Name: Osadzanie i sekcjonowanie zarodków Xenopus laevis z tworzywa sztucznego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-04-29T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 39 s
Description: Naucz się metody osadzania i sekcjonowania zarodków Xenopus laevis w tworzywie sztucznym, która zachowuje morfologię tkanek i umożliwia immunofluorescencję. Technika ta pozwala uzyskać obrazy wysokiej rozdzielczości.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Fiksacja
<ol>
<li>Przenieść całe embriony lub wycięte eksplantaty do MEMFA lub 3,7% FA+PBS w małej szklanej fiolce do scyntylacji (Fisher kat. nr 03-339-25B). Inkubować fiolkę na nutatorze w temperaturze pokojowej wyłącznie przez 2 godziny, nie dłużej. Nie pozostawiać embrionu w FA przez więcej niż 2 godziny. Dłuższa inkubacja w FA spowoduje utwardzenie tkanki embrionalnej, co doprowadzi do słabej penetracji przeciwciał w procesie detekcji. </li>
<li>Odssać większość FA i dodać fiksatywa Denta aż do pełnej fiolki (~ 4,5ml). Delikatnie odwrócić fiolkę kilka razy, aby przemyć embriony w fiksatywie Denta, wymienić go na kolejne 4,5ml świeżego fiksatywu Denta i inkubować w temperaturze -20ºC przez co najmniej 48 godzin. Inkubacja przez noc NIE jest wystarczająca. Ten etap zwiększa przepuszczalność embrionów dla przeciwciał. Embriony mogą być przechowywane w tych warunkach przez kilka tygodni.</li>
</ol>
Immunofluorescencja
<ol>
<li>Rehydratyzuj preparat. Inkubuj go w gradowanej serii metanolu, zgodnie z poniższym schematem: 
<table style="width: 171px; height: 119px;" border="0" cellpadding="3">
<tbody>
<tr>
<td>75% MeOH/H2O</td>
<td>10min</td>
</tr>
<tr>
<td>50% MeOH/PBS</td>
<td>10min</td>
</tr>
<tr>
<td>25% MeOH/PBS</td>
<td>10min</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>10min</td>
</tr>
<tr>
<td>PBS</td>
<td>10min</td>
</tr>
</tbody>
</table>
 </li>
<li>Przygotuj płytki z 1,5% agarozy/PBS w plastikowych naczyniach o średnicy 60mm. Po zastygnięciu agarozy wlej na jej powierzchnię PBS. </li>
<li>Przecięcie embrionów na pół: Umieść embriony na płytce z 1,5% agarozy/PBS. Chwyć embrion pęsetą i przetnij go na pół przez środek, używając cienkiej żyletki. Wybierz te okazy, które zostały pomyślnie przecięte wzdłuż prostej płaszczyzny cięcia. <img src="/files/ftp_upload/old/188_2008_7_10_3/188_figure-01.jpg" alt="Schemat wyrównania osi embrionu pokazujący pozycję wargi grzbietowej; prawidłowe vs nieprawidłowe." width="591" height="193" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> </li>
<li>Przenieś przecięte embriony do szklanej fiolki scyntylacyjnej z PBT. Wymień roztwór na 4,5ml 20% surowicy koziej + PBT. Inkubuj w temperaturze pokojowej (RT) przez 2 godziny na nutatorze (blokowanie). </li>
<li>Przygotuj odpowiednie rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego w PBT. Na każdą próbkę wymagane jest 0,5ml. Przykładowo, do badania lokalizacji subkomórkowej C-kadheryny w plastikowych sekcjach 5mm zastosowano rozcieńczenie 1/200 królika przeciwko C-kadherynie pAb. </li>
<li>Odsuń roztwór blokujący i dodaj 0,5ml rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego. Umieść fiolki w pozycji pionowej w styropianowym uchwycie na probówki. Inkubuj przez noc w temperaturze 4ºC na nutatorze. </li>
<li>Usuń rozcieńczone przeciwciało pierwszorzędowe (może ono zostać zachowane i ponownie wykorzystane w ciągu kolejnych 1-2 tygodni). Przemyj 4,5ml PBT czterokrotnie (każdorazowo przez 40-60 minut) w temperaturze pokojowej. </li>
<li>Wymień roztwór na 0,5ml rozcieńczenia 1/100 przeciwciała wtórnego sprzężonego z biotyną w PBT. Inkubuj przez noc w temperaturze 4ºC na nutatorze. Przykryj fiolki folią aluminiową, aby chronić biotynę przed światłem. </li>
<li>Od tego momentu należy zachować szczególną ostrożność, aby chronić próbkę przed światłem, np. trzymając fiolki pod osłoną lub folią aluminiową. </li>
<li>Usuń przeciwciało wtórne z biotyną (może ono również być ponownie wykorzystane w ciągu kolejnych 1-2 tygodni). Przemyj 4,5ml PBT czterokrotnie (każdorazowo przez 40-60 minut) w temperaturze pokojowej. </li>
<li>Wymień roztwór na 0,5ml rozcieńczenia 1/200 znakowanej fluorescencyjnie (FITC, Texas-red itd.) streptawidyny w PBT. Inkubuj przez noc w temperaturze 4ºC na nutatorze. </li>
<li>Usuń streptawidynę (może ona również zostać ponownie wykorzystana). Przemyj 4,5ml PBT trzykrotnie (każdorazowo przez 15-30 minut) w temperaturze pokojowej. </li>
