Name: Sekcja eksplantatów organizatora i słupa zwierzęcego z zarodków Xenopus laevis i montaż testu adhezji komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 21 s
Description: Poznaj technikę preparacji eksplantatów organizatora i słupa zwierzęcego z zarodków Xenopus laevis oraz montaż testu adhezji komórek. Ta metoda pozwala badać właściwości adhezyjne i migrację komórek w biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Przygotowanie komór adhezyjnych (dzień przed iniekcją/dysekcją)
Komory do testu adhezji
Jeśli dysponują Państwo konwencjonalnym mikroskopem złożonym (optyka znajduje się nad stolikiem), konieczne jest wykonanie niskiej komory adhezyjnej zgodnie z poniższymi instrukcjami. W przypadku korzystania z mikroskopu odwróconego można użyć szkiełek dekrywacyjnych „NUNC Lab-Tek Chambered Coverglass”,&nbsp;pomijając kroki nr 1 - 2.
<ol>
<li>Przymocuj jeden z „silikonowych izolatorów dociskowych” do szkiełka nakrywkowe o wymiarach 40 x 24 mm. Mocno dociśnij izolator do szkiełka na czystym blacie laboratoryjnym i sprawdź z drugiej strony, czy izolator przylega całkowicie, bez pęcherzyków powietrza. </li>
<li>Opcjonalnie: Umieść komory adhezyjne w szklanej szalce Petriego z papierem filtrowanym Whatman i wysterylizuj w autoklawie w cyklu suchym. Ochłodź je do RT.</li>
</ol>
Powlekanie komory
<ol>
<li>Za pomocą końcówek żółtych z powłoką Sigma nanieść kroplę 200µl roztworu roboczego kadheryny (10mg/ml) lub fibronektyny (20mg/ml) na środek autoklawowanej komory adhezyjnej. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. </li>
<li>Odessać roztwór kadheryny lub fibronektyny i przenieść go do probówki 1,5ml. Roztwór ten można wykorzystywać ponownie przez następne dwa tygodnie. </li>
<li>Nanieść 500µl 4% BSA w 1x MBS-H w celu zablokowania komory. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. </li>
<li>Odessać roztwór BSA. Przemyć komorę dwukrotnie 500µl 1x MBS-H. Po drugim płukaniu odessać większość MBS-H (nie całkowicie) i przechowywać w szczelnym pojemniku w temperaturze 4ºC. Taka komora adhezyjna zachowuje właściwości przez kolejne 2-3 dni.</li>
</ol>
Disekcja i dysocjacja eksplantów zniesienia zwierzęcego
<ol>
<li>Inkubować wstrzyknięte embriony w 0,1x MBS-H, rozcieńczonym z autoklawowanego 1x MBS-H, ponieważ medium nieautoklawowane czasami zawiera niewielkie zanieczyszczenia drobnoustrojowe, które mogą zakłócić proces dysocjacji komórek czapki zwierzęcej. </li>
<li>Przygotować agarowe płytki 1x Barth's oraz płytki agarowe CMF-MBS w naczyniach o średnicy 60 mm, w liczbie co najmniej odpowiadającej liczbie próbek. Na płytki 1x Barth's wlać autoklawowany 1x MBS-H. Na płytki CMF-MBS wlać 10 ml CMF-MBS. </li>
<li>Gdy embriony osiągną stadium 8,5, rozpocząć wycinanie czapek zwierzęcych na płytce 1x Barth's. Do jednego doświadczenia zazwyczaj wystarcza od 10 do 15 eksplantów na próbkę. </li>
<li>Przenieść eksplanty czapki zwierzęcej na płytkę CMF-MBS. Inkubować eksplanty przez 45–60 minut, aż do ich całkowitej dysocjacji. Delikatne potrząsanie co 15 minut wspomaga proces dysocjacji.</li>
</ol>
Test adhezji komórkowej
<ol>
<li>Wysiewanie komórek: Do komory adhezyjnej przygotowanej zgodnie z instrukcjami w poprzednich sekcjach, &nbsp;Adhesion Assay Chambers i Coating the Chamber, nalać 500ml 1x MBS-H. Przenieść dysocjowane komórki czapki zwierzęcej z płytki CMF-MBS do komory adhezyjnej za pomocą pipety P200 z żółtymi końcówkami z powłoką sigma, których końce zostały odcięte. </li>
<li>Opcjonalnie: Jeśli to możliwe, ostrożnie odessać medium do poziomu około 2/3 lub połowy objętości, nie dopuszczając do kontaktu komórek z powietrzem. Dodać podobną ilość świeżego MBS-H, aby upewnić się, że medium zawiera wystarczającą ilość Ca2+ i Mg2+. </li>
<li>Inkubować w RT przez 45 - 90 minut. Okresowo sprawdzać, czy komórki przytwierdzają się do dolnej powierzchni. </li>
<li>W tym momencie można wykonać zdjęcie komórek pod mikroskopem. </li>
