Fotoaktywacja oparta na dwufotonach w żywych zarodkach danio pręgowanego

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest fotoaktywacja określonego czynnika światłoczułego, takiego jak chemicznie „zaklatkowany” barwnik fluorescencyjny, w żywym embrionie danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki. Osiąga się to poprzez wstrzyknięcie czynnika światłoczułego do embrionów w stadium jednej komórki wykazujących żywy marker genetyczny, co pozwala na zlokalizowanie i precyzyjne ukierunkowanie na dowolne komórki zainteresowania. W drugim kroku embriony są hodowane i osadzane w niskotopliwym agarze, który unieruchamia żywy embrion.

Następnie wykorzystuje się mikroskopię dwufotonową w celu zlokalizowania widocznego fluorescencyjnego markera transgenicznego. Następnie aktywuje się czynnik światłoczuły w pożądanej płaszczyźnie ogniskowej i monitoruje zakres fotoaktywacji. Dalsze losy powstałych komórek oznakowanych mogą być następnie śledzone w późniejszych stadiach embrionalnych.

Niniejszą procedurę można wykorzystać do aktywacji różnych związków z rozdzielczością pojedynczej komórki w żywych organizmach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia konfokalna czy lampa błyskowa, jest możliwość fotoaktywacji tkanek położonych stosunkowo głęboko, na poziomie osiowym rzędu kilku mikronów, przy stosunkowo niskiej fototoksyczności. Przedstawiona tutaj metoda jest wykorzystywana do śledzenia krawędzi linii i może być stosowana do fotoaktywacji wielu komponentów, co pozwala na ukierunkowaną kontrolę nad procesami rozwojowymi i fizjologicznymi. Wieczorem przed iniekcją należy przygotować zbiorniki do tarła, oddzielając samce i samice danio pręgowanego z linii transgenicznej wykazującej widoczny znacznik fluorescencyjny.

W tym eksperymencie linia transgeniczna wykazuje ekspresję GFP pod kontrolą promotora neurogenic N one. Odmierz próbkę 5% dekstranu sprzężonego z klatkowaną fluoresceiną w 0,2 molarnym chlorku potasu w temperaturze lodu. Rozcieńcz klatkowaną fluoresceinę w 0,2 molarnym chlorku potasu do stężenia końcowego 1%. Przechowuj fluoresceinę w lodzie i chroń przed światłem. Pozostaw krzyżówki ryb danio prążkowanych do zapłodnienia; zbierz zapłodnione jaja natychmiast po ich złożeniu i wypłucz je zgodnie z opisem w tekście. Używając plastikowej pipety, przenieś embriony w stadium jednokomórkowym na płytkę do iniekcji z 1% agaroza, pokrytą świeżą pożywką E3, pod mikroskopem stereoskopowym.

Za pomocą pipety ustaw embriony w rynienkach do iniekcji. Odłam końcówkę kapilarnej igły do iniekcji, która została wyciągnięta do długiego zwężenia. Używając końcówki mikroladera, wypełnij igłę od tyłu około 1 µL 1% caged fluorescein.

Umieść załadowaną igłę w mikromanipulatorze podłączonym do pneumatycznego mikroinjektora. Wstrzyknij do cytoplazmy każdej komórki zarodka od dwóch do trzech nanolitrów klatkowanej fluoresceiny. Przeprowadź iniekcję w co najmniej 50 zarodkach w ramach jednego eksperymentu.

Przenieś wstrzyknięte embriony do szalki Petriego zawierającej świeżą pożywkę E3; inkubuj w ciemności w temperaturze 28,5 °C do pożądanego stopnia rozwoju. Aby zahamować pigmentację, dodaj do embrionów 0,1% Phenyl-Trea w 24. godzinie w celu przygotowania ich do montażu. Pokryj 15 do 20 szalek Petriego o średnicy 60 mm cienką warstwą 1% agarosy rozpuszczonej w świeżej pożywce E2. Po zestaleniu się agarozy wypełnij szalki pożywką E2 pod mikroskopem stereoskopowym.

Użyj ostrych pęset, aby przenieść wstrzyknięte embriony na powlekane płytki. Unikaj wystawiania embrionów na działanie powietrza. Przechowuj porcję 2% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w wodzie.

W bloku grzewczym w temperaturze 72°C. Za pomocą wypalanej pipety przenieś jeden powlekany embrion w około 150 µl medium do 60 mm szalki Petriego. Umieść podobną objętość 2% Agros obok embrionu i szybko wymieszaj obie krople, aby uzyskać jednorodną kroplę 1% Agros.

Zorientuj embrion tak, aby jego strona grzbietowa była skierowana w stronę obiektywu. Pozostaw agar do stężenia, a następnie zanurz zatopiony embrion w medium E2. Umieść świeżo zamocowany embrion na uchwycie do płytek pod mikroskopem dwufotonowym wyposażonym w szerokopasmowy laser obrotowy.

Przed rozpoczęciem procesu fotoaktywacji należy wykonać serię obrazów od najbardziej brzusznej do grzbietowej krawędzi tkanki wykazującej ekspresję przy długości fali 860 nanometrów. Obrazy powinny być rozmieszczone w odstępach 6 mikronów w płaszczyźnie Z. Następnie należy wybrać docelową płaszczyznę Z do fotoaktywacji i ustawić ostrość, wykorzystując GFP jako punkt orientacyjny.