<li>Utrwal embriony w 4,5ml 3,7% FA + PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. </li>
<li>Przemyj dwukrotnie 4,5ml PBS. </li>
<li>Dehydratyzuj preparat. Inkubuj go w gradowanej serii etanolu, zgodnie z poniższym schematem: 
<table style="width: 172px; height: 80px;" border="0">
<tbody>
<tr>
<td>30% EtOH/H2O </td>
<td>10 min</td>
</tr>
<tr>
<td>50% EtOH/H2O</td>
<td>10 min</td>
</tr>
<tr>
<td>75% EtOH/H2O</td>
<td>10 min</td>
</tr>
<tr>
<td>100% EtOH</td>
<td>10 min</td>
</tr>
</tbody>
</table>
 </li>
<li>Preparat można przechowywać w 100% EtOH w temperaturze 4ºC pod osłoną chroniącą przed światłem.</li>
</ol>
Infiltracja
<ol>
<li>Przygotować mieszankę infiltracyjną Technovit 7100. Zazwyczaj odmierza się 15 ml cieczy bazowej do probówki stożkowej o pojemności 50 ml, dodaje 150 mg utwardzacza I, a następnie miesza na nutatorze przez 15 minut. Tak przygotowaną mieszankę infiltracyjną można przechowywać w temperaturze 4°C do jednego miesiąca. </li>
<li>Infiltrować preparat mieszanką infiltracyjną, wymieniając go w gradacji mieszanki Technovit/EtOH w następujący sposób: <ol>
<li>50% Technovit/EtOH – 1 godzina </li>
<li>100% Technovit – 1 godzina </li>
<li>100% Technovit – przez noc </li>
</ol></li>
<li>Preparat można przechowywać w 100% mieszance infiltracyjnej do jednego miesiąca w temperaturze 4ºC. Próbki należy przykryć, aby chronić je przed światłem.</li>
</ol>
Zatapianie
<ol>
<li>Przygotuj mieszaninę do zatapiania Technovit 7100: przelej 0,75 ml mieszaniny infiltracyjnej do probówki 1,5 ml i dodaj 50 µl utwardzacza II. Wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę. </li>
<li>Za pomocą plastikowej pipety transferowej przenieś jeden okaz, który był infiltrowany przez noc, do probówki PCR o cienkich ściankach o pojemności 0,5 ml. Usuń większość supernatantu. </li>
<li>Dodaj do okazu 0,25 ml mieszaniny do zatapiania przygotowanej w kroku nr 1 tej sekcji („Zatapianie”). Uorientuj przecięty embrion tak, aby płaszczyzna cięcia była skierowana w stronę dna probówki, delikatnie przesuwając go tępą igłą sekcyjną (igłą sekcyjną z drewnianym uchwytem). </li>
<li>Zamknij nakrętkkę i inkubuj probówkę w ciemnym miejscu przez około cztery godziny, aby umożliwić polimeryzację tworzywa. </li>
<li>Przygotuj mieszaninę Technovit 3040. Odważ 1 g proszku do naczynia wagowego i dodaj 0,5 ml cieczy. Natychmiast wymieszaj proszek z cieczą za pomocą końcówki typu bluetip. Wlej mieszaninę na wierzch utwardzonego okazu. Żółty Technovit 3040 zapobiegnie wypadnięciu całego plastikowego bloku z probówki.</li>
</ol>
Przygotowanie skrawków
<ol>
<li>Przetrzyj nóż Histoknife H ksylenem (EtOH często okazuje się niewystarczający) i zamontuj go w mikrotomie. Ustaw kąt ostrza na około 45°. Przetrzyj również obszar stolika przed ostrzem ksylenem, ponieważ czystość tego miejsca jest krytyczna dla jakości wycinanych skrawków. </li>
<li>Przetnij bok probówki i odlej końcówkę za pomocą noża kartonowego. <img src="/files/ftp_upload/old/188_2008_7_10_5/188_figure-02.jpg" alt="Proces sekcjonowania zarodka, zatopienie w Technovit, schemat ilustrujący kolejne kroki cięcia i materiały." width="818" height="243" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> </li>
<li>Umieść preparat w uchwycie mikrotomu. </li>
<li>Przymocuj silikonowy izolator typu „press-to-seal” do szkiełka przedmiotowego, aby stworzyć komorę montażową dla skrawków. Mocno dociśnij izolator do szkiełka na czystym blacie i sprawdź z drugiej strony, czy izolator jest całkowicie przylegający i nie ma pęcherzyków powietrza. Za pomocą pipety Pasteura wlej do powstałego zagłębienia na szkiełku czystą i ciepłą dH2O (~ 40°C), aż do poziomu, w którym powierzchnia wody stanie się płaska, a nie wklęsła lub wypukła. </li>
<li>Rozpocznij wykonywanie skrawków. Do badań immunofluorescencyjnych wykonuję skrawki o grubości 5 mm. W przypadku próbek do hybrydyzacji in situ grubość skrawków można dostosować w zakresie ~ 3 - 8 mm, w zależności od celu badania i intensywności sygnałów. </li>
<li>Przenieś skrawki ze stolika przed ostrzem do komory montażowej z wodą, używając małego pędzelka. Przytrzymaj pędzelek ze skrawkiem nad lustrem wody i zwolnij skrawka do wody, delikatnie uderzając w niego tępo zakończoną igłą sekcyjną. Skrawka rozprzestrzeni się do kształtu kolistego natychmiast po zetknięciu z powierzchnią wody. </li>
<li>Gdy większość powierzchni wody w komorze montażowej zostanie wypełniona skrawkami, odessij niemal połowę wody za pomocą pipety Pasteura. Inkubuj szkiełko na podgrzewaczu do szkiełek przez noc, aby całkowicie wysuszyć próbkę. </li>