<li>Umieścić komorę adhezyjną na szkiełku z siatką. Dopasować jeden z narożników komory adhezyjnej do narożnika siatki na szkiełku. Policzyć i zapisać liczbę przytwierdzonych komórek w kilku różnych polach siatki. </li>
<li>Nalać 1L MBS-H do dużego plastikowego pojemnika (np. Tupperware itp.). Ostrożnie opuścić komorę adhezyjną na dno pojemnika. Inkubować na wytrząsarce orbitalnej przez pięć minut przy niskiej prędkości (50 - 60rpm). </li>
<li>Umieścić komorę adhezyjną z powrotem na szkiełku z siatką, dopasowując ten sam narożnik komory do tego samego narożnika siatki, tak jak wykonano to &nbsp;w kroku nr 5 tej sekcji, Cell Adhesion Assay. Policzyć liczbę komórek, które pozostały przytwierdzone w tych samych polach siatki, co przed płukaniem. Obliczyć procent komórek, które pozostały przytwierdzone po płukaniu.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1x MBS-H</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>Zmodyfikowany test Bartha&amp;rsquo;podłoże: przepis na 1 L: 5,14 g NaCl, 5 mg KCl, 0,2 g NaHCO3&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; 0,2 g MgSO₄&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 60 mg CaCl2&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 80 mg Ca(NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)2&amp;#8226;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;38 g HEPES, w formie kwasu wolnego. Dostosować pH do 7,4 za pomocą NaOH. Sterylizować w autoklawie.</td></tr><tr><td>CMF-MBS</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>To jest wapń&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;/Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;wersja bez- MBS-H. Przepis na 500 ml: 2,57 g NaCl, 37,5 mg KCl, 0,1 g NaHCO&lt;sub&gt;3/sub&gt; 1,19 g HEPES w formie wolnego kwasu. Dostosować pH do 7,4 za pomocą NaOH. Autoklawować.</td></tr><tr><td>1% agarozy/1x Barth&amp;rsquo;płytki s</td><td></td><td></td><td></td><td>tyle, ile jest próbek</td></tr><tr><td>płytki z 1% agarozą/CMF-MBS</td><td></td><td></td><td></td><td>tyle samo, ile jest próbek</td></tr><tr><td>Chimera E-kadheryny/Fc </td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E-2278</td><td>Rozpuścić 0,1 mg stałej E-kadheryny w 100 µl 1x buforu MBS-H zawierającego 40% glicerolu, aby przygotować 100-krotny roztwór macierzysty (1,0 mg/ml). Przechowywać w &amp;#8211;20 &amp;deg;C. Przed użyciem przygotuj roztwór roboczy o stężeniu 10 µg/ml poprzez wykonanie 1/100 rozcieńczenia w 1x MBS-H. Na każdą próbkę wymagane jest 200 µl tego roztworu roboczego.</td></tr><tr><td>Fibrynogen, roztwór 0,1% </td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F-1141</td><td>Tego gotowego roztworu można używać jako zapasu 50x. Przygotować rozcieńczenie 1/50 w 1x MBS-H, aby otrzymać 20 ml. &amp;mu;g/ml roztworu roboczego bezpośrednio przed użyciem. Należy przygotować 200 &amp;mu;L na próbkę tego roztworu roboczego. NIE zalecam stosowania fibonektyny w postaci stałej, ponieważ trudno ją rozpuścić w stężeniu 0,1% w celu przygotowania roztworu zapasowego. Mimo że gotowy roztwór 0,1% jest droższy, pozwala on na uzyskanie bardziej spójnych wyników.</td></tr><tr><td>4% BSA /MBS-H</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>BSA: frakcja V klasy biologii molekularnej</td></tr><tr><td>żółte końcówki Sigmacote </td><td>Narzędzie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>szkiełka nakrywkowe nr 1</td><td></td><td></td><td></td><td>40 mm x 24 mm lub 60 mm x 24 mm</td></tr><tr><td>Silikonowy izolator uszczelniany przez docisk</td><td>Narzędzie</td><td>Glace Bio-Labs</td><td>JTR20-2.5</td><td>głębokość 2,5 mm x średnica 20 mm</td></tr><tr><td>Szkiełko okrywek z komorą NUNC Lab-Tek</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-471</td><td>2 dołki/szkiełka</td></tr><tr><td>Szkiełko przedmiotowe z siatką</td><td>Narzędzie</td><td></td><td></td><td>siatka zliczeniowa lub okular z siatką do liczenia komórek</td></tr></tbody></table>

disekcja eksplantów organizatora oraz bieguna zwierzęcego z embrionów xenopus laevis i przygotowanie testu adhezji komórkowej

Dissection of Organizer and Animal Pole Explants from Xenopus laevis Embryos and Assembly of a Cell Adhesion Assay

Niniejszy film prezentuje technikę przygotowania eksplantów organizatora oraz bieguna zwierzęcego z embrionów Xenopus laevis, w tym zastosowanie noża z brwi – specjalistycznego narzędzia do sekcji wykonanego z włosa brwiowego. Przedstawiono również protokół przygotowania testu adhezji, który służy do wykrywania kluczowych cząsteczek adhezyjnych obecnych na powierzchni komórek organizatora lub bieguna zwierzęcego, niezbędnych dla prawidłowego rozwoju.

Disekcja eksplantów organizatora oraz bieguna zwierzęcego z embrionów Xenopus laevis i przygotowanie testu adhezji komórkowej

Witam, nazywam się Sochi Agata. Jestem naukowcem na etapie postdoc w laboratorium dr. Kena Cho w Departamencie Biologii Rozwojowej i Komórkowej na University of California Irvine. Dzisiaj zaprezentuję metodę sekcji oraz test adhezji eksplantów czepka zwierzęcego lub eksplantów organizatora z embrionów żaby XUS.Niniejszą procedurę można wykorzystać do badania charakterystyki adhezji oraz morfologii komórek pochodzących z wypreparowanej tkanki. Procedura ta obejmuje wypreparowanie określonej tkanki z embrionu żaby Xenopus, dysocjację komórek w medium wolnym od wapnia i magnezu, a następnie przeniesienie zdysocjowanych komórek do warunków zawierających wapń i magnez na szkiełko przedmiotowe pokryte cząsteczkami adhezyjnymi. W ramach tej procedury można badać zachowanie komórek, ich migrację oraz charakterystykę adhezji wypreparowanych komórek Xenopus.W całej procedurze sekcji zarodka i testu adhezji najpierw używam specjalistycznych narzędzi. Jest to roztwór pozbawiony jonów wapnia i magnezu 1x-bar, z dodatkiem 1% agro. A tutaj znajduje się roztwór 1x-bar z 1% agro, w którym wykonuje się sekcję zarodka.A tutaj znajduje się narzędzie do sekcji, specjalne narzędzie do sekcji inne niż pę

dissection-organizer-animal-pole-explants-from-xenopus-laevis-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Sekcja eksplantatów organizera i biegunu zwierzęcego z zarodków Xenopus laevis i montaż testu adhezji komórkowej

Niniejszy test ocenia zdolność cząsteczki sygnałowej, w tym przypadku białka morfogenetycznego kostnego 7 (BMP7), do zmiany kierunku wzrostu aksonów komisuralnych. Eksplant embrionalnego grzbietowego rdzenia kręgowego jest hodowany obok agregatu komórek COS wydzielających badane czynniki wzrostu. Zmiana kierunku wzrostu aksonów komisuralnych w obrębie eksplantu jest wizualizowana za pomocą immunohistochemii.

