Name: Fotoaktywacja oparta na dwóch fotonach w żywych zarodkach danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Poznaj metodę fotoaktywacji opartą na dwóch fotonach w żywych zarodkach Danio rerio. Technika umożliwia precyzyjne etykietowanie komórek z rozdzielczością pojedynczej komórki i śledzenie ich losów w późniejszych stadiach rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Podziękowania kierujemy do Genii Brodsky za grafikę figur; Vyacheslava Kalchenka, Douglasa Lutza oraz Leonida Roitmana za porady techniczne i pomoc w dwufotonowym uwalnianiu z klatek (uncaging); Maayan Tahor i Sulimana Elsadina za pomoc techniczną; Uwe Strahle za uprzejme udostępnienie linii reporterowej neurogenin1 oraz Amosa Gutnicka za uwagi do niniejszego manuskryptu. Badania w laboratorium Levkowitza są wspierane przez niemiecko-izraelską fundację (grant nr 183/2007), Izraelską Fundację Naukową (grant nr 928/08) oraz Fundację Harriet&amp;Marcel Dekker. G.L. piastuje stanowisko Tauro Career Development Chair in Biomedical Research.

Opisujemy protokół znakowania komórek z użyciem klatkowanej fluoresceiny, jednak w podobny sposób można wykorzystać inne barwniki i białka fotoaktywowalne.
1. Wtryskiwanie uwięzionej fluoresceiny
<ol>
<li>Przygotować 5% roztwór stokowy (5mg caged-fluorescein / 100 μL 0.2M KCl) fluoresceiny z klatką 4,5-dimetoksy-2-nitrobenzylową (DMNB) sprzężonej z dekstranem (10,000 MW dextran, anionic, Invitrogen, molecular probes, Carlsbad, CA, kat. nr D-3310). Rozdzielić na alykwoaty i przechowywać w -20°C. Należy pamiętać, że fluoresceina z klatką DMNB jest wrażliwa na światło i powinna być przechowywana w ciemności.</li>
<li>Przygotować korytko do iniekcji z 1% agarozy (Sigma, St. Louis, MO, kat. nr A9539) zgodnie z opisem w „The zebrafish book“1.</li>
<li>Przygotować 2 litry pożywki E3 poprzez rozcieńczenie 100-krotnego roztworu stokowego E3.</li>
<li>Wieczorem przed iniekcją przygotować klatki do rozrodu, oddzielając samce od samic pożądanej linii transgenicznej wykazującej widoczny znacznik fluorescencyjny (GFP, RFP itp.), służący do lokalizacji komórek docelowych do fotoaktywacji.</li>
<li>Przygotować kapilary do iniekcji (Thin Wall Glass Capillaries with filament, World Precision Instruments, Sarasota, FL, kat. nr TW100F-6) przy użyciu wyciągacza mikrokapilar (Sutter Instrument, Novato, CA, P-97).</li>
<li>Rozmrozić alykwoaty 5% caged fluorescein na lodzie.</li>
<li>Rozcieńczyć 5% roztwór stokowy caged fluorescein w 0.2M KCl do stężenia końcowego 1% i przechowywać na lodzie. Unikać ekspozycji na światło.</li>
<li>Ustawić krzyżówki rozrodcze przygotowane w kroku 4.</li>
<li>Zebrać zapłodnione jaja niezwłocznie po ich złożeniu. Ułożyć embriony w stadium jednego komórki w agarozowej formie do iniekcji przykrytej pożywką E31.</li>
<li>Za pomocą końcówki microloader (Eppendorf, Hamburg, Germany, kat. nr 5242 956.003) wypełnić igłę do iniekcji od tyłu ok. 1 μL 1% roztworu caged fluorescein.</li>
<li>Umieścić załadowaną igłę w mikromanipulatorze podłączonym do pneumatycznego mikroinjektora (pneumatic picopump, World Precision Instruments, Sarasota, FL, PV820).</li>
<li>Ustawić objętość iniekcji na 2-3nl i wstrzyknąć caged-fluorescein bezpośrednio do cytoplazmy komórki. Wykonać iniekcję w minimum 50 embrionach na eksperyment.</li>
<li>Inkubować embriony w ciemności w temperaturze 28.5°C w pożywce E3 do pożądanego stadium rozwoju. Jeśli analizowane są embriony starsze niż 24 godziny po zapłodnieniu, dodać 0.1% fenylotiomocznika (PTU, Sigma, St. Louis, MO, kat. nr 22290-9), aby zahamować pigmentację.</li>
</ol>
2. Montowanie zarodków
<ol>
<li>Przygotuj świeży roztwór E2 (patrz sekcja roztwory; można przechowywać w temperaturze 4°C przez tydzień).</li>
<li>Pokryj szalki Petriego o średnicy 60 mm cienką warstwą 1% agarozy rozpuszczonej w medium E2.</li>
<li>Przygotuj 2% agarozy o niskiej temperaturze topnienia (Ultra Pure LMP agarose, Invitrogen, Carlsbad, CA, nr kat. 16520100) do zatapiania: rozpuść agarozę w sterylnej wodzie dwukrotnie destylowanej, podgrzewając w mikrofalówce do wrzenia. Podczas podgrzewania pozostaw otwartą zakrętkę probówki. Odmierz alikwoty po 1 mL do probówek do mikrocentryfugi i przechowuj w bloku grzejnym w temperaturze 72°C.</li>
<li>Usuń choriony embrionów, delikatnie rozdzielając chorion ostrymi pęsetą (nr 5). Przechowuj embriony w roztworze E2 na szalce pokrytej agarozą (patrz krok 2). Dechorionowane embriony należy przenosić za pomocą wypalanej szklanej pipety Pasteura, ponieważ mogą one przyklejać się do pipet polipropylenowych. Unikaj wystawiania zdechorionowanego embrionu na działanie powietrza, gdyż mogą one zostać uszkodzone przez napięcie powierzchniowe cieczy.</li>