<li>Przeprowadź barwienie kontrastowe przy użyciu 1ml DAPI (0,1mg/ml w TE) przez pięć minut. Odessij DAPI i wysusz próbkę. </li>
<li>Usuń silikonowy izolator ze szkiełka. Teraz można wykonać zdjęcia próbki. Próbkę przechowuj w temperaturze 4°C, chroniąc ją przed światłem.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>Przepis na 1 L: 8,0 g NaCl, 0,2 g KCl, 2,68 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO (optymalizacja hiperparametrów)&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#183;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 0,2 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;pH powinno wynosić 7,4. Doprowadzić objętość do 1 l. Sterylizować w autoklawie.</td></tr><tr><td>PBT</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>Dodać 0,5 ml Triton X-100 oraz 1,0 g BSA (klasy biologii molekularnej, odpowiednia jest frakcja V [&amp;gt;99%], ale nie&amp;rsquo;do 500 ml autoklawowanego PBS. Przefiltrować przez filtr o oczkach 0,2 mm. Przechowywać w temperaturze 4°C.&amp;#186;C.</td></tr><tr><td>&amp;#183;Stomatologia&amp;rsquo;utrwalacz s</td><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td>Wymieszać 40 ml metanolu i 10 ml DMSO. Przechowywać w &amp;#8211;20&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>3,7% FA+PBS</td><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td>Wymieszać 37% formaldehyd z buforem PBS w stosunku 1:9. Roztwór należy przygotowywać na świeżo przed każdym użyciem, a pozostałą nadwyżkę zutylizować.</td></tr><tr><td>biotynilowane przeciwciało anty-mysie IgG (H+L), wytworzone u kozy</td><td>Ab</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>biotynilowane przeciwciało anty-królicze IgG (H+L), wytworzone u kozy</td><td>Ab</td><td>Vector Laboratories</td><td>BA-1000</td><td></td></tr><tr><td>IG&amp;rsquo;S HUADS BIOTIN GTXRBT</td><td>Przeciwciała</td><td>Invitrogen</td><td>ALI3409</td><td>BioSource&amp;#8482;</td></tr><tr><td>IgG (g), przeciwko mysi z kozy</td><td>Ab</td><td>Invitrogen</td><td>M30115</td><td>CALTAG&amp;#8482;</td></tr><tr><td>Zestaw do fluorescencyjnego znakowania streptawidyną</td><td>Odczynnik</td><td>Vector Laboratories</td><td>SA-1200</td><td>Zawiera streptawidynę znakowaną trzema różnymi fluoroforami (FITC, Texas Red oraz AMCA), odpowiednią do tej procedury.</td></tr><tr><td>20% surowicy koziej/PBT</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>Roztwór ten zostanie wykorzystany jako roztwór blokujący.</td></tr><tr><td>Mały pędzelek</td><td>Narzędzie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igła dyssekcyjna z tępym grotem</td><td>Narzędzie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kulzer Technovit 7100 GMA, 3040</td><td>Odczynnik</td><td></td><td>7100 GMA , 3040</td><td>metakrylan glikolu</td></tr><tr><td>Kulzer Tungsten Histoknife H</td><td>Narzędzie</td><td>Nauki o wiązkach energii</td><td>H1310</td><td></td></tr><tr><td>75% MeOH/H2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% MeOH/PBS</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25% MeOH/PBS</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>30% EtOH/H2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;2O</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50% EtOH/H2O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>75% EtOH/H₂O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% EtOH</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Małe szklane fiolki scyntylacyjne</td><td>Narzędzie</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-339-25B</td><td></td></tr><tr><td>Probówki PCR o cienkiej ściance 0,5 ml</td><td>Narzędzie</td><td>Produkty biologii molekularnej</td><td>3430</td><td></td></tr><tr><td>Izolatory z gumy silikonowej montowane na prasę</td><td>Narzędzie</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td>JTR1L-2.5</td><td>32 mm dł. x 19 mm szer., 2,5 mm gł.</td></tr><tr><td>Cienkie ostrze żyletki</td><td>Narzędzie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5% agarozy w PBS</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="5">Przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko badanemu antygenowi lub znacznikom epitopowym: przygotować odpowiednie rozcieńczenie w buforze PBT. Przeciwciało wtórne sprzężone z biotyną: przeciwciała sprzężone z biotyną są oferowane przez różnych dostawców.</td></tr></tbody></table>