Zlokalizuj obszar zainteresowania. Wykonaj pojedynczy obraz przy 860 nanometrach i pozostaw go otwartego w osobnym oknie w celu prawidłowego wyrównania. Kluczowe jest, aby laser przy 720 nanometrach znajdował się w stanie blokady modów przed otwarciem menu edycji wybielania.

Użyj obrazu wykonanego przy 860 nanometrach, aby zdefiniować obszar zainteresowania (ROI) dla fotoaktywacji. W oknie edycji wybielania (edit bleach) dostosuj względną moc lasera, liczbę iteracji oraz prędkość skanowania. W celu przeprowadzenia fotoaktywacji naciśnij przycisk bleach po zatrzymaniu lasera, przełącz ponownie na 860 nanometrach i wykonaj obraz pojedynczej płaszczyzny, aby ocenić intensywność powstałego materiału fotoaktywnego.

Wykonaj serię zdjęć (stack), aby ocenić zsan lub grubość domeny aktywowanej. W ten sposób można empirycznie określić intensywność lasera oraz czas ekspozycji. W celu optymalnej fotoaktywacji każdego klonu lub przekreślonego zdjęcia, aktywuj wszystkie pozostałe embriony przeznaczone do eksperymentu.

Stosując powyższe warunki, hoduj zamontowane, fotoaktywowane embriony w ciemności w temperaturze 28,5 °C w medium E2 zawierającym 0,1% fenylotiomocznika, aż osiągną pożądany stopień rozwoju. Pod mikroskopem stereoskopowym, używając ostrego skalpela, wykonaj wycięcie w kształcie litery V w chorionie w pobliżu zamontowanego embrionu, tak aby dno wycięcia było skierowane w stronę głowy embrionu. Umieść zamkniętą pincetę w wierzchołku wycięcia.

Ostrożnie rozchyl pęsetę, rozdzielając chorion wzdłuż długości zarodka i uwalniając go do medium. Po uwolnieniu każdego zarodka, za pomocą wypalanej pipety Pasteura, przenieś go do probówki do mikrocentryfugi. W dygestorium utrwal zarodki w 4% formaldehydzie przez trzy godziny.

W temperaturze pokojowej należy przeprowadzić odwadnianie, nawadnianie oraz barwienie fosfatazą alkaliczną skoniugowaną z antyfluoresceiną, wraz ze wszystkimi powiązanymi etapami przemywania, zgodnie z opisem w towarzyszącym tekście. Do embrionów należy dodać 500 µL przefiltrowanego roztworu Fast Red. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej, uzupełniając co godzinę świeżym roztworem barwiącym Fast Red, aż do osiągnięcia pożądanego stosunku sygnału do tła.

Reakcję barwienia należy zatrzymać poprzez trzykrotne przemycie w PBST przez pięć minut każde. W dygestorium utrwalić barwienie w 4% formaldehydzie przez 20 minut. Przemyć dwukrotnie w PBST przez pięć minut każde.

Przemywaj przejaśnione zarodki poprzez serię gradientów glicerolu o stężeniach 25%, 50% i 75% w PBS, aż każdy zarodek opadnie na dno probówki. Przechowuj zarodki w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza do momentu rozpoczęcia wizualizacji pod mikroskopem. Aby zamontować zarodki do wizualizacji, użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby nanieść cztery kropki po 20 µL przezroczystego smaru silikonowego na szkiełku przedmiotowym, w narożnikach kwadratu o boku 15 mm.

Umieść embrion w około 200 µl 75% glicerolu pomiędzy kroplami smaru. Na embrionie połóż szkiełko nakrywkowe. Delikatnie dociśnij szkiełko pionowo w dół, aż roztwór glicerolu wypełni wolną przestrzeń.

Przestrzeń między kroplami tłuszczu, w których zamontowano embriony, może być przechowywana przez kilka dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed obrazowaniem za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ten obraz przedstawia żywy embrion danio przebrany, wykazujący ekspresję GFP pod kontrolą promotora neurogenina 1, do którego na etapie jednej komórki wstrzyknięto klatkowany barwnik fluoresceiny przy użyciu opisanej wcześniej metody na etapie od trzech do pięciu somitów.

Wyodrębniony obszar pierwotnego mózgu przedniego został aktywowany fotochemicznie za pomocą lasera dwufotonowego, co umożliwiło detekcję uwolnionego barwnika fluoresceinowego. Po zakończeniu procedury fotoaktywacji embrion inkubowano w temperaturze 28,5 °C, a komórki mózgu zawierające uwolnioną fluoresceinę wyznakowano metodą immunohistochemiczną przeciwko fluoresceinie (kolor czerwony) 24 godziny po zapłodnieniu. Zwróć uwagę na niewielką liczbę znakowanych komórek. Po opanowaniu procedury fotoaktywacja może zostać przeprowadzona w ciągu zaledwie kilku godzin. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest kontrolowanie optymalnych parametrów, co pozwala na precyzyjną fotoaktywację z rozdzielczością pojedynczej komórki.