Name: Otrzymywanie oligomerycznego β-amyloidu1-42 i indukcja zaburzenia plastyczności synaptycznej na wycinkach hipokampa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-14T17:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 41 s
Description: Poznaj metodę otrzymywania oligomerycznego β-amyloidu 1-42 i indukcji zaburzeń plastyczności synaptycznej na wycinkach hipokampa szczura. Protokół ten umożliwia badanie mechanizmów dysfunkcji synaptycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez NIH National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) (NS049442).

Resuspensja peptydu β-amyloidu
Przed rozpoczęciem należy przygotować:
<ul>
	<li>Aβ1-42 (liofilizowany proszek)</li>
	<li>1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol (HFIP)</li>
	<li>Probówki do mikrocentryfugi z polipropylenu o niskim stopniu wiązania (1.5 ml)</li>
	<li>Strzykawka GasTight firmy Hamilton z teflonowym ogranicznikiem tłoka (250 μl)</li>
	<li>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</li>
</ul>
<ol>
	<li>Pozostaw liofilizowany Aβ1-42 w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby uniknąć kondensacji pary wodnej po otwarciu fiolki z peptydem.</li>
	<li>W dygestorium resuspenduj peptyd Aβ1-42 w lodowatym HFIP, aby uzyskać roztwór o stężeniu 1 mM, a następnie mieszaj roztwór w wortexie przez kilka sekund.</li>
	<li>Używając szklanej strzykawki Hamilton GasTight z teflonowym tłokiem, szybko i równomiernie podziel roztwór Aβ1-42/HFIP do trzech polipropylenowych fiolek i szczelnie je zamknij.</li>
	<li>Fiolki inkubuj przez 2 godziny, aby umożliwić monomeryzację Aβ. Następnie otwórz fiolki i odparuj roztwór Aβ1-42/HFIP pod próżnią za pomocą wirówki SpeedVac (800 g, temperatura pokojowa), aż na dnie fiolek pojawi się przejrzysty film peptydowy. Starannie kontroluj temperaturę wewnątrz wirówki SpeedVac, aby uniknąć degradacji peptydu (max 25°C).</li>
	<li>Zamknij fiolki i przechowuj alikwoty w temperaturze -80°C. Film Aβ można przechowywać przez 6 miesięcy.</li>
	<li>Resuspenduj jeden film, dodając DMSO, aby uzyskać stężenie Aβ1-42 do 5 mM. Poddaj próbkę sonikacji w kąpieli wodnej przez 10 minut, aby zapewnić całkowitą resuspensję.</li>
	<li>Podziel roztwór Aβ1-42 o stężeniu 5 mM do polipropylenowych fiolek. Szczelnie zamknij wszystkie fiolki i przechowuj je w temperaturze -20°C. Alikwoty należy rozmrażać tylko raz. Uważaj na kondensację wody wewnątrz zamrażarki. Peptydy w roztworze ulegają bardzo łatwej degradacji.</li>
</ol>
Oligomeryzacja
Przed rozpoczęciem przygotuj:
<ul>
	<li>Aβ1-42/DMSO (5mM)</li>
	<li>Sterylny bufor fosforanowy</li>
	<li>Polipropylenowe probówki do mikrowirowania o niskim stopniu wiązania (1,5 ml)</li>
	<li>Polipropylenowe probówki wirówkowe o niskim stopniu wiązania (50 ml)</li>
</ul>
<ol>
	<li>Rozcieńcz uzyskaną aликwotkę Aβ1-42/DMSO o stężeniu 5mM sterylnym buforem fosforanowym (do objętości 100 μl).</li>
	<li>Mieszaj w wstrząsarzu typu vortex przez 30 sekund, a następnie inkubuj przez 12 godzin w temperaturze 4°C.</li>
</ol>
Opracowanie preparatów skrawków hipokampa