zalewanie w plastiku i skrawanie zarodków xenopus laevis

Plastic Embedding and Sectioning of Xenopus laevis Embryos

Przekroje w plastiku pozwalają zachować rzeczywistą morfologię tkanek w cienkich skrawkach, które można poddać immunostainingowi z użyciem fluorescencyjnych przeciwciał wtórnych, co czyni tę metodę bardziej użyteczną niż skrawki z tkanek zatopionych w parafinie lub mrożonych dla wielu typów tkanek. W niniejszym filmie zaprezentowano metodę barwienia, zatapiania w plastiku i wykonywania przekrojów.

Zalewanie w plastiku i skrawanie zarodków Xenopus laevis

Witam, nazywam się Sochi ota. Jestem pracownikiem postdoktorskim w laboratorium dr. Ken Cho w Katedrze Biologii Rozwojowej i Komórkowej na Uniwersytecie Kalifornijskim w Irvine. Dzisiaj zaprezentuję Państwu przygotowanie prostych przekrojów zarodka Xenopus.Procedura ta obejmuje przecinanie na pół embrionów żaby w późnym stadium gazowym, barwienie przeciwciałem przeciwko cząsteczce docelowej, infiltrację plastikiem oraz wykonanie przekrojów plastikowych o grubości 5 µm. Procedurę tę można wykorzystać do badania immunofluorescencji, immunohistochemii lub hybrydyzacji in situ z uzyskaniem obrazów o bardzo wysokiej rozdzielczości. Oto niewielkie, praktyczne narzędzia, których używam do sekcjonowania w plastiku więcej niż 10 embrionów.To jest metalowa pęseta z delta tip, a ta, numer jeden, może służyć do orientowania embrionu w plastiku. Natomiast numer dwa może być używana wraz z tym pędzlem do przenoszenia embrionu z mikrotomu na powierzchnię montażową. To jest izolator z gumy silikonowej, który kładę na powierzchni szkiełka i który tworzy zbiornik wodny, w którym mogę zamontować plastry sekcjonowanych embrionów.Teraz pokażę, jak przeprowadzić bisekcję zarodka – utrwalonego zarodka do

plastic-embedding-and-sectioning-of-xenopus-laevis-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Zakładzenie plastikowe i cięcie sekcji zarodków Xenopus laevis

W niniejszym materiale demonstrujemy mikroiniekcję cytoplazmatyczną oocytów Xenopus laevis z substratem importu jądrowego, a także przygotowanie wstrzykniętych oocytów do wizualizacji za pomocą elektronowej mikroskopii sekcji cienkich.<br...

Mikroiniekcja oocytów Xenopus laevis

Zewnętrzna warstwa ektodermy embrionalnej Xenopus stała się atrakcyjnym modelem do badań polaryzacji komórkowej. Opisano analizę, w której ocenia się subkomórkową dystrybucję białek fluorescencyjnych w komórkach ektodermy. Niniejszy protokół pomoże w odpowiedzi na pytania dotyczące przestrzennej kontroli sygnalizacji.

Polaryzowana translokacja białek fluorescencyjnych w ektodermie Xenopus w odpowiedzi na sygnalizację Wnt

Hodowla eksplantów neuronalnych z wypreparowanych embrionów Xenopus laevis wykazujących ekspresję fluorescencyjnych białek fuzyjnych umożliwia obrazowanie dynamiki cytoszkieletu stożka wzrostu.

Kultury eksplantów neuronalnych z Xenopus laevis

Technika przeszczepiania tkanki twarzy "Extreme Anterior Domain" pomiędzy embrionami Xenopus laevis została opracowana. Tkanka może być przenoszona z jednego tła ekspresji genów do drugiego, co pozwala na badanie lokalnych wymagań dotyczących rozwoju twarzoczaszki i sygnalizowania interakcji między regionami twarzy.

Przeszczepy twarzy w zarodkach Xenopus laevis

Ten protokół opisuje, jak przeprowadzić preparację premigracyjnego grzebienia nerwowego czaszki (NC) od Xenopus laevis neurulas. Te eksplantaty można posiewać na fibronektynie i hodować in vitro lub przeszczepiać z powrotem do zarodków gospodarza. Technika ta pozwala na badanie mechanizmów przejścia, migracji i różnicowania nabłonka NC do mezenchymy.

Rozwarstwienie grzebienia nerwowego Xenopus laevis do hodowli eksplantatów in vitro lub przeszczepu in vivo

Manuskrypt tutaj dostarcza prosty zestaw metod do analizy wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów w Xenopus. Stwarza to kontekst do testowania zdolności innych białek do modyfikowania rozkładu ligandów i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, które mogą dać wgląd w mechanizmy regulujące gradienty morfogenu.

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Ten artykuł przedstawia wygodną i szybką metodę wizualizacji różnych populacji komórek nerwowych w ośrodkowym układzie nerwowym zarodków Xenopus za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego na skrawkach.

Ocena pierwotnej neurogenezy w zarodkach Xenopus za pomocą barwienia immunologicznego

Prezentujemy dwuczęściowy protokół, który łączy fluorescencyjne obrazowanie wapnia z hybrydyzacją in situ, pozwalając eksperymentatorowi skorelować wzorce aktywności wapnia z profilami ekspresji genów na poziomie pojedynczej komórki.

Fluorescencyjne obrazowanie wapnia i późniejsza hybrydyzacja in situ w celu charakterystyki prekursorów neuronalnych u Xenopus laevis

Opisujemy metodę fizycznego zwężania do tworzenia mini embrionów z zarodków Xenopus laevis o jednokomórkowej liczbie komórek.

Manipulacja fizyczna w celu generowania mini embrionów Xenopusa

Naucz się metody osadzania i sekcjonowania zarodków Xenopus laevis w tworzywie sztucznym, która zachowuje morfologię tkanek i umożliwia immunofluorescencję. Technika ta pozwala uzyskać obrazy wysokiej rozdzielczości.

Zalewanie w plastiku i skrawanie zarodków Xenopus laevis

Przeglądaj więcej filmów