przy 800 g przez 5 min w temperaturze pokojowej. 
</li><li>Od tego momentu pracować pod wyciągiem, aby uniknąć wdychania toksycznych oparów β-merkaptoetanolu. Ostrożnie usunąć nadsącz za pomocą pipety i resuspendować osad komórkowy w 100 μl lodowatego roztworu lizującego (4% [v/v] 5 N NaOH, 0,5% [v/v] β-merkaptoetanol). Intensywnie wymieszać za pomocą wortexa i inkubować na lodzie przez 30 min.
</li><li>Podczas inkubacji określić objętość HCl (6 N) wymaganą do miareczkowania 100 μl buforu lizującego do pH 9-10. W tym celu umieścić 10 mikroprobówek w statywie i przenieść do każdej z nich 100 μl buforu lizującego. Do każdej probówki dodać różne objętości (1-10 μl) HCl (6 N) i wymieszać za pomocą wortexa. Pobrać próbkę i sprawdzić pH roztworu za pomocą papierka wskaźnikowego pH.
</li><li>Po zakończeniu inkubacji dodać do lizatu objętość HCl wyznaczoną w poprzednim kroku i wymieszać za pomocą wortexa (dla lepszej dokładności nalać roztwór HCl po ściance probówki, nie wprowadzając końcówki pipety bezpośrednio do lizatu).
</li><li>Do lizatu dodać 50 μl 3x buforu do próbek (30% [v/v] glicerol, 15% [v/v] β-merkaptoetanol, 37,5% [v/v] 500 mM Tris-HCl pH=6,8, 0,15% [w/v] dodecylosiarczan sodu [SDS] i kilka ziarenek błękitu bromofenolowego) i wymieszać za pomocą wortexa (jeśli roztwór stanie się żółty, oznacza to, że pH jest zbyt niskie i należy dodać kilka mikrolitrów roztworu lizującego, aż roztwór stanie się niebieski).
</li><li>Gotować roztwór lizatu przez 5 min na bloku grzejnym po uprzednim przebiciu igłą nakrętki mikroprobówki.
</li><li>Wyjąć mikroprobówkę z bloku grzejnego i pozwolić roztworowi ostygnąć przez 2 min w temperaturze pokojowej.
</li><li>Wymieszać roztwór lizatu na wortexie, a następnie odwirować przez 10 s. Nanieść 30 μl na żel SDS-PAGE do analizy immunoblot.</li>
</ol>
V. Test kropelkowy do wykrywania fenotypów hamowania wzrostu indukowanego przez efektory
<ol>
<li>Z nowej płytki wybierz kolonię drożdży (średnica 1-2 mm) zawierającą interesujący plazmid ekspresyjny i zaszczep ją do 3 ml syntetycznego podłoża kompletnego w probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml, uzupełnionego o 2% glukozy jako źródła węgla i pozbawionego aminokwasu lub nukleotydu, dla którego plazmid ekspresyjny zapewnia prototrofię. Powtórz tę samą procedurę dla kontrolnego szczepu drożdży zawierającego pusty plazmid. Umieść probówki z kulturami w walcaku i inkubuj przez noc w temperaturze 30°C przy stałym obrotowaniu. 