<li>Pobierz wybrany embrion w niewielkiej objętości E2 za pomocą wypalanej szklanej pipety Pasteura i umieść go na szalce Petriego o średnicy 60 mm. Obok embrionu nanieś kroplę (~150 μL) 2% agarozy (krok 3). Szybko wymieszaj obie krople, aby uzyskać jednorodną końcową mieszaninę ok. 1% agarozy, a następnie za pomocą mikroskopu sekcyjnego zorientuj embrion tak, aby jego strona grzbietowa była skierowana w stronę obiektywu.</li>
<li>Odczekaj do stężenia agarozy i dodaj medium E2, aż zatopiony embrion zostanie całkowicie zanurzony w cieczy. Zaleca się umieszczanie jednego embrionu na szalce, ponieważ po procesie fotoaktywacji może on zostać uwolniony z agarozy.</li>
</ol>
3. Fotoaktywacja
<ol>
<li>Używamy dwufotonowego mikroskopu Zeiss LSM 510 META NLO wyposażonego w szerokopasmowy strojne (700-1020nm) femtosekundowy laser Mai Tai- HP firmy Spectraphysics.</li>
<li>Umieszczamy zamontowany embrion na uchwycie do płytek pod mikroskopem. Fluorescencyjny punkt orientacyjny w embrionie jest wizualizowany przy użyciu obiektywu Achroplan z zanurzeniem w wodzie 40x/0.8W. W kolejnych krokach wykorzystujemy detektor niedeskany (NDD) z filtrem pasmowym (BP) 500-550nm.</li>
<li>Jako warunek wstępny procesu fotoaktywacji, uzyskujemy przestrzenne informacje fluorescencyjne o obszarze zainteresowania poprzez akwizycję serii obrazów od najbardziej brzusznej do grzbietowej części wykrytego sygnału fluorescencyjnego przy długości fali lasera dwufotonowego 860nm (do detekcji GFP). W tym celu wystarczającą rozdzielczość można uzyskać stosując odstęp 6μm między każdą nabieraną płaszczyzną ogniskową.</li>
<li>Wybieramy docelową płaszczyznę z dla fotoaktywacji i ustawiamy ten obszar w ogniskowej. W zależności od celu eksperymentu, obszar zainteresowania może znajdować się w obrębie lub poza widocznym punktem orientacyjnym GFP. Wykonujemy pojedynczy obraz w tej płaszczyźnie z. Zapisujemy obraz i pozostawiamy go otwartego w osobnym oknie.</li>
<li>Ustawiamy długość fali lasera dwufotonowego na 720nm i po przejściu lasera w tryb mode-locked otwieramy menu „Edit bleach”. Definiujemy obszar zainteresowania (ROI) dla fotoaktywacji zgodnie z obrazem wykonanym przy 860nm (Krok 4), korzystając z menu „Define Region”. Kluczowe jest wybranie ROI na tym obrazie po zmianie długości fali lasera na 720nm, ponieważ ta operacja zmienia pozycje x,y obserwowanego pola.</li>
<li>W menu „Edit bleach” dostosowujemy następujące parametry fotoaktywacji (patrz krok 9): a) względną moc lasera; b) liczbę iteracji; c) prędkość skanowania.</li>
<li>Naciskamy przycisk „Bleach” w oknie „Edit bleach” i czekamy, aż laser przestanie pracować.</li>
<li>Przełączamy z powrotem na 860nm, wykonujemy obraz pojedynczej płaszczyzny, aby ocenić intensywność powstałego materiału fotoaktywnego, oraz drugą serię akwizycji obrazów, aby ocenić zakres Z (grubość) aktywowanej domeny.</li> 
<li>Należy wziąć pod uwagę następujące parametry fotoaktywacji:
<ol class="lalpha">
<li>Optymalne warunki fotoaktywacji należy wyznaczyć empirycznie, zmieniając dwa parametry: intensywność lasera oraz czas trwania fotoaktywacji. Względną moc lasera można kontrolować za pomocą transmisji modulatora akustyczno-optycznego (AOM). Czas trwania fotoaktywacji jest funkcją liczby iteracji i prędkości skanowania.</li>
<li>Należy wyznaczyć liniowy zakres intensywności fluorescencji, aby uniknąć nasycenia fluorescencji po uwolnieniu (uncaged fluorescence).</li>
<li>Istnieje liniowa korelacja między uzyskaną intensywnością fluorescencji uwolnionych cząsteczek a zakresem osi z fotoaktywnego klona2.</li></ol></li>
</ol>
4. Detekcja uwolnionej fluoresceiny
<ol>
<li>Po fotoaktywacji hodować zarodki w ciemności w temperaturze 28,5°C w medium E2 zawierającym 0,1% PTU, aby zapobiec pojawieniu się pigmentacji skóry.</li>
<li>W pożądanym stadium rozwoju usunąć zarodek z agarozy pod mikroskopem stereoskopowym. Za pomocą ostrego skalpela wykonać w agarozie nacięcie w kształcie litery „V” w pobliżu zarodka, tak aby wierzchołek „V” był skierowany w stronę głowy zarodka. Umieścić zamkniętą pęsetę w wierzchołku „V” blisko głowy zarodka i delikatnie rozsunąć pęsetę, rozdzielając agarozę wzdłuż zarodka i uwalniając go do medium.</li>
<li>Zebrać zarodki za pomocą wypalonej pipety Pasteura i utrwalić w paraformaldehydzie (PFA; 4% w 1 x PBS, pH 7,2) przez 3 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.</li>
