Fotoaktywacja oparta na dwóch fotonach w żywych zarodkach danio pręgowanego

Mikroskopia wielofotonowa pozwala na kontrolę fotonów o niskiej energii z głęboką penetracją optyczną i zmniejszoną fototoksycznością. Opisujemy zastosowanie tej technologii do znakowania żywych komórek w zarodkach danio pręgowanego. Protokół ten można łatwo dostosować do fotoindukcji różnych cząsteczek reagujących na światło.

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest fotoaktywacja danego czynnika reagującego na światło, takiego jak chemicznie umieszczony w klatce barwnik fluorescencyjny w żywym zarodku danio pręgowanego w rozdzielczości pojedynczej komórki. Osiąga się to poprzez wstrzyknięcie środka reagującego na światło do zarodków w jednym stadium komórkowym, które wyrażają żywy genetyczny punkt orientacyjny, aby zlokalizować i precyzyjnie namierzyć dowolne komórki będące przedmiotem zainteresowania. W drugim etapie zarodki są hodowane i umieszczane w aeros o niskiej temperaturze topnienia, który unieruchamia żywy zarodek.

Kolejne dwie mikroskopie fotonowe są wykorzystywane w celu zlokalizowania widocznego fluorescencyjnego transgenicznego punktu orientacyjnego. Czynnik reagujący na światło jest następnie aktywowany w żądanej płaszczyźnie ogniskowej i monitorowany jest zakres aktywacji fotograficznej. Los powstałych w ten sposób znakowanych komórek można następnie prześledzić w późniejszych stadiach embrionalnych.

Procedura ta może być wykorzystana do aktywacji różnych związków w rozdzielczości pojedynczej komórki w żywych próbkach. Główną zaletą tej techniki w porównaniu z istniejącymi metodami, takimi jak mikroskopia konfokalna czy lampa błyskowa, jest to, że umożliwia ona fotoaktywację stosunkowo głębokich tkanek na poziomie osiowym kilku mikronów przy stosunkowo niskiej fototoksyczności. Ale przedstawiona tutaj metoda jest używana do śledzenia krawędzi seline i może być stosowana do aktywacji fotograficznej różnych komponentów, co pozwala na ukierunkowaną kontrolę nad procesami rozwojowymi i fizjologicznymi Wieczorem przed wstrzyknięciem przygotuj zbiorniki godowe, oddziel samce i samice danio pręgowanego z linii transgenicznej wyrażającej widoczny fluorescencyjny punkt orientacyjny.

W tym eksperymencie linia transgeniczna ulega ekspresji GFP pod kontrolą neurogennego promotora N, rozmrażanie podwielokrotności 5% fluoresceiny sprzężonej z dekstranem w klatce w 0,2 molowym chlorku potasu na lodzie, rozcieńczanie fluoresceiny w klatce w 0,2 molowym chlorku potasu do końcowego stężenia 1% Utrzymuj fluoresceinę na lodzie i chroń ją przed światłem. Pozwól krzyżówkom zebry na łączenie się w pary, zbierz zapłodnione jaja zaraz po ich złożeniu i opłucz je zgodnie z opisem w tekście. Za pomocą plastikowej pipety przenieś zarodki w jednym stadium komórkowym na 1% płytkę iniekcyjną, która została pokryta świeżą pożywką E 3 pod mikroskopem preparacyjnym.

Za pomocą pipety ustawić zarodki w korytkach iniekcyjnych. Złamać końcówkę igły do wstrzykiwań kapilarnych, która została przyciągnięta do długiego stożka. Użyj końcówki do mikroładowarki, aby wypełnić igłę około jednym mikrolitrem 1% fluoresceiny w sadzie.

Umieść załadowaną igłę w manipulatorze mikrom podłączonym do pneumatycznego mikrowtryskiwacza. Wstrzyknij każdemu zarodkowi od dwóch do trzech nanolitrów fluoresceiny w klatce bezpośrednio do cytoplazmy komórki. Wstrzyknij co najmniej 50 zarodków w jednym eksperymencie.

Przenieść wstrzyknięte zarodki na szalkę Petriego zawierającą świeżą pożywkę E trzy, inkubować w ciemności w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza do pożądanego stadium rozwojowego, aby zahamować pigmentację przy 0,1% fenylotrei do zarodków po 24 godzinach, aby przygotować się do zamontowania zarodka. Pokryj od 15 do 2060 milimetrów szalki Petriego cienką warstwą 1% Aros rozpuszczonego w świeżym E dwa podłoża, gdy aros stężeje. Napełnij naczynie E dwoma pożywkami pod mikroskopem preparacyjnym.

Użyj ostrych kleszczy, aby pokryć wstrzyknięte zarodki na powlekanych płytkach. Unikaj wystawiania zarodków na działanie powietrza. Przechowywać podwielokrotność 2% aros o niskiej temperaturze topnienia w wodzie.

W bloku grzewczym w temperaturze 72 stopni Celsjusza. Użyj wypolerowanej ogniowo pipety przeszłej, aby przenieść jeden powlekany zarodek w około 150 mikrolitrach podłoża na 60-milimetrową szalkę Petriego. Umieść podobną objętość 2%aros obok zarodka i szybko wymieszaj ze sobą dwie kropelki, aby uzyskać jednorodną kroplę 1%Agros.

Ustaw zarodek tak, aby jego grzbietowa strona była skierowana w stronę soczewki obiektywu. Pozwól, aby aros zastygł, zanurz osadzony zarodek w pożywce E dwa. Umieść świeżo zamontowany zarodek na uchwycie płytki pod mikroskopem dwufotonowym wyposażonym w szerokopasmowy laser obrotowy.