</li><li>Następnego dnia wyjmij kultury z walcaka i odwiruj przy 800 g przez 5 min w temperaturze pokojowej. Wyjmij probówki z wirówki i odlej supernatant.
</li><li>Resuspenduj osad komórkowy w 3 ml sterylnej wody destylowanej (DDW) i wymieszaj za pomocą wortexa.
</li><li>Powtórz etap wirowania i ponownie resuspenduj komórki w 3 ml sterylnej DDW.
</li><li>Aby oznaczyć gęstość optyczną (OD), przenieś 100 μl każdej kultury do mikroprobówki zawierającej 900 μl DDW i wymieszaj wortexem. Przelej zawartość probówek do plastikowej kuwety i zmierz absorbancję przy długości fali 600 nm (jako referencję wykorzystaj kuwetę wypełnioną 1 ml DDW). Oblicz OD600 kultur wyjściowych, mnożąc OD600 kultur w kuwecie przez czynnik rozcieńczenia wynoszący 10. 
</li><li>Następnie, w oparciu o OD600 kultur wyjściowych, przygotuj w sterylnych mikroprobówkach zawiesiny komórkowe (1 ml) o OD600=1.0.
</li><li>Używając 3 sterylnych mikroprobówek wypełnionych 900 μl sterylnej DDW, przygotuj trzy 10-krotne rozcieńczenia seryjne (OD600=0.1, 0.01 i 0.001) z każdej zawiesiny komórkowej (OD600=1.0) przygotowanej w poprzednim kroku.
</li><li>Przygotuj dwie płytki zawierające syntetyczne podłoże kompletne bez aminokwasu lub nukleotydu, dla którego wybrany plazmid zapewnia prototrofię. Podłoże na jednej płytce powinno być uzupełnione o 2% glukozy, a na drugiej o 2% galaktozy i 1% rafinozy. Osusz płytki w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej przez 20 min i umieść je na kratce.
</li><li>Dla każdej kultury nanieś kropką (spotting) po 10 μl z czterech rozcieńczeń w rzędzie, zarówno na podłoże represyjne, jak i indukcyjne.
</li><li>Po naniesieniu próbek pozostaw płytki otwarte w komorze przez kilka minut. Gdy plamki wyschną, przykryj płytki i umieść je w inkubatorze w temperaturze 30°C na 2-3 dni. 
</li><li>Po inkubacji wyjmij płytki i przeanalizuj wzrost drożdży. Najpierw potwierdź, że gęstość komórek jest podobna na płytce z podłożem represyjnym. Następnie porównaj wzrost kultury ekspresyjącej interesujące białko efektorowe z kulturą zawierającą pusty wektor na płytce z podłożem indukcyjnym. Uwaga: efektory mogą oddziaływać na procesy komórkowe, które nie ograniczają szybkości wzrostu drożdży w standardowych laboratoryjnych warunkach hodowli. Aby umożliwić identyfikację fenotypów hamowania wzrostu dla takich efektorów, podłoża indukcyjne można uzupełnić związkami zmieniającymi funkcje komórkowe drożdży, zwiększając tym samym ich wrażliwość na efektory. Listę substancji chemicznych, które można włączyć do tej procedury, znajdziesz w pracy Parsons et al. (2004)2.</li>
</ol>
VI. Reprezentatywne wyniki
Przedstawicielowy test plamkowy na drożdżach oraz detekcja fenotypów hamowania wzrostu wywołanych ekspresją efektorów typu III przedstawiono na Ryc. 1. W tym eksperymencie efektory typu III AvrPto, HopAA1-1 i AvrE1 Gram-ujemnej bakterii fitopatogennej Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst) wyekspresowano z plazmidu pGML10 zawierającego centromer w szczepie drożdży BY4741, a następnie przetestowano ich zdolność do hamowania wzrostu drożdży. Poszczególne kultury drożdży wykazujące ekspresję efektorów typu III Pst pod kontrolą indukowalnego galaktozą promotora GAL1 lub zawierające pusty wektor poddano rozcieńczeniom seryjnym i wysiano na podłoża represyjne (glukoza) lub indukcyjne (galaktoza) (Ryc. 1). Na podłożu represyjnym szczepy drożdży niosące plazmidy do ekspresji AvrPto i HopAA1-1 wykazały wzrost podobny do szczepu kontrolnego zawierającego pusty wektor. Jednak na tym samym podłożu drożdże niosące AvrE1 wykazały nieco ograniczony wzrost, co prawdopodobnie wynika z pewnego stopnia nieszczelności promotora GAL1 oraz wysokiego efektu cytotoksycznego AvrE1. W warunkach indukcyjnych ekspresja efektora AvrE1 spowodowała drastyczny fenotyp hamowania wzrostu, objawiający się brakiem kolonii w każdym rozcieńczeniu. Jak wcześniej zaobserwowano przez Munkvolda i współpracowników3, ekspresja HopAA1-1 również doprowadziła do silnego hamowania wzrostu, podczas gdy AvrPto nie wywołało żadnego efektu.
<img src="/files/ftp_upload/1865/1865fig1.jpg" alt="Schemat testu wzrostu bakterii na płytkach z glukozą i galaktozą; porównanie serii rozcieńczeń." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Hamowanie wzrostu drożdży spowodowane ekspresją efektorów typu III AvrE1 i HopAA1-1 z Pseudomonas syringae pv. tomato (Pst). Szczepy drożdży (BY4741) zawierające plazmid pGML10, pusty lub niosący kasety pod promotorem GAL1 dla indukowanej galaktozą ekspresji AvrPto, HopAA1-1 lub AvrE1, hodowano przez noc w syntetycznym medium kompletnym uzupełnionym o glukozę (2%) jako źródło węgla i pozbawionym leucyny. Kultury przemyto, znormalizowano do OD600=1,0, a następnie naniesiono seryjne 10-krotne rozcieńczenia na syntetyczne kompletne podłoża stałe pozbawione leucyny i zawierające glukozę (2%) lub galaktozę (2%) i rafinozę (1%). Zdjęcia wykonano po 2 i 3 dniach wzrostu w temperaturze 30°C odpowiednio dla drożdży rosnących na podłożach z glukozą i galaktozą.