<li>Usunąć roztwór utrwalający i przepłukać 2–3 razy w PBST przez co najmniej 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Przemyć zarodki 100% metanolem przez 10 min, uzupełnić świeżym metanolem i inkubować w temperaturze -20°C przez co najmniej 2 h.</li>
<li>Rehydratować zarodki poprzez następujące po sobie inkubacje (po 5 min każda) w serii rozcieńczeń metanolu w PBSTr: 80%, 60%, 40% i 20%. Przemyć 2 x 10 minut w PBSTr.</li>
<li>Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w 500 μL roztworu blokującego.</li>
<li>Dodać fragmenty Fab przeciwciał przeciw fluoresceinie z fosfatazą alkaliczną (AP) (Roche, Palo Alto, CA, nr kat. 11426338910), rozcieńczone 1:500 w roztworze blokującym, i inkubować przez noc w temperaturze 4°C (probówki do mikrocentryfugi należy położyć na boku).</li>
<li>Przemyć 5 x 15 minut w PBST.</li>
<li>Przemyć przez 5 minut w 0,2M NaCl w TNT.</li>
<li>Przemyć przez 5 minut w 0,4M NaCl w TNT.</li>
<li>Równoważyć 3 x 5 minut w świeżo przygotowanym roztworze Prestain.</li>
<li>Rozpuścić jedną tabletkę Fast Red (Roche, Palo Alto, CA, nr kat. 11496549001) w 2 mL roztworu Prestain. Zaleca się przefiltrowanie roztworu za pomocą papieru Whatman nr 2, aby usunąć nierozpuszczone cząsteczki. Alternatywnie można odwiruwać roztwór i użyć klarownego supernatantu.</li>
<li>Dodać 500 μL roztworu Fast Red do każdej probówki, inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej i monitorować rozwój barwy, aż do osiągnięcia pożądanego stosunku sygnału do tła (od 20 minut do kilku godzin). Jeśli pojawi się tło, przenieść do temperatury 4°C. Po godzinie inkubacji uzupełnić świeżym roztworem barwiącym Fast Red.</li>
<li>Zatrzymać reakcję barwienia poprzez 3 x 5 minutowe płukanie w PBST.</li>
<li>Utrwalić przez 20 minut w 4% PFA w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Przemyć 2 x 5 minut w PBST.</li>
<li>Przejaśnić zarodki, przeprowadzając je przez serię rozcieńczeń glicerolu w PBS (25%, 50% i 75%), aż zarodki osiądą na dnie probówki. Zarodki można przechowywać w temperaturze 4°C przez kilka dni.</li>
</ol>
5. Wizualizacja fluorescencyjna obszaru odblokowanego
<ol>
<li>Przygotuj szkiełko przedmiotowe do montażu: za pomocą strzykawki 1 mL nanieś na szkiełko cztery kropki przezroczystego smaru silikonowego, rozmieszczone w odległości ok. 15mm od siebie. Umieść zarodek w centrum w ok. 200 μL 75% glicerolu, nałóż na wierzch szkiełko nakrywkowe (nr 0; 18x18mm) i delikatnie dociśnij je do silikonu, aż roztwór glicerolu wypełni powierzchnię między szkiełkami.</li>
<li>Umieść zamontowany zarodek na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość, korzystając z obiektywu 40x. Wykonaj konfokalną serię obrazów Z-stack, wykorzystując lasery Argon 488nm oraz HeNe 543nm jako źródła wzbudzenia.</li>
<li>Zakres osi z domeny fotoaktywowanej można przeanalizować, wykonując rekonstrukcję 3D zarodka po procesie uncagingu za pomocą oprogramowania do analizy obrazu.</li>
</ol>
6. Roztwory
<table border="1">
<tbody>
 <tr>
 <td>100 x E3</td>
 <td>174 mM NaCl, 21 mM KCl, 12 mM MgSO44, 18 mM Ca(NO3)2, 15 mM HEPES, pH=7,4. Sterylizować poprzez filtrację i przechowywać w 4°C</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>20 x E2</td>
 <td>0,3 M NaCl, 10 mM KCl, 20 mM CaCl22*2HOH, 20 mM MgSO447HOH, 3mM KH2PO4, 0,8 mM Na2HPO4*2HOH, przefiltrować i przechowywać w temperaturze pokojowej</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 x E2</td>
 <td>Rozcieńczyć 20 x E2 w wodzie dwukrotnie destylowanej i dodać świeżo przygotowany NaHCO33 (do stężenia końcowego 0,7 mM), penicylinę i streptomycynę (rozcieńczyć roztwór pen-strep do stężenia końcowego 1x, który zawiera 100 J penicyliny i 100 mg streptomycyny na ml (Invitrogen, Carlsbad, CA, nr kat. 15140-122))</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBST</td>
 <td>0,1% TWEEN-20 w PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PBSTr</td>
 <td>0,3% Triton w PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Roztwór blokujący</td>
 <td>10% BSA, 0,3% Triton, 1% DMSO w PBS</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>TNT</td>
 <td>100 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5% TWEEN-20 w wodzie dwukrotnie destylowanej </td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Roztwór do wstępnego barwienia</td>
 <td>100 mM Tris-HCl pH 8,2, 0,4 M NaCl, 0,1% TWEEN-20 w wodzie dwukrotnie destylowanej</td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