Podczas traktowania skrawków hipokampa ważne jest unikanie niespecyficznej adhezji peptydów do zlewów, powierzchni drenów perfuzyjnych oraz komory rejestracyjnej. Należy preferencyjnie stosować pojemniki i dreny z polipropylenu o niskiej wiązalności. Należy unikać stosowania szkła laboratoryjnego lub plastikowych wyrobów ogólnego przeznaczenia. Media perfuzyjne powinny być wolne od surowicy lub albuminy.
Perfuzja Aβ
Przed rozpoczęciem należy przygotować:
<ul>
	<li>Oligomeryzowany Aβ1-42</li>
	<li>Bufor do rejestracji (w mM: 124 NaCl, 4,4 KCl, 1 Na2HPO4, 25 NaHCO3, 2 CaCl2, 2 MgCl2 oraz 10 glukozy)</li>
	<li>Układ do rejestracji elektrofizjologicznej z komorą interfejsową</li>
	<li>Poprzeczne skrawki hipokampa inkubowane w natlenionym buforze do rejestracji przez co najmniej 90 minut po wycięciu (T = 29° C; stała szybkość perfuzji = 2 ml/minutę)</li>
</ul>
<ol>
	<li>Bezpośrednio przed eksperymentem rozcieńczyć alikwot oligomeryzowanego Aβ1-42 do odpowiedniego stężenia roboczego (200 nM lub wyższego) w probówce polipropylenowej z uprzednio natlenionym buforem rejestracyjnym.</li>
	<li>Przez 20 minut perfundować skrawki roztworem Aβ1-42 przed indukcją plastyczności synaptycznej.</li>
</ol>
Indukcja plastyczności i obserwacje kontrolne
<ol>
	<li>Zazwyczaj najszerzej stosowanym modelem plastyczności synaptycznej jest LTP. Można go indukować poprzez stymulację tetaniczną danej synapsy w hipokampie. Rejestrujemy odpowiedzi polowe z synaps pomiędzy projekcjami włókien komisarialnych Schaffera a neuronami piramidowymi obszaru CA1 w stratum radiatum. Nasza stymulacja tetaniczna polega na stymulacji wiązkami theta (theta burst stimulation), która obejmuje 3 serie oddzielone 15 sekundowymi odstępami. Każda seria składa się z 10 wiązek o częstotliwości 5 Hz, gdzie każda wiązka zawiera 5 impulsów o częstotliwości 100 Hz. Zastosuj stymulację tetaniczną natychmiast po zakończeniu perfuzji oligomeryzowanego Aβ.</li>
	<li>Bezpośrednio po stymulacji tetanicznej powróć do perfuzji normalnym buforem rejestracyjnym. Przez cały czas trwania eksperymentu utrzymuj stałą prędkość perfuzji, temperaturę komory rejestracyjnej oraz odpowiednie natlenienie.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki i możliwe problemy
Oligomery Aβ, otrzymane zgodnie z klasycznym protokołem Stine i wsp.1, generują monomery Aβ oraz różnorodne oligomery o różnych rozmiarach (dimery, trimery itp.). Perfuzja oligomeryzowanego Aβ1-42 prowadzi do zmniejszenia LTP w skrawkach traktowanych Aβ w porównaniu ze skrawkami kontrolnymi. W naszych warunkach eksperymentalnych, z wykorzystaniem samców myszy C57BL/6J w wieku 3-5 miesięcy, LTP w skrawkach traktowanych 200 nM Aβ wynosi średnio 150% wartości bazowych dwie godziny po stymulacji tetanicznej, podczas gdy w skrawkach kontrolnych wartości LTP wynoszą średnio 200-250% wartości bazowej2. W niektórych przypadkach traktowanie Aβ może nie doprowadzić do redukcji LTP w hipokampie. Do kilku krytycznych błędów, które mogą wystąpić, należą: nadmierne wysuszenie filmu podczas zagęszczania Aβ oraz niepełna oligomeryzacja. Perfuzja Aβ w skrawkach hipokampa może być kolejnym źródłem problemów ze względu na właściwości fizykochemiczne peptydy Aβ w roztworze, który wykazuje tendencję do niespecyficznej adhezji do tworzyw sztucznych. Rozwiązywanie tych problemów omówiono poniżej.