<ol><li>Siggers, K. A., Lesser, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%3A+a+versatile+model+system+for+the+identification+and+characterization+of+bacterial+virulence+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">The yeast Saccharomyces cerevisiae: a versatile model system for the identification and characterization of bacterial virulence proteins.</a> Cell Host Microbe. 4, 8-15 (2008).</li>
<li>Parsons, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+chemical-genetic+and+genetic+interaction+data+links+bioactive+compounds+to+cellular+target+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integration of chemical-genetic and genetic interaction data links bioactive compounds to cellular target pathways.</a> Nat. Biotechnol. 22, 62-69 (2004).</li>
<li>Munkvold, K. R., Martin, M. E., Bronstein, P. A., Collmer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+the+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+type+III+secretion+system+effector+repertoire+reveals+several+effectors+that+are+deleterious+when+expressed+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant-Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">A survey of the Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion system effector repertoire reveals several effectors that are deleterious when expressed in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol. Plant-Microbe Interact. 21, 490-502 (2008).</li>
<li>Curak, J., Rohde, J., Stagljar, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+as+a+tool+to+study+bacterial+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Yeast as a tool to study bacterial effectors.</a> Curr. Opin. Microbiol. 12, 18-23 (2009).</li>
<li>Slagowski, N. L., Kramer, R. W., Morrison, M. F., LaBaer, J., Lesser, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+genomic+yeast+screen+to+identify+pathogenic+bacterial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">A functional genomic yeast screen to identify pathogenic bacterial proteins.</a> PLoS Pathog. 4, e9-e9 (2008).</li>
<li>Huang, J., Lesser, C. F., Lory, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+role+of+the+CopN+protein+in+Chlamydia+pneumoniae+intracellular+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The essential role of the CopN protein in Chlamydia pneumoniae intracellular growth.</a> Nature. 456, 112-115 (2008).</li>
</ol>

W niniejszej prezentacji zilustrowaliśmy, jak wykorzystać drożdże piekarskie Saccharomyces cerevisiae jako system heterologiczny do ekspresji bakteryjnych białek efektorowych typu III oraz jak identyfikować fenotypy zahamowania wzrostu indukowane przez efektory. Co ważne, fenotypy te mogą być wykorzystane w przesiewach genetycznych do identyfikacji supresorów negatywnego wpływu efektorów na wzrost drożdży. Supresory mogą reprezentować albo bezpośrednie cele badanego efektora, albo białka uczestniczące w procesac...