7. Reprezentatywne wyniki 
Przedstawiono przykład wykorzystania mikroskopii dwufotonowej do fotoaktywacji czynników w żywym embrionie danio pręgowanego. Stosując podobne podejście, śledziliśmy wcześniej linię fotoaktywowanych, znakowanych progenitorów neuronalnych w mózgu danio pręgowanego2,3. Rycina 1 przedstawia fotoaktywację klatkowanego barwnika śledzącego sprzężonego z fluoresceiną w przedniej płytce nerwowej embrionów danio pręgowanego niosących transgen reporterowy neurog1::gfp, który służył jako żywy, wewnętrzny punkt orientacyjny.
Zarodki w stadium jednego komórki wstrzyknięto z uwięzioną fluoresceiną (caged fluorescein), a następnie osadzono w agarozie w stadium pączka. W stadium 3–5 somytów zmierzono współrzędne przestrzenne w zarodku transgenicznym neurog1::gfp, aby wyznaczyć obszar zainteresowania (ROI) dla procesu uwalniania fluoresceiny (rycina 1A, A'). Uwolniono znacznik linii fluoresceiny w konkretnej domenie płytki neuronalnej (rycina 1B, B'). Następnie, w stadium prim5 (24 godziny po zapłodnieniu), określono los tej konkretnej znakowanej poddomeny progenitorów neuronalnych poprzez immunobarwienie uwolnionej fluoresceiny (rycina 1C, C').
Zakres dwufotonowego uwalniania laserowego, tj. intensywność uwolnionej fluorescencji oraz grubość domeny fotoaktywowanej (z-span), można kontrolować poprzez regulację dwóch parametrów: natężenia oraz czasu trwania impulsu laserowego. Ten drugi można kontrolować poprzez dostosowanie liczby iteracji i prędkości skanowania (patrz część 3, krok 9; Russek-Blum, 2009). W przykładzie przedstawionym na Rysunku 1 zastosowano względną moc lasera wynoszącą 12% transmisji AOM, 20 iteracji oraz prędkość skanowania 25,6 μsec/ pixel. Przy tych ustawieniach oznakowano ROI zawierający 9-10 komórek, przy fotoaktywowanej wartości z-span wynoszącej 30μm (~1-2 rzędy komórek).
<img src="/files/ftp_upload/1902/1902fig1.jpg" alt="Schemat fotoaktywacji i wyniki fluorescencji; wzrost rurki neuralnej z wykorzystaniem uwolnionej fluoresceiny." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Reprezentatywny wynik fotoaktywacji klatkowanej fluoresceiny w żywym embrionie danio pręgowanego z wykorzystaniem mikroskopii dwufotonowej.
Schematyczna ilustracja (A-C) i reprezentatywne obrazy (A'-C') procesu fotoaktywacji. Żywy embrion zebrafish (A, A') wykazujący ekspresję GFP pod kontrolą promotora neurogeniny-1 (neurog1::gfp), do którego w stadium 1 komórki wstrzyknięto uwięziony (caged) barwnik fluoresceinowy. W stadium 3-5 somitów fotoaktywowano niewielki obszar prymordium przedmózgowia (podwzgórza), po czym wykryto uwolniony barwnik fluoresceinowy (B, B'). Po procedurze fotoaktywacji embrion inkubowano w temperaturze 28,5°C, a komórki mózgu zawierające uwolnioną fluoresceinę śledzono za pomocą immunostynowania przeciwciałami anty-fluoresceinowymi w 24 godzinach po zapłodnieniu (hpf; C, C'). Dien., podwzgórze (diencephalon); Tel., koniec mózgu (telencephalon).

