Osadzanie i sekcjonowanie zarodków Xenopus laevis z tworzywa sztucznego

Witam, nazywam się Soczi ota. Jestem naukowcem z tytułem doktora w laboratorium dr Kena Cho na Wydziale Biologii Rozwoju i Komórki Uniwersytetu Kalifornijskiego. Irv I Dzisiaj pokażę Państwu, jak przygotować prosty przekrój zarodka xenopus.

Procedura ta obejmuje bisekcję zarodka żaby w późnym stadium gazowym, barwienie przeciwciałem przeciwko interesującej cząsteczce, infiltrację do tworzywa sztucznego i wykonanie tego samego odcinka z tworzywa sztucznego o grubości pięciu mikronów. Procedura ta może być wykorzystana do badania immunohistochemii immunofluorescencyjnej lub hybrydyzacji in situ z obrazem o bardzo wysokiej rozdzielczości. Okej, to są małe, poręczne narzędzia, których używam do cięcia zarodków z tworzywa sztucznego powyżej 10 osób.

To jest metalowa pęseta z końcówką delta, a ta, numer jeden, może być używana do orientacji zarodka w plastiku. I po drugie, można go używać razem z tym pędzlem do przenoszenia zarodka z mikrotomu na powierzchnię montażową. Jest to izolator z gumy silikonowej, który kładę na powierzchni zjeżdżalni i który sprawia, że ciąg wodny jest miejscem, w którym mogę zamontować plastry plastikowych zarodków podzielonych na sekcje.

Teraz pokazuję, jak przeciąć zarodek, utrwalony zarodek do testu, takiego jak hybrydyzacja nstitute lub wykrywanie immunofluorescencyjne. A żeby przeciąć zarodek na pół, używam tej bardzo cienkiej siatki pustynnej, którą można kupić w sklepie spożywczym. Myślę, że tak, istnieją stałe zarodki, które utrwalają komórkę 3,7% formalnego haju z dnia na dzień.

I to jest, jak to naprawisz, zależy od celu. Jest to naprawiane z dnia na dzień. W celu hybrydyzacji naciętej można zdecydować się na fiksację na noc, ale w przypadku detekcji immunofluorescencyjnej, w której wykrywa się białko wewnątrz zarodka, nie zalecałem zbyt długiej fiksacji.

A ja raczej wykonuję utrwalanie wysokości 3,7% formy tylko przez dwie godziny, aby zminimalizować wpływ na subkomórkową lokalizację białka, a także uniknąć nadmiernej fiksacji, aby umożliwić dobrą penetrację przeciwciała na etapie wykrywania. Okej, teraz przeprowadzam sekcję tego zarodka przez ścianę wybuchu, przecinając lewą i prawą stronę. Więc teraz widzę, że to ma zarodek w stadium 11, w którym PO jest aż od strony grzbietowej do brzusznej, ale bi zarodek.

Przyjrzyjmy się tej prawej rękojeści. Widać wybuch zarówno po stronie grzbietowej, jak i brzusznej, ale strona grzbietowa jest oczywista, ponieważ ta intruzja wyraźnie dociera do najgłębszej, głębokiej wnętrza zarodka w porównaniu ze stroną brzuszną. Więc to jest dobry kawałek, dobry kawałek podzielony na pół do badania zarówno strony grzbietowej, jak i brzusznej.

Wewnątrz zarodka, tego wypreparowanego zarodka, zamierzam użyć immunofluorescencji białka wyrażonego wewnątrz zarodka. A do immunofluorescencji lub immunohistochemii używa się przeciwciała specyficznego dla przeciwciała do wykrywania. Problem polega jednak na tym, że przeciwciała nie przenikają zbyt dobrze do wnętrza zarodka.

Więc jeśli używasz całego wierzchowca, całego zarodka wierzchowca, nie możesz tego wiedzieć. Nie możesz badać wzorca ekspresji swoich białek w zarodku. Ale używając tego wstępnie przeciętego na pół zarodka, możesz zbadać, jaki jest wzorzec ekspresji w komórce w głębi zarodka.

Ach, zarodek poplamiony plamą został już utrwalony w 3,7%Formaldehyd odwodniony w etanolu i przeniknięty do plastiku, który nazywa się techno 7, 100. A ten zestaw zawiera trzy części, które są główną częścią płynu i tym proszkiem, który nazywa się utwardzaczem. A ten płyn nazywa się utwardzaczem drugim.

Najpierw mieszam tę główną część i utwardzacz ze 100 do jednego reio, co da ci tę mieszankę infiltracyjną. I to jest to, co jest, to jest płyn, do którego przenika mi ten zarodek. A to jest jeszcze płynne, więc jeszcze nie stwardnieje.

A to jest to, że próbki zarodków pozostawia się na noc w tej mieszance infiltracyjnej, aby upewnić się, że próbka zarodka jest całkowicie podsumowana w tym plastiku. Teraz biorę ten jeden z próbek zarodka za pomocą pipety transferowej i przenoszę do cienkościennej probówki 0,5 MPCL, której używam jako formy do zatapiania. Następnie z tego zarodka usuwam nadmiar płynu.

A teraz ten zarodek, ten zarodek jest już gotowy do osadzenia w twardniejącym plastiku. Aby uzyskać twardniejący plastik, mieszasz tę mieszankę infiltracyjną z tą rurką do utwardzania w stosunku 15 do jednego. Na przykład, jeśli wezmę 750 mikrolitrów tej mieszanki infiltracyjnej do podparcia rurki, to powinienem również dodać 50 mikrolitrów tego utwardzacza, aby zainicjować polimeryzację plastiku po jego dodaniu, ups, zamknij nakrętkę, a następnie delikatnie wymieszaj w ten sposób.

I nie powinieneś robić wiru, ponieważ tlen jest inhibitorem reakcji polimeryzacji. Dodaj około 250 mikrolitrów tej mieszaniny do zarodka. A ten etap polimeryzacji trwa prawie cztery godziny, niż powinieneś, nie musisz się w ogóle spieszyć.

Po dodaniu najpierw tego polimeryzującego tworzywa sztucznego, możesz go w górę iw dół, aby zarodek unosił się w plastiku. A teraz biorę tę metalową pęsetę, aby popychać zarodek, aby ustawić go tak, aby powierzchnia tnąca zarodka doszła do dna tej formy do osadzania. Następnie zamknij nakrętkę, ponieważ tlen jest inhibitorem reakcji utwardzania i pozostaw ją na cztery godziny, aby umożliwić reakcję utwardzania.

Po tym jest to HUD już stado w próbce. Nakładasz rodzaj kleju na tę próbkę, aby upewnić się, że ta plastikowa twarda część nie wyjdzie z tej formy. To jest to, to jest kolejny plastik, który działa w tym celu jako klej o nazwie techno 30 40.

I mieszam ten proszek i płyn z 2, 2, 1 oto 0,6 grama tego proszku. Więc zamierzam dodać 300 mikrolitrów tego płynu, a następnie szybko go wymieszać i ten plastik dość szybko staje się twardy. Więc to jest partia, musisz być trochę twardy, a następnie wlać to do tej już usłyszanej próbki.

To wystarczy. Zamknij korek. Wyglądam tak.

A to zajmie około 30 do 60 minut, zanim stanie się twarde. I to jest ten, który jest gotowy do działania. Najpierw odcinam końcówkę formy nożem do tektury, odklejam tę końcówkę od tej formy.

Więc teraz ten osadzony zarodek jest odsłonięty. A także odciąłem tę czapkę, bo jej nie potrzebuję. Teraz biorę tę igłę Roya, mam na myśli nie igłę ostrza Roya, która jest twardsza niż zwykłe ostrze do plam używane do cięcia parin.

Na krótko zanurzam to w Xin, aby było czyste. Ustaw to na, ustaw to na uchwyt ostrza i wytrzyj nadmiar zaine. A czasami czyszczę ten obszar również za pomocą zaine, ponieważ czystość tego obszaru jest absolutnie ważna.

Teraz jest gotowy do sekcji. Przed przystąpieniem do cięcia ustawiam komorę montażową. Więc to jest szkło ślizgowe.

A do tego wkładam tę gumę silikonową i popycham rolnika do końca, żeby nie było, nie było żadnego wycieku. I połóż to na podgrzewaczu zjeżdżalni i wlej tę czystą wodę medyczną, aby zrobić nasz basen. I wlej tyle wody, aby dostać się, aż uzyskasz powierzchnię wody powodziowej.

Jest to ważne, ponieważ ta powierzchnia wody powodziowej daje równy rozkład napięcia powierzchniowego wody, co jest ważne, aby odcinek rozciągał się równomiernie. Teraz robię sekcje, ale zanim to zrobię, zakładam tę maskę, ponieważ każdy fragment jest tak lekki, tak lekki i mój, że moja pierś może zdmuchnąć ze sceny. Więc noszę tę maskę.

A teraz zacznij dzielić na sekcje. Po tym, jak zdobędziesz pewną liczbę fragmentów sekcji na scenie, bierzesz je pędzlem i powoli poruszasz się po szczycie tej górskiej komnaty i uderzasz tym pędzlem, aby te kawałki dostały się do wody pod wpływem grawitacji. A gdy tylko wylądują na wodzie, rozciągają się, tworząc okrągły kawałek na powierzchni wody.

Jak tam to światło po całonocnym suszeniu. Teraz wygląda to tak i tak. Teraz próbka jest gotowa do kontaktu z DPI dla jądrowego DNA.

A potem możesz uczyć się pod mikroskopem. Dzisiaj pokazałem Wam przygotowanie przekroju plastycznego przy użyciu zarodka żaby w późnym stadium gazowym. Ta procedura jest bardzo przydatna do badania podkomórek lub lokalizacji białka, których nie można badać za pomocą techniki osadzania paren, a także ogólnie nawet w przypadku hybrydyzacji resztkowej.

Ta plastikowa sekcja zapewnia również nawet hybrydyzację szczątkową, ta procedura może dać znacznie wyższy poziom obrazu niż próbka paren lub zamrożonego przekroju.