<table><tbody><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Difco Laboratories</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Difco Laboratories</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Difco Laboratories</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Azotowa baza drożdżowa bez aminokwasów</td><td>Difco Laboratories</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Suplement syntetycznej pożywki drożdżowej z pominięciem składników (drop-out)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y2001</td><td></td></tr><tr><td>D-galaktoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td>&amp;gt;99%; &amp;lt;0,1% glukozy</td></tr><tr><td>D-rafinoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0250</td><td>&amp;gt;98%</td></tr><tr><td>L-leucyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>Uracyl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptofan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-histydyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6034</td><td></td></tr><tr><td>DNA jednoniciowy z jąder łososi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D7656</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>Przesuszony</td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Glikol polietylenowy (PEG) 3350</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4338</td><td></td></tr><tr><td>Octan litu (LiAc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4958</td><td></td></tr><tr><td>Tris (zasada)</td><td>JT Baker</td><td>4109-02</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B6131</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>8.22050.1000</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do wirowania (15 ml)</td><td>Corning</td><td>430052</td><td>Sterylne</td></tr><tr><td>Kuweta spektrofotometryczna (10x4x45 mm)</td><td>Sarstedt Ltd</td><td>67.742</td><td></td></tr><tr><td>Pętla do szczepienia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z643009</td><td>Sterylna</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7543</td><td></td></tr><tr><td>Paski wskaźnikowe pH, pH 6,5-10,0</td><td>Merck &amp;amp; Co., Inc.</td><td>1.09543.0001</td><td></td></tr></tbody></table>

identyfikacja fenotypów hamowania wzrostu indukowanych przez ekspresję bakteryjnych efektorów typu iii w drożdżach

Identification of Growth Inhibition Phenotypes Induced by Expression of Bacterial Type III Effectors in Yeast

Wiele gramujemnych bakterii patogennych wykorzystuje system sekrecji typu III do translokacji zestawu białek efektorowych do cytozolu komórek gospodarza. Wewnątrz komórki efektory typu III zakłócają procesy komórkowe gospodarza, aby tłumić odpowiedzi immunologiczne i promować wzrost patogenu. Do tej pory zidentyfikowano liczne efektory typu III u bakteryjnych patogenów roślin i zwierząt, jednak tylko kilka z nich zostało dobrze scharakteryzowanych. Zrozumienie funkcji tych efektorów jest utrudnione przez kombinację redundancji funkcjonalnej w repertuarze efektorów danego szczepu bakteryjnego, subtelne efekty, jakie mogą wywierać w celu zwiększenia wirulencji, role być może specyficzne dla określonych etapów infekcji oraz trudności w manipulacjach genetycznych niektórymi patogenami. Ekspresja efektorów typu III w drożdżach pączkującychSaccharomyces cerevisiaemoże pozwolić na obejście tych ograniczeń i pomóc w charakterystyce funkcjonalnej białek efektorowych. Ponieważ efektory typu III często celują w procesy komórkowe konserwatywne u drożdży i innych eukariotów, ich ekspresja w drożdżach może prowadzić do fenotypów hamowania wzrostu, które można wykorzystać do wyjaśnienia funkcji i celów efektorów. Dodatkowe zalety wykorzystania drożdży w badaniach funkcjonalnych bakteryjnych efektorów obejmują ich podatność na manipulacje genetyczne, dostępność informacji o przewidywanych funkcjach ogromnej większości ich ORF oraz dostępność licznych narzędzi i zasobów do eksperymentów zarówno w skali całego genomu, jak i w małej skali. W niniejszym opracowaniu omawiamy krytyczne czynniki przy projektowaniu systemu drożdżowego do ekspresji bakteryjnych białek efektorowych typu III. Obejmują one odpowiedni promotor sterujący ekspresją interesujących genów efektorowych, liczbę kopii genu efektora, znacznik epitopowy użyty do weryfikacji ekspresji białka oraz szczep drożdży. Przedstawiamy procedury indukcji ekspresji efektorów w drożdżach oraz weryfikacji ich ekspresji za pomocą immunoblottingu. Dodatkowo opisujemy test kropelkowy (spotting assay) na płytkach agarowych służący do identyfikacji fenotypów hamowania wzrostu indukowanych przez efektory. Zastosowanie tego protokołu można rozszerzyć na badanie czynników patogenności dostarczanych do komórki gospodarza przez dowolny patogen i mechanizm translokacji.

W tym filmie opisujemy procedurę ekspresji bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach oraz identyfikację fenotypów zahamowania wzrostu indukowanego przez efektory. Takie fenotypy mogą być następnie wykorzystane do wyjaśnienia funkcji i celów działania efektorów.

Identyfikacja fenotypów hamowania wzrostu indukowanych przez ekspresję bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach

Wiele patogennych bakterii Gram-ujemnych wykorzystuje system sekrecji typu III do translokacji zestawu białek efektorowych do cytozolu komórek gospodarza. W obrębie ...