<ol><li>Westerfield, M. The Zebrafish Book: Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Brachydanio rerio. , University of Oregon Press. (1995).</li>
<li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li>
<li>Russek-Blum, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopaminergic+neuronal+cluster+size+is+determined+during+early+forebrain+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dopaminergic neuronal cluster size is determined during early forebrain patterning.</a> Development. 135, 3401-3413 (2008).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li>
<li>Staudt, N., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Prethalamus+Is+Established+during+Gastrulation+and+Influences+Diencephalic+Regionalization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The Prethalamus Is Established during Gastrulation and Influences Diencephalic Regionalization.</a> PLoS Biol. 5, e69-e69 (2007).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Hatta, K., Tsujii, H., Omura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+tracking+using+a+photoconvertible+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cell tracking using a photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Protoc. 1, 960-967 (2006).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nat Neurosci. 8, 1263-1268 (2005).</li>
<li>Bulina, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromophore-assisted+light+inactivation+%28CALI%29+using+the+phototoxic+fluorescent+protein+KillerRed%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromophore-assisted light inactivation (CALI) using the phototoxic fluorescent protein KillerRed.</a> Nat Protoc. 1, 947-9453 (2006).</li>
<li>Adams, S. R., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+cell+chemistry+with+caged+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Controlling cell chemistry with caged compounds.</a> Annu Rev Physiol. 55, 755-784 (1993).</li>
<li>Wieboldt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolabile+precursors+of+glutamate%3A+synthesis%2C+photochemical+properties%2C+and+activation+of+glutamate+receptors+on+a+microsecond+time+scale%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Photolabile precursors of glutamate: synthesis, photochemical properties, and activation of glutamate receptors on a microsecond time scale.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 91, 8752-8756 (1994).</li>
<li>Marque, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+caged+neurotransmitters%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Using caged neurotransmitters.</a> Nature. 337, 583-584 (1989).</li>
<li>Zucker, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photorelease+techniques+for+raising+or+lowering+intracellular+Ca2%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Photorelease techniques for raising or lowering intracellular Ca2.</a> Methods Cell Biol. 40, 31-63 (1994).</li>
<li>Neveu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+caged+retinoic+acid+for+one-+and+two-photon+excitation+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed+Engl%22%5BJournal%5D)">A caged retinoic acid for one- and two-photon excitation in zebrafish embryos.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 47, 3744-3746 (2008).</li>
<li>Shestopalov, I. A., Sinha, S., Chen, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-controlled+gene+silencing+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Light-controlled gene silencing in zebrafish embryos.</a> Nat Chem Biol. 3, 650-651 (2007).</li>
<li>Ando, H., Furuta, T., Tsien, R. Y., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-mediated+gene+activation+using+caged+RNA%2FDNA+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Photo-mediated gene activation using caged RNA/DNA in zebrafish embryos.</a> Nat Genet. 28, 317-325 (2001).</li>
</ol>