Ocena zdolności rozpuszczalnych cząsteczek sygnałowych do zmiany orientacji embrionalnych aksonów komisuralnych rdzenia kręgowego

Kapturki zwierzęce nadekspresujące produkty genów są transplantowane do boku rozwijających się embrionów Xenopus laevis w celu ustalenia, czy tkanka jest zdeterminowana.

Wyznaczanie rodzaju tkanki przy użyciu testu przeszczepu czapy zwierzęcej (ACT) u Xenopus laevis

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Zewnętrzna warstwa ektodermy embrionalnej Xenopus stała się atrakcyjnym modelem do badań polaryzacji komórkowej. Opisano analizę, w której ocenia się subkomórkową dystrybucję białek fluorescencyjnych w komórkach ektodermy. Niniejszy protokół pomoże w odpowiedzi na pytania dotyczące przestrzennej kontroli sygnalizacji.

Polaryzowana translokacja białek fluorescencyjnych w ektodermie Xenopus w odpowiedzi na sygnalizację Wnt

Hodowla eksplantów neuronalnych z wypreparowanych embrionów Xenopus laevis wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek fuzyjnych umożliwia obrazowanie dynamiki cytoszkieletu stożka wzrostu.

Kultury eksplantów neuronalnych z Xenopus laevis

Xenopus laevis dostarcza idealnego systemu modelowego do badania specyfikacji losu komórki i funkcji fizjologicznych poszczególnych komórek siatkówki w pierwotnej hodowli komórkowej. Tutaj przedstawiamy technikę preparowania tkanek siatkówki i generowania pierwotnych kultur komórkowych, które są obrazowane pod kątem aktywności wapnia i analizowane przez hybrydyzację in situ.

Sekcja, hodowla i analiza embrionalnej tkanki siatkówki Xenopus laevis

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić preparację premigracyjnego grzebienia nerwowego czaszki (NC) od Xenopus laevis neurulas. Te eksplantaty można posiewać na fibronektynie i hodować in vitro lub przeszczepiać z powrotem do zarodków gospodarza. Technika ta pozwala na badanie mechanizmów przejścia, migracji i różnicowania nabłonka NC do mezenchymy.

Rozwarstwienie grzebienia nerwowego Xenopus laevis do hodowli eksplantatów in vitro lub przeszczepu in vivo

Manuskrypt tutaj dostarcza prosty zestaw metod do analizy wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów w Xenopus. Stwarza to kontekst do testowania zdolności innych białek do modyfikowania rozkładu ligandów i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, które mogą dać wgląd w mechanizmy regulujące gradienty morfogenu.

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Opisujemy prosty protokół tworzenia organoidów nabłonkowych śluzowo-rzęskowych z głębokich komórek ektodermy wyizolowanych z zarodków Xenopus laevis. Multipotencjalne komórki progenitorowe regenerują prekursory nabłonkowych komórek kubkowych i umożliwiają śledzenie na żywo inicjacji i progresji przemian komórkowych na powierzchni organoidów.

Organoidy nabłonkowe śluzowo-rzęskowe z komórek embrionalnych Xendopus: generacja, hodowla i obrazowanie na żywo w wysokiej rozdzielczości

Poznaj technikę preparacji eksplantatów organizatora i słupa zwierzęcego z zarodków Xenopus laevis oraz montaż testu adhezji komórek. Ta metoda pozwala badać właściwości adhezyjne i migrację komórek w biologii rozwoju.

Disekcja eksplantów organizatora oraz bieguna zwierzęcego z embrionów Xenopus laevis i przygotowanie testu adhezji komórkowej

Przeglądaj więcej filmów