Aby rozpocząć ten protokół, należy wybrać wektor do ekspresji wybranego efektora bakteryjnego. W przypadku drożdży i konkretnego szczepu drożdży, wektor jest następnie transformowany do komórek drożdży. Następnie indukuje się ekspresję efektora.Indukowane komórki poddaje się lizie w celu przeprowadzenia analizy western blot, aby zweryfikować ekspresję efektora. Po potwierdzeniu ekspresji efektora komórki są hodowane, a następnie ich dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne są nanoszone na pożywki represyjne i indukujące. Ostatecznie, po dwóch do trzech dniach, analizowany jest wzrost drożdży.Witajcie, jestem Do Solomon z laboratorium dr. Guida Cesy w Katedrze Nauk o Roślinach na Uniwersytecie w Tel Awiwie. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę identyfikacji fenotypów hamowania wzrostu indukowanych przez ekspresję bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania funkcji efektorów typu III pochodzących z gram-ujemnych bakterii patogennych; jest ona narzędziem, które pomaga nam w identyfikacji celów efektora TIC.Zacznijmy zatem. Projektując system drożdżowy odpowiedni do ekspresji interesujących nas efektorów typu trzeciego, należy wziąć pod uwagę i zoptymalizować kilka istotnych czynników. Pierwszym z nich jest promotor sterujący ekspresją efektorów.Ponieważ bakteryjne efektory typu trzeciego mogą być toksyczne dla komórek drożdży, do kontroli ich ekspresji należy użyć promotora indukowalnego. W tym doświadczeniu wykorzystamy promotor GAL1. Drugim czynnikiem jest liczba kopii genu efektora.Wysokie poziomy ekspresji są osiągane, gdy gen efektora jest przenoszony przez plazmid 2 µm. Ekspresję pośrednią uzyskuje się przy użyciu plazmidu zawierającego centromer, natomiast niską ekspresję osiąga się, gdy gen efektora zostanie zintegrowany z genomem drożdży poprzez rekombinację homologiczną. Trzecim czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę, jest znacznik epitopowy stosowany do weryfikacji ekspresji białka w przypadkach, gdy niedostępne są przeciwciała przeciwko badanemu efektorowi.Najczęściej stosowanymi znacznikami są hemaglutynina M HA lub flag, do których dostępne są niezawodne przeciwciała komercyjne. Sugerujemy stosowanie tylko jednej kopii znacznika, aby zminimalizować niepożądane, szkodliwe efekty wpływające na strukturę i aktywność białka efektorowego. I wreszcie, szczep drożdży użyty do ekspresji musi być troficzny w stosunku do markera selekcyjnego wektora ekspresyjnego.Aby wyhodować komórki drożdży do transformacji, należy pobrać kolonię drożdży ze świeżej płytki i zaszczepić trzy mililitry YPD w 15 mililitrowej probówce polipropylenowej, a następnie wymieszać na wirówce typu vortex. Krótko umieść probówkę z kulturą w walcarku i inkubuj przez noc w temperaturze 30 °C przy stałej rotacji. Następnego ranka wyjmij kulturę z walcarku i odwiruj przy 800 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po wirowaniu całkowicie usuń nadsącz i resuspenduj komórki w jednym mililitrze buforu do resuspendowania Resus, mieszając za pomocą wortexa z maksymalną prędkością przez około 10 sekund. Dla każdego plazmidu przeznaczonego do transformacji oraz dla dodatkowej transformacji kontrolnej przenieś 100 µL zawiesiny komórkowej do probówki do mikrocentryfugi. Do każdej probówki, z wyjątkiem probówki kontrolnej, dodaj pięć µL jednoniciowego DNA nasienia łososia oraz od 250 do 500 ng DNA plazmidowego.Następnie ostrożnie dodaj 650 µL roztworu transformacyjnego do każdej probówki i wymieszaj w wirówce vortex. Inkubuj probówki w temperaturze 30 °C przez 30 minut na walcarku. Po zakończeniu inkubacji dodaj 70 µL DMSO do każdej probówki i wymieszaj poprzez odwrócenie probówek od 10 do 15 razy, aby uniknąć rozbicia komórek.Nie należy wstrząsać probówek na wirówce typu vortex. Probówki należy umieścić w podgrzanej do 42 °C kąpieli wodnej i inkubować przez 15 minut. Po 15 minutach należy wyjąć probówki z kąpieli wodnej i natychmiast umieścić je w lodzie na dwie minuty.Po ostygnięciu probówek należy zebrać komórki poprzez wirowanie, a następnie za pomocą pipety ostrożnie usunąć lepki nadsącz. Każdy osad należy zawiesić w 150 µL sterylnej wody dwukrotnie destylowanej i rozsiać zawiesinę komórek na płytce z odpowiednią pożywką selektywną. Płytki należy pozostawić otwarte przez dwie minuty, aby wyschły w komorze z laminarnym przepływem powietrza.Następnie płytki należy umieścić w inkubatorze w temperaturze 30 °C na dwa do trzech dni w celu hodowli komórek drożdży. Aby przygotować ekstrakt białkowy, należy zaszczepić 3 mL odpowiedniego podłoża represyjnego kolonią drożdży ze świeżej płytki i wymieszać na wirówce vortex. Następnego