Związki fotoaktywowalne to cząsteczki, których funkcja pozostaje zamaskowana do momentu naświetlenia ich falą o określonej długości (zazwyczaj UV), co indukuje reakcję fotochemiczną przekształcającą cząsteczki w stan aktywny biologicznie lub chemicznie. Sondy te stanowią potężne narzędzia w badaniach z zakresu biologii komórki, ponieważ aktywacja może być precyzyjnie kontrolowana w czasie i przestrzeni poprzez ograniczanie ich ekspozycji na światło.
Istotną zaletą mikroskopii wielofotonowej j...

<table><tbody><tr><td>Fluoresceina w klatce 4,5-dimetoksy-2-nitrobenzylowej (DMNB) sprzężona z dekstranem (dekstran 10 000 MW, anionowy)</td><td>Invitrogen</td><td>D-3310</td><td>sondy molekularne</td></tr><tr><td>Agaroza do rynien iniekcyjnych i płytek powlekanych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Cienkościenne kapilary szklane z włóknem</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100F-6</td><td></td></tr><tr><td>Wytrawiarka mikropipet</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Końcówka do mikrodoładowywania</td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td> pneumatyczna pikopompka</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>Fenylotiomocznik (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22290-9</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza o niskiej temperaturze topnienia do montażu zarodków</td><td>Ultra Pure LMP agarose</td><td>16520100</td><td></td></tr><tr><td>Fragmenty Fab przeciw fluoresceinie z fosfatazą alkaliczną (AP)</td><td>Roche Group</td><td>11426338910</td><td></td></tr><tr><td>Fast Red</td><td>Roche Group</td><td>11496549001</td><td></td></tr></tbody></table>

fotoaktywacja oparta na dwufotonach w żywych zarodkach danio pręgowanego

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Fotoaktywacja związków docelowych w żywym organizmie okazała się wartościowym podejściem do badania różnych procesów biologicznych, takich jak rozwój embrionalny, sygnalizacja komórkowa i fizjologia dorosłych osobników. W tym kontekście zastosowanie mikroskopii wielofotonowej umożliwia ilościową fotoaktywację danego czynnika światłoczułego w głębokich tkankach z rozdzielczością pojedynczej komórki. Ponieważ embriony rybek danio-pręgławka są optycznie przezroczyste, ich rozwój można monitorować in vivo. Cechy te sprawiają, że rybka danio-pręgławka jest idealnym organizmem modelowym do kontrolowania aktywności różnych czynników chemicznych i białek za pomocą skupionego światła. W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie mikroskopii dwufotonowej do indukowania aktywacji chemicznie „zaklatkowanej” (caged) fluoresceiny, co z kolei pozwala nam śledzić losy komórek w żywych embrionach danio-pręgławka. Wykorzystujemy embriony wykazujące żywy znacznik genetyczny (GFP), aby zlokalizować i precyzyjnie wycelować w dowolne interesujące nas komórki. Procedura ta może być w podobny sposób wykorzystana do precyzyjnej aktywacji białek, hormonów, małych cząsteczek i innych związków „zaklatkowanych” za pomocą światła.

Mikroskopia wielofotonowa umożliwia sterowanie fotonami o niskiej energii przy głębokiej penetracji optycznej i zredukowanej fototoksyczności. Opisujemy zastosowanie tej technologii do znakowania żywych komórek w embrionach danio pręgowanego. Protokół ten można łatwo dostosować do fotoindukcji różnych cząsteczek reagujących na światło.