<ol><li>Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+characterization+of+conditions+for+amyloid-beta+peptide+oligomerization+and+fibrillogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis.</a> J Biol Chem. 278, 11612-11622 (2003).</li>
<li>Vitolo, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+beta+-peptide+inhibition+of+the+PKA%2FCREB+pathway+and+long-term+potentiation%3A+reversibility+by+drugs+that+enhance+cAMP+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Amyloid beta -peptide inhibition of the PKA/CREB pathway and long-term potentiation: reversibility by drugs that enhance cAMP signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 13217-13221 (2002).</li>
<li>Puzzo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Picomolar+amyloid-beta+positively+modulates+synaptic+plasticity+and+memory+in+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus.</a> J Neurosci. 28, 14537-14545 (2008).</li>
<li>Lewczuk, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+sample+collection+tubes+on+cerebrospinal+fluid+concentrations+of+tau+proteins+and+amyloid+beta+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Effect of sample collection tubes on cerebrospinal fluid concentrations of tau proteins and amyloid beta peptides.</a> Clin Chem. 52, 332-334 (2006).</li>
<li>Masliah, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+synaptic+dysfunction+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of synaptic dysfunction in Alzheimer's disease.</a> Histol Histopathol. 10, 509-519 (1995).</li>
<li>Cullen, W. K., Suh, Y. H., Anwyl, R., Rowan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Block+of+LTP+in+rat+hippocampus+in+vivo+by+beta-amyloid+precursor+protein+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Block of LTP in rat hippocampus in vivo by beta-amyloid precursor protein fragments.</a> Neuroreport. 8, 3213-3217 (1997).</li>
<li>Itoh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impairments+of+long-term+potentiation+in+hippocampal+slices+of+beta-amyloid-infused+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Impairments of long-term potentiation in hippocampal slices of beta-amyloid-infused rats.</a> Eur J Pharmacol. 382, 167-175 (1999).</li>
<li>Walsh, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+secreted+oligomers+of+amyloid+beta+protein+potently+inhibit+hippocampal+long-term+potentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo.</a> Nature. 416, 535-539 (2002).</li>
<li>Lambert, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nonfibrillar+ligands+derived+from+Abeta1-42+are+potent+central+nervous+system+neurotoxins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6448-6453 (1998).</li>
<li>Gong, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ubiquitin+hydrolase+Uch-L1+rescues+beta-amyloid-induced+decreases+in+synaptic+function+and+contextual+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory.</a> Cell. 126, 775-788 (2006).</li>
<li>Trinchese, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+calpains+improves+memory+and+synaptic+transmission+in+a+mouse+model+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Inhibition of calpains improves memory and synaptic transmission in a mouse model of Alzheimer disease.</a> J Clin Invest. 118, 2796-2807 (2008).</li>
</ol>

Doświadczenia na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi i przepisami ustanowionymi przez IACUC Uniwersytetu Columbia.

Jak opisano powyżej, kilka problemów podczas przygotowywania oligomerycznego Aβ może skutkować niezakłóconym LTP. Jednym ze sposobów oceny, czy doszło do degradacji Aβ lub braku oligomeryzacji Aβ, jest analiza preparatu Aβ za pomocą analizy TRIS-Tricine PAGE/Western Blotting oraz analitycznej ultrawirówki (nieopisanej w niniejszym protokole). Gdy próbki do Western Blottingu są przygotowywane w warunkach niedenaturujących/nieredukujących, prawidłowo przygotowany preparat powinien wygenerować sygnaturę Western Blotting z p...

<table><tbody><tr><td>A&amp;#946; 1-42 (liofilizowany)</td><td>American Peptide</td><td>62-0-80</td><td></td></tr><tr><td>1,1,1,3,3,3-heksafluoro-2-propanol (HFIP)</td><td>Fluka</td><td>52517</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Biotium, Inc.</td><td>90082</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylenowe probówki wirówkowe 50mL</td><td>Corning</td><td>05-538-67</td><td></td></tr><tr><td>Mikroprobówki MaxyClear 1.5ml o maksymalnym odzysku</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-150-L-C</td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowy bufor solny pH 7.4</td><td>Invitrogen</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki GASTIGHT 250 &amp;mu;L</td><td>Hamilton Co</td><td>1725</td><td></td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa</td><td>Branson</td><td>3510</td><td></td></tr><tr><td>System koncentracyjny Savant SpeedVac</td><td>Różne</td><td>SC 110A</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie oligomerów β-amyloidu1-42 i indukcja upośledzenia plastyczności synaptycznej w skrawkach hipokampa

Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Upośledzenie połączeń synaptycznych prawdopodobnie leży u podłoża subtelnych zmian amnestycznych występujących we wczesnych stadiach choroby Alzheimera (AD). Wiadomo, że β-amyloid (Aβ), peptyd produkowany w dużych ilościach w przebiegu AD, redukuje długotrwałe wzmocnienie synaptyczne (LTP), które jest komórkowym korelatem uczenia się i pamięci. W rzeczywistości upośledzenie LTP wywołane przez Aβ stanowi przydatny paradygmat eksperymentalny do badania dysfunkcji synaptycznych w modelach AD oraz do przesiewania leków zdolnych łagodzić lub odwracać takie zaburzenia synaptyczne. Badania wykazały, że Aβ wywołuje zaburzenia LTP przede wszystkim za pośrednictwem swojej formy oligomerycznej. W niniejszej pracy przedstawiamy szczegółowy protokół upośledzania LTP poprzez perfuzję oligomeryzowanego syntetycznego peptydu Aβ1-42 na ostre skrawki hipokampa. W tym filmie opisujemy krok po kroku procedurę przygotowania oligomerycznego Aβ1-42Następnie śledzimy pojedynczy eksperyment, w którym LTP zostaje zredukowane w przekrojach hipokampa poddanych działaniu oligomeryzowanego Aβ1-42w porównaniu do plastrów w eksperymencie kontrolnym, w którym nie zastosowano Aβ1-42doszło do ekspozycji.

Jedną z cech choroby Alzheimera jest podwyższony poziom peptydu Aβ1-42. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół przygotowania syntetycznych oligomerów Aβ1-42, które upośledzają długotrwałe wzmocnienie synaptyczne w hipokampie, będące komórkowym korelatem pamięci. Procedura ta jest przydatna do badania mechanizmów patologii indukowanej przez Aβ oraz do przesiewowego badania leków.

Przygotowanie oligomerów β-amyloidu1-42 i indukcja upośledzenia plastyczności synaptycznej w skrawkach hipokampa

Upośledzenie połączeń synaptycznych prawdopodobnie leży u podstaw subtelnych zmian amnestycznych występujących we wczesnych stadiach choroby Alzheimera (AD). ...

Syntetyczny beta amyloid 1 42 zostaje resuspendowany w HFIP w celu monomeryzacji peptydu, a następnie skoncentrowany do postaci filmu w celu oligomeryzacji. Film zostaje RESUSPENDOWANY w DMSO, rozcieńczony w buforze fosforanowym i inkubowany przez noc. Na koniec peptyd oligomeryczny zostaje rozcieńczony buforem rejestrującym i perfundowany na świeże skrawki hipokampa, gdzie ocenia się wpływ ekspozycji na beta amyloid na plastyczność synaptyczną.Witamy w laboratorium Avio Orio na Uniwersytecie Columbia w Nowym Jorku. Dziś przedstawimy zoptymalizowaną przez nas procedurę przygotowania oligomerów beta-amyloidu, która opiera się na protokole pierwotnie zaproponowanym przez Steina i współpracowników w 2003 roku. W tym laboratorium wykorzystujemy tę procedurę do badania dysfunkcji synaptycznych indukowanych przez beta-amyloid.Zacznijmy zatem. Pozostaw fiolkę z liofilizowanym proszkiem beta-amyloidu w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby uniknąć kondensacji po otwarciu jej pod wyciągiem.Zamknąć fiolkę i wymieszać na wirówce typu vortex; za pomocą strzykawki Hamiltona szybko podzielić roztwór w równych częściach pomiędzy trzy polipropylenowe probówki do mikrocentryfugi o niskim stopniu wiązania. Zamknąć probówki i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, aby umożliwić stabilizację peptydów; otworzyć probówki i umieścić je w koncentratorze próżniowym (SpeedVac) w celu zagęszczenia roztworu. Wirować z prędkością 800 Gs pod próżnią przez około 15 minut.Należy upewnić się, że temperatura nie przekroczy 25 °C, aby uniknąć degradacji białek. Wirowanie jest zakończone, gdy na dnie probówki pojawi się przejrzysta, sucha warstwa peptydowa. Warstwa ta może być trudna do zauważenia; należy zamknąć probówki i przechowywać niewykorzystane alikwoty w temperaturze -80 °C przez maksymalnie sześć miesięcy. W dygestorium należy resuspender warstwę peptydową w DMSO do końcowego stężenia 5 mM, a następnie poddać działaniu myjki ultradźwiękowej w łaźni wodnej przez 10 minut.Aby zapewnić całkowite resuspensowanie peptydu, należy przechowywać alikwoty po 1,6 µL roztworu beta-amyloidu o stężeniu 5 mM w temperaturze -20 °C. Każda alikwota powinna zostać rozmrożona tylko raz; w dniu poprzedzającym eksperyment rozmrozić jedną alikwotę roztworu beta-amyloidu 5 mM i dodać 98,4 µL sterylnego buforu fosforanowego do uzyskania końcowej objętości 100 µL, wymieszać w wstrząsarce wortex przez 30 sekund i inkubować w temperaturze 4 °C przez 12 godzin. Aby umożliwić rozpoczęcie agregacji przed eksperymentem, inkubować świeży lizat hipokampa przez 90 minut.W standardowym buforze rejestracyjnym elektrodę stymulującą umieszcza się na kolaterałach Shafera, a elektrodę rejestrującą na stratum radium. Po uzyskaniu odpowiedzi i ustabilizowaniu linii bazowej przez 10 minut, należy rozcieńczyć beta-amyloid do stężenia 200 nano molar. W buforze rejestracyjnym beta-amyloid wiąże się nieswoiście ze szkłem, dlatego należy w maksymalnym stopniu wykorzystywać tworzywa sztuczne.Przez 20 minut perfunduj plastry roztworem beta-amyloidu. Zastosuj preferowaną stymulację tonu X. Na przykład, w przypadku stymulacji theta burst bezpośrednio po tetanizacji, powróć do perfuzji standardowym buforem rejestracyjnym.Monitoruj zapis przez co najmniej dwie godziny po tężcu, aby potwierdzić indukcję LTP i zaobserwować efekty działania beta-amyloidu. Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować oligomeryczny beta-amyloid 1-42 w celu indukcji upośledzenia plastyczności synaptycznej w skrawkach hipokampa. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że nadmierne wysuszenie filmu peptydowego może prowadzić do niepełnej agregacji.Kluczowe jest również stosowanie tworzyw sztucznych w przypadku roztworów beta-amyloidu, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu peptydów. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

preparation-oligomeric-amyloid1-42-induction-synaptic-plasticity

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przygotowanie oligomerycznego β-amyloidu1-42 oraz indukcja upośledzenia plastyczności synaptycznej na kawałkach hipokampu

W niniejszym artykule przedstawiono procedury przygotowywania skrawków hipokampa szczurów oraz myszy transgenicznych w celu badania zmian synaptycznych związanych ze starzeniem się mózgu i neurodegeneracyjnymi chorobami starczymi, takimi jak choroba Alzheimera.

Przygotowanie ostrych skrawków hipokampa szczurów i myszy transgenicznych do badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidowej

Ten artykuł przedstawia kompletną metodologię przygotowania i konserwacji in vitro ostrych wycinków hipokampa od dorosłych myszy. Protokół ten pozwala na rejestrowanie bardzo stabilnego, długotrwałego wzmocnienia (LTP) przez ponad 8 godzin ze wskaźnikiem sukcesu 95%.

Ulepszone przygotowanie i konserwacja wycinków myszy z hipokampa w celu uzyskania bardzo stabilnego i powtarzalnego zapisu długotrwałego wzmocnienia

Tutaj opisujemy adaptację protokołów używanych do indukowania plastyczności homeostatycznej w neuronach do badania plastyczności receptorów sprzężonych z białkiem G astrocytów. Metoda ta, ostatnio wykorzystana do badania zmian w mGluR grupy astrocytarnej I u młodych myszy, może być stosowana do pomiaru skalowania różnych astrocytarnych GPCR w tkance dorosłych myszy in situ i in vivo oraz do lepszego zrozumienia wrażliwości receptorów astrocytarnych na zmiany aktywności neuronalnej.

Indukowanie plastyczności receptorów astrocytarnych poprzez manipulację szybkością odpalania neuronów

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej stereotaktycznej infuzji beta-amyloidu do mózgu. Metodologia ta zapewnia alternatywny model mysi in vivo w celu rozwiązania krótkoterminowych skutków beta-amyloidu na neurony mózgowe.

Stereotaktyczny wlew oligomerycznego beta-amyloidu do hipokampa myszy

Model zwierzęcy z wstrzyknięciem β amyloidu (Aβ) umożliwia podawanie określonej ilości i gatunku fragmentów Aβ oraz redukuje indywidualne różnice w każdej badanej grupie. Protokół ten opisuje wstrzyknięcie Aβ do komory mózgowej (ICV) bez instrumentów stereotaktycznych, umożliwiając wytwarzanie nieprawidłowości behawioralnych podobnych do choroby Alzheimera u normalnych myszy.

Wstrzyknięcie domózgowo-komorowe peptydów β amyloidu u normalnych myszy w celu ostrego wywołania deficytów poznawczych podobnych do choroby Alzheimera

Ten protokół demonstruje implementację zoptymalizowanej metody ochronnego odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) do przygotowania wycinków mózgu. Pojedynczy preparat podłoża jest używany do niezawodnego uzyskiwania zdrowych wycinków mózgu od zwierząt w każdym wieku i do różnych zastosowań eksperymentalnych.

Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy

Aby zbadać efekty Aβo in vivo, opracowaliśmy model oparty na powtarzających się wlewach rozpuszczalnego Aβo z hipokampa w połączeniu z ciągłym wlewem przeciwciała Aβo (6E10) w hipokampie za pomocą pomp osmotycznych, aby przeciwdziałać neurotoksycznemu działaniu Aβo.

Neurodegeneracja w zwierzęcym modelu przewlekłego wlewu oligomerów beta-amyloidu jest przeciwdziałana przez leczenie przeciwciałami podawanymi pompami osmotycznymi

Ten protokół opisuje stabilizację poziomu tlenu w małej objętości buforu z recyklingu oraz metodologiczne aspekty rejestrowania plastyczności synaptycznej zależnej od aktywności w zanurzonych ostrych wycinkach hipokampa.

Rejestrowanie plastyczności synaptycznej w ostrych wycinkach hipokampa utrzymywanych w systemie komór do recyklingu, perfuzji i zanurzenia o małej objętości

To jest protokół do naśladowania choroby Alzheimera u szczurów poprzez ocenę upośledzenia pamięci przestrzennej, zmian patologicznych neuronów, obciążenia neuronalnym białkiem beta amyloidu (Aβ) i agregacji splątków neurofibrylarnych, indukowanej przez wstrzyknięcie Aβ25-35 w połączeniu z trichlorkiem glinu i rekombinowanym ludzkim transformującym czynnikiem wzrostu-β1.

Stworzenie cennego naśladownictwa choroby Alzheimera w szczurzym modelu zwierzęcym poprzez wstrzyknięcie do komory mózgowej złożonego białka beta amyloidu

Prezentujemy metodę, która może dostarczyć dalszych informacji na temat wczesnych zdarzeń leżących u podstaw neurodegeneracji i opiera się na uznanej technice mózgu ex-vivo, łącząc zalety eksperymentów in vivo i in vitro. Co więcej, jest to wyjątkowa okazja do bezpośredniego porównania grupy leczonej i nieleczonej na tej samej płaszczyźnie anatomicznej.

Alternatywne podejście do badania pierwotnych zdarzeń w neurodegeneracji przy użyciu wycinków mózgu szczurów ex vivo

Ten protokół opisuje, jak przygotować oligomery Aβ z syntetycznego peptydu in vitro i ocenić względne ilości oligomeru Aβ za pomocą analizy punktowej.

Przygotowanie i ocena a11-dodatnich oligomerów β-amyloidowych za pomocą analizy igłowej

Poznaj metodę otrzymywania oligomerycznego β-amyloidu 1-42 i indukcji zaburzeń plastyczności synaptycznej na wycinkach hipokampa szczura. Protokół ten umożliwia badanie mechanizmów dysfunkcji synaptycznej.

Przygotowanie oligomerów β-amyloidu_1-42 i indukcja upośledzenia plastyczności synaptycznej w skrawkach hipokampa

Przeglądaj więcej filmów