dnia probówkę z kulturą należy umieścić na krótko w inkubatorze obrotowym w temperaturze 30 °C.Wyjąć kulturę z walca i wirować przy 800 Gs przez pięć minut w temperaturze pokojowej, odrzucić nadsącz i zawiesić ponownie osad komórkowy. W trzech mililitrach sterylnej DDW wymieszać za pomocą wortexa, ponownie wirować, odrzucić nadsącz i zawiesić komórki w trzech mililitrach sterylnej DDW. Następnie przenieść 200 microliters zawiesiny komórkowej do nowej probówki o pojemności 15 milliliter zawierającej trzy mililitry odpowiedniego medium indukcyjnego wymieszanego za pomocą wortexa.Umieść probówkę w walcarku i inkubuj przez noc w temperaturze 30 °C. Następnego dnia rano przenieś 1 mL kultury (lub więcej w przypadku kultur o niskiej gęstości) do probówki do mikrowirówki. Zbierz komórki poprzez wirowanie przy 800 G przez pięć minut w temperaturze pokojowej; od tego momentu pracuj w dygestorium, aby uniknąć wdychania toksycznych oparów etanolu Beamer capto.Ostrożnie usuń nadsącz za pomocą pipety i resuspenduj osad komórkowy w 100 µL lodowatego roztworu lizującego. Wymieszaj intensywnie za pomocą wirówki laboratoryjnej i inkubuj na lodzie przez 30 minut. Podczas 30-minutowej inkubacji określ objętość kwasu solnego o stężeniu 6 M wymaganą do miareczkowania 100 µL buforu lizującego do pH od 9 do 10.Aby to zrobić, dodaj różne objętości kwasu solnego do 100 µL buforu lizującego w 10 różnych probówkach, a następnie sprawdź pH roztworu za pomocą paska wskaźnika pH po zakończeniu inkubacji przy odpowiedniej objętości kwasu solnego dodanego do lizatu i wymieszaj za pomocą wortexa. Następnie dodaj 50 µL trzykrotnego buforu do próbek do lizatu i wymieszaj za pomocą wortexa, przebij igłą otwór w zakrętce probówki do wirówki i gotuj roztwór lizatu na bloku grzewczym przez pięć minut. Po gotowaniu pozostaw roztwór do ochłonięcia na dwie minuty w temperaturze pokojowej.Następnie wymieszać roztwór lizatu w wirówce vorex i odwirować go przez 10 sekund. Lizat jest teraz gotowy do analizy immunologicznej krwi w celu przygotowania komórek do testu plamkowego. Następnego dnia wyhodować kultury każdego szczepu o objętości trzech mililitrów, zgodnie z wcześniejszym opisem.Przygotować dwie płytki zawierające syntetyczną pożywkę kompletną bez leucyny. Pożywkę na jednej płytce należy uzupełnić o 2%glucose, a na drugiej o 2%actose i 1%raffinose. Osuszyć płytki w sterylnej komorze z laminarnym przepływem powietrza w temperaturze pokojowej przez 20 minut.Zbiór komórek i ponowne zawieszenie każdego osadu komórkowego w trzech mililitrach sterylnej DDW. Powtórz etap wirowania i ponownie zawieś komórki w trzech mililitrach sterylnej DDW. Wyznacz gęstość optyczną lub OD każdej hodowli, a następnie przygotuj w sterylnych probówkach mikropoistycznych zawiesiny komórkowe o objętości jednego mililitra i OD 600 równej 1.Następnie przygotuj trzy dziesięciokrotne rozcieńczenia seryjne z każdej z zawiesin komórkowych, używając trzech sterylnych mikroprobówek wypełnionych 900 µL sterylnej wody DDW. Umieść suche płytki na siatce i dla każdej hodowli nanieś po 10 µL z czterech rozcieńczeń w rzędzie. Po naniesieniu próbek pozostaw płytki otwarte w komorze z laminarnym przepływem powietrza przez kilka minut.Gdy plamki wyschną, przykryj płytki i umieść je w inkubatorze w temperaturze 30 °C na dwa do trzech dni. Teraz przedstawimy wyniki testu plamkowego na drożdżach w celu wykrycia inhibicji wzrostu. Fenotypy wywołane ekspresją efektorów typu trzeciego: efektorów typu trzeciego A-V-R-P-T-O hop, AA one one oraz AAV RE one bakterii.Białka Pseudomonas syringae z patogenu pomidora były wyrażane z plazmidu zawierającego centromer w szczepie drożdży na podłożu represyjnym. Szczepy drożdży niosące plazmid do ekspresji AvrPto oraz HopAA1 wykazały wzrost podobny do szczepu kontrolnego zawierającego pusty wektor. Podczas gdy drożdże niosące AvrRE1 wykazały nieco zredukowany wzrost, prawdopodobnie z powodu nieszczelności promotora GAL1 i wysokiej cytotoksyczności AvrRE1, w warunkach indukujących ekspresja AvrRE1 lub HopAA1 spowodowała drastyczny fenotyp zahamowania wzrostu, objawiający się brakiem kolonii w każdym rozcieńczeniu. W przeciwieństwie do tego ekspresja AvrPto nie wywarła żadnego efektu hamującego wzrost.Właśnie pokazaliśmy, jak identyfikować fenotypy hamowania wzrostu wywołane ekspresją bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby starannie dobrać wektor ekspresyjny oraz szczep, ponieważ oba te elementy mogą mieć znaczący wpływ na wyniki. Ponadto należy pamiętać o wykorzystaniu świeżo transformowanych kolonii na wszystkich etapach procedury.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