Fotoaktywacja oparta na dwufotonach w żywych zarodkach danio pręgowanego

Fotoaktywacja związków docelowych w żywym organizmie okazała się cennym podejściem do badania różnych procesów biologicznych, takich jak rozwój zarodkowy...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest fotoaktywacja określonego czynnika światłoczułego, takiego jak chemicznie „zaklatkowany” barwnik fluorescencyjny, w żywym embrionie danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki. Osiąga się to poprzez wstrzyknięcie czynnika światłoczułego do embrionów w stadium jednej komórki wykazujących żywy marker genetyczny, co pozwala na zlokalizowanie i precyzyjne ukierunkowanie na dowolne komórki zainteresowania. W drugim kroku embriony są hodowane i osadzane w niskotopliwym agarze, który unieruchamia żywy embrion.Następnie wykorzystuje się mikroskopię dwufotonową w celu zlokalizowania widocznego fluorescencyjnego markera transgenicznego. Następnie aktywuje się czynnik światłoczuły w pożądanej płaszczyźnie ogniskowej i monitoruje zakres fotoaktywacji. Dalsze losy powstałych komórek oznakowanych mogą być następnie śledzone w późniejszych stadiach embrionalnych.Niniejszą procedurę można wykorzystać do aktywacji różnych związków z rozdzielczością pojedynczej komórki w żywych organizmach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia konfokalna czy lampa błyskowa, jest możliwość fotoaktywacji tkanek położonych stosunkowo głęboko, na poziomie osiowym rzędu kilku mikronów, przy stosunkowo niskiej fototoksyczności. Przedstawiona tutaj metoda jest wykorzystywana do śledzenia krawędzi linii i może być stosowana do fotoaktywacji wielu komponentów, co pozwala na ukierunkowaną kontrolę nad procesami rozwojowymi i fizjologicznymi. Wieczorem przed iniekcją należy przygotować zbiorniki do tarła, oddzielając samce i samice danio pręgowanego z linii transgenicznej wykazującej widoczny znacznik fluorescencyjny.W tym eksperymencie linia transgeniczna wykazuje ekspresję GFP pod kontrolą promotora neurogenic N one. Odmierz próbkę 5% dekstranu sprzężonego z klatkowaną fluoresceiną w 0,2 molarnym chlorku potasu w temperaturze lodu. Rozcieńcz klatkowaną fluoresceinę w 0,2 molarnym chlorku potasu do stężenia końcowego 1%. Przechowuj fluoresceinę w lodzie i chroń przed światłem. Pozostaw krzyżówki ryb danio prążkowanych do zapłodnienia; zbierz zapłodnione jaja natychmiast po ich złożeniu i wypłucz je zgodnie z opisem w tekście. Używając plastikowej pipety, przenieś embriony w stadium jednokomórkowym na płytkę do iniekcji z 1% agaroza, pokrytą świeżą pożywką E3, pod mikroskopem stereoskopowym.Za pomocą pipety ustaw embriony w rynienkach do iniekcji. Odłam końcówkę kapilarnej igły do iniekcji, która została wyciągnięta do długiego zwężenia. Używając końcówki mikroladera, wypełnij igłę od tyłu około 1 µL 1% caged fluorescein.Umieść załadowaną igłę w mikromanipulatorze podłączonym do pneumatycznego mikroinjektora. Wstrzyknij do cytoplazmy każdej komórki zarodka od dwóch do trzech nanolitrów klatkowanej fluoresceiny. Przeprowadź iniekcję w co najmniej 50 zarodkach w ramach jednego eksperymentu.Przenieś wstrzyknięte embriony do szalki Petriego zawierającej świeżą pożywkę E3; inkubuj w ciemności w temperaturze 28,5 °C do pożądanego stopnia rozwoju. Aby zahamować pigmentację, dodaj do embrionów 0,1% Phenyl-Trea w 24. godzinie w celu przygotowania ich do montażu. Pokryj 15 do 20 szalek Petriego o średnicy 60 mm cienką warstwą 1% agarosy rozpuszczonej w świeżej pożywce E2. Po zestaleniu się agarozy wypełnij szalki pożywką E2 pod mikroskopem stereoskopowym.Użyj ostrych pęset, aby przenieść wstrzyknięte embriony na powlekane płytki. Unikaj wystawiania embrionów na działanie powietrza. Przechowuj porcję 2% agarozy o niskiej temperaturze topnienia w wodzie.W bloku grzewczym w temperaturze 72°C. Za pomocą wypalanej pipety przenieś jeden powlekany embrion w około 150 µl medium do 60 mm szalki Petriego. Umieść podobną objętość 2% Agros obok embrionu i szybko wymieszaj obie krople, aby uzyskać jednorodną kroplę 1% Agros.Zorientuj embrion tak, aby jego strona grzbietowa była skierowana w stronę obiektywu. Pozostaw agar do stężenia, a następnie zanurz zatopiony embrion w medium E2. Umieść świeżo zamocowany embrion na uchwycie do płytek pod mikroskopem dwufotonowym wyposażonym w szerokopasmowy laser obrotowy.Przed rozpoczęciem procesu fotoaktywacji należy wykonać serię obrazów od najbardziej brzusznej do grzbietowej krawędzi tkanki wykazującej ekspresję przy długości fali 860 nanometrów. Obrazy powinny być rozmieszczone w odstępach 6 mikronów w płaszczyźnie Z. Następnie należy wybrać docelową płaszczyznę Z do fotoaktywacji i ustawić ostrość, wykorzystując GFP jako punkt orientacyjny.Zlokalizuj obszar zainteresowania. Wykonaj pojedynczy obraz przy 860 nanometrach i pozostaw go otwartego w osobnym oknie w celu prawidłowego wyrównania. Kluczowe jest, aby laser przy 720 nanometrach znajdował się w stanie blokady modów przed otwarciem menu edycji wybielania.Użyj obrazu wykonanego przy 860 nanometrach, aby zdefiniować obszar zainteresowania (ROI) dla fotoaktywacji. W oknie edycji wybielania (edit bleach) dostosuj względną moc lasera, liczbę iteracji oraz prędkość skanowania. W celu przeprowadzenia fotoaktywacji naciśnij przycisk bleach po zatrzymaniu lasera, przełącz ponownie na 860 nanometrach i wykonaj obraz pojedynczej płaszczyzny, aby ocenić intensywność powstałego materiału fotoaktywnego.Wykonaj serię zdjęć (stack), aby ocenić zsan lub grubość domeny aktywowanej. W ten sposób można empirycznie określić intensywność lasera oraz czas ekspozycji. W celu optymalnej fotoaktywacji każdego klonu lub przekreślonego zdjęcia, aktywuj wszystkie pozostałe embriony przeznaczone do eksperymentu.Stosując powyższe warunki, hoduj zamontowane, fotoaktywowane embriony w ciemności w temperaturze 28,5 °C w medium E2 zawierającym 0,1% fenylotiomocznika, aż osiągną pożądany stopień rozwoju. Pod mikroskopem stereoskopowym, używając ostrego skalpela, wykonaj wycięcie w kształcie litery V w chorionie w pobliżu zamontowanego embrionu, tak aby dno wycięcia było skierowane w stronę głowy embrionu. Umieść zamkniętą pincetę w wierzchołku wycięcia.Ostrożnie rozchyl pęsetę, rozdzielając chorion wzdłuż długości zarodka i uwalniając go do medium. Po uwolnieniu każdego zarodka, za pomocą wypalanej pipety Pasteura, przenieś go do probówki do mikrocentryfugi. W dygestorium utrwal zarodki w 4% formaldehydzie przez trzy godziny.W temperaturze pokojowej należy przeprowadzić odwadnianie, nawadnianie oraz barwienie fosfatazą alkaliczną skoniugowaną z antyfluoresceiną, wraz ze wszystkimi powiązanymi etapami przemywania, zgodnie z opisem w towarzyszącym tekście. Do embrionów należy dodać 500 µL przefiltrowanego roztworu Fast Red. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej, uzupełniając co godzinę świeżym roztworem barwiącym Fast Red, aż do osiągnięcia pożądanego stosunku sygnału do tła.Reakcję barwienia należy zatrzymać poprzez trzykrotne przemycie w PBST przez pięć minut każde. W dygestorium utrwalić barwienie w 4% formaldehydzie przez 20 minut. Przemyć dwukrotnie w PBST przez pięć minut każde.Przemywaj przejaśnione zarodki poprzez serię gradientów glicerolu o stężeniach 25%, 50% i 75% w PBS, aż każdy zarodek opadnie na dno probówki. Przechowuj zarodki w temperaturze czterech stopni Celsiusjusza do momentu rozpoczęcia wizualizacji pod mikroskopem. Aby zamontować zarodki do wizualizacji, użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby nanieść cztery kropki po 20 µL przezroczystego smaru silikonowego na szkiełku przedmiotowym, w narożnikach kwadratu o boku 15 mm.Umieść embrion w około 200 µl 75% glicerolu pomiędzy kroplami smaru. Na embrionie połóż szkiełko nakrywkowe. Delikatnie dociśnij szkiełko pionowo w dół, aż roztwór glicerolu wypełni wolną przestrzeń.Przestrzeń między kroplami tłuszczu, w których zamontowano embriony, może być przechowywana przez kilka dni w temperaturze czterech stopni Celsjusza przed obrazowaniem za pomocą mikroskopii konfokalnej. Ten obraz przedstawia żywy embrion danio przebrany, wykazujący ekspresję GFP pod kontrolą promotora neurogenina 1, do którego na etapie jednej komórki wstrzyknięto klatkowany barwnik fluoresceiny przy użyciu opisanej wcześniej metody na etapie od trzech do pięciu somitów.Wyodrębniony obszar pierwotnego mózgu przedniego został aktywowany fotochemicznie za pomocą lasera dwufotonowego, co umożliwiło detekcję uwolnionego barwnika fluoresceinowego. Po zakończeniu procedury fotoaktywacji embrion inkubowano w temperaturze 28,5 °C, a komórki mózgu zawierające uwolnioną fluoresceinę wyznakowano metodą immunohistochemiczną przeciwko fluoresceinie (kolor czerwony) 24 godziny po zapłodnieniu. Zwróć uwagę na niewielką liczbę znakowanych komórek. Po opanowaniu procedury fotoaktywacja może zostać przeprowadzona w ciągu zaledwie kilku godzin. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest kontrolowanie optymalnych parametrów, co pozwala na precyzyjną fotoaktywację z rozdzielczością pojedynczej komórki.