Przed rozpoczęciem procesu aktywacji zdjęć należy uzyskać serię obrazów od najbardziej brzusznej do grzbietowej krawędzi tkanki wyrażającej się w odległości 860 nanometrów i przestrzeni. Obrazy oddalone od siebie o sześć mikronów na płaszczyźnie Z. Wybierz docelową płaszczyznę Z do aktywacji zdjęcia i ustaw na niej ostrość, używając GFP jako punktu orientacyjnego.

Zlokalizuj interesujący Cię region. Zrób pojedynczy obraz w odległości 860 nanometrów i pozostaw go otwartym w osobnym oknie, aby zapewnić prawidłowe wyrównanie. Bardzo ważne jest, aby laser o długości fali 720 nanometrów był w stanie zablokowanym przed otwarciem menu edycji wybielacza.

Użyj obrazu wykonanego w odległości 860 nanometrów, aby zdefiniować obszar zainteresowania lub zwrot z inwestycji w celu aktywacji zdjęcia. W oknie edycji wybielacza dostosuj względną moc lasera, liczbę iteracji i prędkość skanowania. Aby aktywować zdjęcie, naciśnij wybielacz, gdy laser się zatrzyma, przełącz się z powrotem na 860 nanometrów i uzyskaj obraz pojedynczej płaszczyzny, aby ocenić intensywność powstałego materiału aktywowanego zdjęciem.

Zbierz stos obrazów, aby ocenić zsan lub grubość aktywowanej domeny. W ten sposób możliwe jest empiryczne określenie intensywności lasera i czasu trwania ekspozycji. Aby uzyskać optymalną aktywację fotograficzną każdego klonu lub zdjęcia krzyżowego, aktywuj wszystkie pozostałe zarodki do eksperymentu.

Korzystając z tych warunków, hoduj zamontowane zarodki aktywowane zdjęciem w ciemności w temperaturze 28,5 stopni Celsjusza w dwóch pożywkach zawierających 0,1% fenylotiomocznika, aż osiągną pożądany etap rozwoju. Pod mikroskopem preparacyjnym użyj spiczastego skalpela, aby wykonać nacięcie w kształcie litery V w aros w pobliżu zamontowanego zarodka, tak aby dolna część wcięcia była skierowana w stronę głowy zarodka. Umieść zestaw zamkniętych kleszczy w miejscu wycięcia.

Delikatnie otwórz kleszcze oddzielające aros na całej długości zarodka i uwalniając zarodek do podłoża. Po uwolnieniu każdego zarodka użyj wypolerowanej ogniowo pipety pastwiskowej, aby zebrać go do mikroprobówki wirówkowej. W chemicznym dygestorium utrwal zarodki 4% formaldehydem przez trzy godziny.

W temperaturze pokojowej należy przeprowadzić odwodnienie, barwienie rehydratacyjne fosfatazą alkaliczną, sprzężoną, antyfluoresceiną i wszystkimi powiązanymi płukaniami, jak opisano w załączonym tekście. Dodaj 500 mikrolitrów przefiltrowanego szybko czerwonego roztworu do zarodków. Inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej, uzupełniać nowym szybkim roztworem do barwienia na czerwono Co godzinę, aż zostanie osiągnięty pożądany stosunek sygnału do tła.

Zatrzymaj reakcję barwienia trzema płukaniami w PBST po pięć minut każde. W dygestorii utrwal plamę w 4% formaldehydzie na 20 minut. Umyj dwa razy w PBST przez pięć minut każdy.

Przemyj czyste zarodki przez serię gradientów 25%, 50% i 75% glicerolu w PBS, aż każdy zarodek osiądzie na dnie probówki. Przechowuj zarodki w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aż będą gotowe do wizualizacji pod mikroskopem. Aby zamontować zarodki do wizualizacji, użyj strzykawki o pojemności jednego mililitra, aby nałożyć cztery 20-mikrolitrowe plamki przezroczystego smaru silikonowego na szkiełko mikroskopowe w rogach 15-milimetrowego kwadratowego kształtu.

Umieść zarodek w około 200 mikrolitrach 75% glicerolu między kroplami tłuszczu. Umieść szkiełko nakrywkowe na zarodku. Delikatnie popchnij szkiełko nakrywkowe prosto w dół, aż roztwór glicerolu się wypełni.

Przestrzeń między kroplami zarodków pokrytych tłuszczem może być przechowywana przez kilka dni w czterech stopniach Celsjusza przed wizualizacją za pomocą mikroskopii konfokalnej. Zdjęcie przedstawia żywy zarodek danio pręgowanego wykazujący ekspresję GFP pod kontrolą neurogenu. W jednym promotorze, któremu wstrzyknięto barwnik znacznikowy fluoresceiny w klatce na jednym etapie komórkowym przy użyciu poprzedniej metody na etapie od trzech do pięciu roztoczy.

Dyskretny obszar czterech pierwotnych mózgowisk został aktywowany fotoaktywem za pomocą lasera dwufotonowego i można było wykryć nieumieszczony w klatce barwnik znacznikowy fluoresceiny. Po procedurze aktywacji fotograficznej zarodek inkubowano w temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza, a komórki mózgowe zawierające fluoresceinę bez klatki śledzono za pomocą barwienia immunologicznego antyfluoresceiny na czerwono w 24 godziny po zapłodnieniu. Zwróć uwagę na niewielką liczbę komórek oznaczonych Po opanowaniu procedury aktywacji zdjęć można wykonać w ciągu zaledwie kilku godzin Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o kontrolowaniu optymalnych parametrów, umożliwiających precyzyjną aktywację zdjęcia w rozdzielczości pojedynczej komórki.