identification-growth-inhibition-phenotypes-induced-expression

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Delecja genów oraz nadekspresja białek to powszechnie stosowane metody badania funkcji białek. W niniejszym artykule opisujemy protokół analizy rozwoju fenotypu w zależności od stężenia białka na poziomie populacyjnym i pojedynczych komórek u Saccharomyces cerevisiae.

Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka u drożdży pączkujących

Niniejszy manuskrypt opisuje trzy komplementarne protokoły służące do oceny toksyczności białek z ekspansją poliglutaminy (polyQ) w drożdżach Saccharomyces cerevisiae. Protokoły te można łatwo zmodyfikować w celu monitorowania toksyczności innych błędnie sfałdowanych białek w drożdżach.

Testy wzrostu do oceny toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Tutaj prezentujemy opłacalną metodę definiowania interakcji chemiczno-genetycznych w pączkujących drożdżach. Podejście to opiera się na podstawowych technikach biologii molekularnej drożdży i doskonale nadaje się do mechanistycznego badania małych i średnich zbiorów substancji chemicznych i innych środowisk pożywki.

Szybka identyfikacja chemicznych interakcji genetycznych u Saccharomyces cerevisiae

Ten artykuł opisuje test oparty na wzroście drożdży do określania wymagań genetycznych dla degradacji białek. Zademonstrowano również metodę szybkiej ekstrakcji białek drożdży, nadającą się do western blot w celu biochemicznego potwierdzenia wymagań degradacji. Techniki te można dostosować do monitorowania degradacji różnych białek.