two-photon-based-photoactivation-in-live-zebrafish-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Dwufotonowa fotoaktywacja w żywych zarodkach ryby zebry

W niniejszej pracy opisujemy metodę montowania embrionów zebrafish do długotrwałego obrazowania, obrazowania dwufotonowego, technik uszkadzania tkanek oraz konfokalnego obrazowania time-lapse.

Dwufotonowa aksotomia i konfokalne obrazowanie time-lapse w żywych embrionach danio pręgowanego

W tym filmie przedstawiono techniki wielokolorowego konfokalnego obrazowania time-lapse oraz celowanej ablacji komórek. Obrazowanie time-lapse jest wykorzystywane do monitorowania zachowania wielu wybranych typów komórek in vivo. Celowana ablacja komórek ułatwia badanie funkcji obwodów neuronalnych oraz paradygmatów regeneracji neuronów specyficznych dla danej grupy komórek.

Wielokolorowe obrazowanie poklatkowe transgenicznych rybek zebrafish: wizualizacja komórek macierzystych siatkówki aktywowanych przez ukierunkowaną ablację komórek neuronalnych

Opisano metodę fotoaktywacji pojedynczych komórek zawierających „uwięzione” (caged) białko fluorescencyjne z wykorzystaniem absorpcji dwufotonowej z femtosekundowego oscylatora laserowego Ti:Szafir. W celu mapowania losu fotoaktywowanej komórki zastosowano immunohistochemię. Technikę tę można zastosować do każdego typu komórek.

Mapowanie losów pojedynczych komórek u danio przeznaczonego (zebrafish)

W niniejszym materiale przedstawiamy metodę fotoaktywnego przełączania fotokonwertowalnych białek fluorescencyjnych (PCFPs) w żywym embrionie danio-pręgowanego oraz dalsze śledzenie fotokonwertowanego białka w określonych punktach czasowych podczas rozwoju. Metodologia ta umożliwia monitorowanie zdarzeń biologii komórkowej leżących u podstaw różnych procesów rozwojowych w żywym organizmie kręgowca.

Śledzenie komórek za pomocą białek fotokonwertowalnych podczas rozwoju ryby danio-ostrogonia

Mitoza jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, a defekty często prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych. Korzystając z tego protokołu obrazowania i danio pręgowanego jako systemu modelowego, naukowcy mogą wizualizować mitozę w żywym organizmie kręgowców i mnogość defektów, które powstają, gdy procesy mitotyczne są wadliwe.

Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Kombinacja zaawansowanych technik optycznych laserowej mikroskopii skaningowej z wzbudzeniem fluorescencji wielofotonowej o długich falach została zaimplementowana do przechwytywania wysokiej rozdzielczości, trójwymiarowego obrazowania w czasie rzeczywistym migracji grzebieni nerwowych w zarodkach zebry pręgowanego Tg(sox10:EGFP) i Tg(foxd3:GFP).

Wielofotonowe obrazowanie poklatkowe w celu wizualizacji rozwoju w czasie rzeczywistym: wizualizacja migrujących komórek grzebienia nerwowego w zarodkach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół, który pokazuje, jak fotokonwersja komórek jest osiągana poprzez ekspozycję na promieniowanie UV na określone obszary wyrażające białko fluorescencyjne, Eos, u żywych zwierząt.

Fotokonwersja jednokomórkowa u żyjących nienaruszonych danio pręgowanych

Ten protokół opisuje metodę fotokonwersji białka fluorescencyjnego Kaede w komórkach wsierdzia żywego zarodka danio pręgowanego, która umożliwia śledzenie komórek wsierdzia podczas rozwoju kanału przedsionkowo-komorowego i zastawki przedsionkowo-komorowej serca.

Śledzenie ruchów tkanki wsierdzia poprzez fotokonwersję komórek w zarodku danio pręgowanego

Ten protokół opisuje podejście do etykietowania in toto i wielowymiarowego obrazowania wczesnego rozwoju oczu danio pręgowanego. Opisujemy znakowanie, osadzanie i obrazowanie czterowymiarowe (4D) za pomocą laserowej skaningowej mikroskopii konfokalnej oraz rozważania dotyczące optymalizacji pozyskiwania zestawów danych do analizy mechanizmów morfogenezy panewki wzrokowej.

4-wymiarowe obrazowanie morfogenezy kubka wzrokowego danio pręgowanego

Optogenetyczne manipulowanie szlakami sygnałowymi może być potężną strategią do zbadania, w jaki sposób sygnalizacja jest dekodowana w rozwoju, regeneracji, homeostazie i chorobie. Protokół ten zawiera praktyczne wskazówki dotyczące stosowania aktywatorów sygnalizacyjnych białka węzłowego i morfogennego kości (BMP) opartych na dziedzinie wykrywania światła i tlenu we wczesnym zarodku danio pręgowanego.

Aktywacja sygnalizacji optogenetycznej w zarodkach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół badania aktywności neuronalnej w obszarach mózgu transgenicznego danio pręgowanego, które wyrażają wskaźniki wapnia GCaMP za pomocą mikroskopii konfokalnej.

In vivo (in vivo) Konfokalne obrazowanie fluorescencyjne aktywności neuronalnej wywołanej stymulacją sensoryczną u częściowo unieruchomionych larw danio pręgowanego

Poznaj metodę fotoaktywacji opartą na dwóch fotonach w żywych zarodkach Danio rerio. Technika umożliwia precyzyjne etykietowanie komórek z rozdzielczością pojedynczej komórki i śledzenie ich losów w późniejszych stadiach rozwoju.

Fotoaktywacja oparta na dwufotonach w żywych zarodkach danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów