Zalewanie w plastiku i skrawanie zarodków Xenopus laevis

Witam, nazywam się Sochi ota. Jestem pracownikiem postdoktorskim w laboratorium dr. Ken Cho w Katedrze Biologii Rozwojowej i Komórkowej na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine. Dzisiaj zaprezentuję Państwu przygotowanie prostych przekrojów zarodka Xenopus.

Procedura ta obejmuje przecinanie na pół embrionów żaby w późnym stadium gazowym, barwienie przeciwciałem przeciwko cząsteczce docelowej, infiltrację plastikiem oraz wykonanie przekrojów plastikowych o grubości 5 µm. Procedurę tę można wykorzystać do badania immunofluorescencji, immunohistochemii lub hybrydyzacji in situ z uzyskaniem obrazów o bardzo wysokiej rozdzielczości. Oto niewielkie, praktyczne narzędzia, których używam do sekcjonowania w plastiku więcej niż 10 embrionów.

To jest metalowa pęseta z delta tip, a ta, numer jeden, może służyć do orientowania embrionu w plastiku. Natomiast numer dwa może być używana wraz z tym pędzlem do przenoszenia embrionu z mikrotomu na powierzchnię montażową. To jest izolator z gumy silikonowej, który kładę na powierzchni szkiełka i który tworzy zbiornik wodny, w którym mogę zamontować plastry sekcjonowanych embrionów.

Teraz pokażę, jak przeprowadzić bisekcję zarodka – utrwalonego zarodka do analiz, takich jak hybrydyzacja in situ lub detekcja immunofluorescencyjna. Aby przeciąć zarodek na pół, używam bardzo cienkiej metalowej siatki, którą można kupić w sklepie spożywczym. Uważam, że tak, zarodki zostały utrwalone w 3,7% formaldehydzie przez noc.

Sposób utrwalania zależy zatem od celu badania. W tym przypadku utrwalanie trwa całą noc. W celu przeprowadzenia hybrydyzacji in situ można zastosować utrwalanie nocne, jednak w przypadku detekcji immunofluorescencyjnej, służącej do wykrywania białek wewnątrz embrionu, nie zalecam zbyt długiego utrwalania.

Zdecydowałem się na fiksację w 3,7% formaldehydzie przez zaledwie dwie godziny, aby zminimalizować wpływ na subkomórkową lokalizację białek oraz uniknąć nadmiernej fiksacji, co pozwoli na lepszą penetrację przeciwciał podczas etapu detekcji. Teraz preparuję ten embrion, przecinając ścianę pęcherzyka po lewej i prawej stronie. Widzę, że jest to embrion w stadium 11, w którym płyta organizacyjna (PO) rozciąga się od strony grzbietowej do brzusznej, ale jest to embrion z anomaliami.

Przyjrzyjmy się teraz fragmentowi po prawej stronie. Widoczny jest blastopor zarówno po stronie grzbietowej, jak i brzusznej, jednak strona grzbietowa jest bardziej oczywista, ponieważ to wgłębienie sięga wyraźnie najgłębiej do wnętrza zarodka w porównaniu ze stroną brzuszną. Jest to zatem odpowiedni, przecięty fragment do badania obu stron – grzbietowej i brzusznej.

Wewnątrz zarodka, w tym przekrojonym zarodku, zastosuję detekcję immunofluorescencyjną białka ekspresjonowanego w jego wnętrzu. Do immunofluorescencji lub immunohistochemii wykorzystuje się przeciwciała specyficzne dla wykrywanego białka. Problemem jest jednak fakt, że przeciwciała nie przenikają zbyt dobrze do wnętrza zarodka.

W przypadku zastosowania metody całego preparatu (whole mount) zarodka, nie jest możliwe określenie wzorca ekspresji białek wewnątrz niego. Jednak dzięki zastosowaniu wcześniej przedzielonego zarodka można zbadać wzorzec ekspresji w komórkach znajdujących się głęboko wewnątrz zarodka.

Barwiony zarodek został już utrwalony w 3,7% formaldehydzie, odwodniony w etanolu i zatopiony w plastiku z zestawu Technovit 7100. Zestaw ten składa się z trzech części: głównej części w formie cieczy, proszku zwanego utwardzaczem 1 oraz cieczy zwanej utwardzaczem 2.

Najpierw mieszam ten główny składnik z utwardzaczem w stosunku 100:1, co pozwala uzyskać mieszaninę infiltracyjną. Jest to ciecz, w której przeprowadzam infiltrację zarodka. Mieszanina ta pozostaje płynna, aby nie doszło do przedwczesnego utwardzenia.

Próbki embrionów pozostawia się w tej mieszaninie infiltracyjnej przez noc, aby upewnić się, że są one całkowicie przesycone plastikiem. Następnie za pomocą pipety transferowej pobieram jedną z próbek embrionów i przenoszę ją do cienkościennej probówki 0,5 mL typu MPCL, która służy jako forma do zatapiania. Następnie usuwam z próbki nadmiar cieczy.

A teraz ten embrion jest już gotowy do zatopienia w twardniejącym plastiku. Aby przygotować twardniejący plastik, miesza się tę mieszaninę infiltracyjną z utwardzaczem w stosunku 15:1. Przykładowo, jeśli pobiorę 750 µL tej mieszaniny infiltracyjnej do probówki typu Eppendorf, powinnam dodać 50 µL utwardzacza, aby zapoczątkować polimeryzację plastiku; po dodaniu, ups, zamykam zakrętkę i następnie delikatnie mieszam w ten sposób.

Nie należy stosować mieszadła wirowego, ponieważ tlen jest inhibitorem reakcji polimeryzacji. Należy dodać około 250 µL tej mieszaniny do embrionu. Ten etap polimeryzacji trwa niemal cztery godziny, więc nie ma potrzeby się spieszyć.

Po dodaniu w pierwszej kolejności tego polimeryzującego plastiku, można go przesuwać w górę i w dół, aby zarodek unosił się w plastiku. Następnie używam tej pęsety metalowej, aby przesuwać zarodek i zorientować go tak, aby powierzchnia cięcia zarodka znalazła się na dnie tej formy do zatapiania. Następnie zamykam pokrywkę, ponieważ tlen jest inhibitorem reakcji utwardzania, i pozostawiam go na cztery godziny, aby umożliwić zajście reakcji polimeryzacji.

Następnie jest to HUD już osadzony w próbce. Należy nałożyć na tę próbkę rodzaj kleju, aby upewnić się, że ta plastikowa twarda część nie wypadnie z tej formy. Jest to inny plastik, który służy w tym celu jako klej, nazywany techno 30 40.

Mieszam ten proszek i ciecz w proporcji 2:2:1; tutaj znajduje się 0,6 g tego proszku. Dodam zatem 300 µL tej cieczy, a następnie szybko wymieszam; ta plastikowa masa twardnieje dość szybko. Jest to etap, który wymaga pewnej sprawności, a następnie przelewam to do już stwardniałej próbki.

To jest wystarczające. Zamknij nakrętkę. Wygląda to tak.

Proces twardnienia potrwa około 30 do 60 minut. Po tym czasie preparat będzie gotowy do użycia. W pierwszej kolejności odcinam wierzchołek formy nożykiem introligatorskim i usuwam tę część z formy.

W ten sposób odsłonięto zanurzony embrion. Odciąłem również tę nasadkę, ponieważ nie jest ona potrzebna. Teraz biorę ostrze typu Tain Roy – nie igłę, lecz ostrze Tain Roy, które jest twardsze od zwykłego ostrza stosowanego do sekcjonowania tkanek.

Krótko zanurzam to w ksylenie, aby je oczyścić. Umieszczam to w uchwycie ostrza i wycieram nadmiar ksylenu. Czasami czyszczę również ten obszar ksylenem, ponieważ czystość tego miejsca jest absolutnie kluczowa.

Teraz próbka jest gotowa do krojenia. Przed rozpoczęciem krojenia przygotowuję komorę montażową. To jest szkiełko przedmiotowe.

Następnie wkładam tę silikonową gumkę i dociskam ją dokładnie, aby zapobiec jakimkolwiek wyciekom. Umieszczam całość na podgrzewaczu do szkieł i wlewam czystą wodę destylowaną, aby przygotować nasz basen. Dolewam wody do momentu, aż powierzchnia wody zostanie całkowicie zalaną.

Jest to istotne, ponieważ taka powierzchnia wody zapewnia równomierny rozkład napięcia powierzchniowego, co jest ważne dla uzyskania równomiernego rozciągnięcia przekroju. Przystępuję teraz do sekcjonowania, ale przed rozpoczęciem zakładam tę maskę, ponieważ każdy fragment przekroju jest bardzo lekki, na tyle lekki, że mój oddech mógłby go zdmuchnąć ze stolika. Dlatego zakładam tę maskę.

Następnie należy rozpocząć sekcjonowanie. Po uzyskaniu odpowiedniej liczby fragmentów przekrojów na stole, należy zebrać je pędzlem i powoli przenieść nad komorę z cieczą, a następnie delikatnie uderzyć pędzlem, aby fragmenty opadły do wody pod wpływem grawitacji. W momencie kontaktu z wodą fragmenty rozprostowują się, tworząc okrągłe plastry na jej powierzchni.

Jak wygląda to światło po wysuszeniu przez noc. Teraz wygląda to tak i tak. Próbka jest teraz gotowa do kontaktu z DPI w celu wyodrębnienia DNA jądrowego.

Następnie można przeprowadzić badanie pod mikroskopem. W dzisiejszym filmie zaprezentowałem przygotowanie skrawków w żywicy z wykorzystaniem zarodka żaby w późnym stadium gastrulacji. Procedura ta jest bardzo przydatna do badania struktur subkomórkowych lub lokalizacji białek, których nie można badać za pomocą techniki zatopienia w parafinie, a także ogólnie do przeprowadzania hybrydyzacji in situ.

Ten przekrój w plastiku pozwala również na przeprowadzenie hybrydyzacji resztkowej; procedura ta może zapewnić znacznie wyższą jakość obrazowania niż w przypadku próbek z przekrojów parafina lub mrożonych.