Oznaczanie na podstawie wzrostu i biochemiczne potwierdzenie wymagań genetycznych dotyczących degradacji białek u Saccharomyces cerevisiae

Opisana tutaj metoda jest używana do indukowania kaskady sygnalizacji apoptotycznej na określonych etapach w celu zbadania aktywności antyapoptotycznego bakteryjnego białka efektorowego. Metoda ta może być również stosowana do indukowalnej ekspresji białek proapoptotycznych lub toksycznych lub do analizowania interferencji z innymi szlakami sygnałowymi.

Zastosowanie indukowalnego systemu ekspresji do badania interferencji bakteryjnych czynników wirulencji z sygnalizacją wewnątrzkomórkową

Bakteryjne białka efektorowe są ważne dla skutecznego leczenia infekcji. Protokół ten opisuje eksperymentalną identyfikację białkowych partnerów wiążących bakteryjne białko efektorowe w jego naturalnym żywicielu roślinnym. Identyfikacja tych oddziaływań efektorowych za pomocą dwuhybrydowych badań przesiewowych drożdży stała się ważnym narzędziem w odkrywaniu strategii patogenności molekularnej.

Rozwikłanie funkcji efektora bakteryjnego od nienadającego się do uprawy patogenu roślinnego za pomocą drożdżowego sita dwuhybrydowego

Prezentujemy metodę ilościowego określania fenotypów wzrostu pojedynczych komórek drożdży, gdy rosną one w kolonie na stałych podłożach, za pomocą mikroskopii poklatkowej zwanej One-cell Duubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Heterogeniczność populacji genetycznie identycznych komórek rosnących w kolonie może być bezpośrednio obserwowana i określana ilościowo.

ODELAY: Wielkoskalowa metoda wieloparametrowej kwantyfikacji wzrostu drożdży

Przedstawione są tutaj cztery protokoły do konstruowania i wykorzystywania szczepów reporterowych drożdży Saccharomyces cerevisiae do badania potencjału transaktywacji ludzkiego P53, wpływu różnych mutacji związanych z rakiem, współekspresji białek oddziałujących oraz efektów określonych małych cząsteczek.

Drożdże jako podwozie do opracowywania testów funkcjonalnych do badania ludzkiego p53

Patogeny bakteryjne wydzielają do gospodarza białka, które kierują się na kluczowe procesy biologiczne. Identyfikacja szlaków gospodarza, na które ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe, ma kluczowe znaczenie dla rozwiązania problemu patogenezy molekularnej. W tym miejscu opisano metodę wykorzystującą zmodyfikowany supresor drożdży i badanie przesiewowe toksyczności w celu wyjaśnienia szlaków gospodarza, do których skierowane są toksyczne bakteryjne białka efektorowe.

Identyfikacja szlaków gospodarza, do których ukierunkowane są bakteryjne białka efektorowe przy użyciu toksyczności drożdży i badań supresorowych

Bakterie kolonizują tkanki gospodarza, które różnią się biodostępnością tlenu i żelaza, jednak większość podejść do badania bakterii wykorzystuje napowietrzone, bogate media. Protokół ten opisuje hodowlę ludzkiego patogenu Yersinia pseudotuberculosis przy różnych stężeniach żelaza i ciśnieniu tlenu oraz ilościowe określenie aktywności układu wydzielania Yersinia typu III, który jest ważnym czynnikiem wirulencji.

Kwantyfikacja aktywności systemu wydzielania Yersinia pseudotuberculosis typu III po głodzie żelaza i wzroście beztlenowym

Drożdże rozszczepienia są tutaj używane jako heterologiczne gospodarze do ekspresji bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak FtsZ i MreB, jako translacyjnych białek fuzyjnych z GFP, aby uwidocznić ich polimeryzację. Również związki, które wpływają na polimeryzację, są identyfikowane przez obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

Poznaj metodę ekspresji bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach i identyfikacji fenotypów zahamowania wzrostu. Technika ta umożliwia badanie funkcji efektorów w modelu eukariotycznym.

Identyfikacja fenotypów hamowania wzrostu indukowanych przez ekspresję bakteryjnych efektorów typu III w drożdżach

Przeglądaj więcej filmów