Name: Linearyzacja testu białka Bradforda (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Poznaj procedurę linearyzacji testu Bradforda w celu dokładnego oznaczania stężenia białka. Ta metoda biochemiczna poprawia czułość dziesięciokrotnie i zmniejsza zakłócenia detergentami w próbkach biologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca jest dedykowana pamięci śp. dr. Zvi Selingera, który gościł oryginalne badania opisane w tym artykule.

Linearyzacja wykresu kalibracyjnego białek metodą Bradforda:
Analiza białek metodą barwnika Coomassie brilliant blue, powszechnie znana jako metoda Bradforda 1, jest szeroko stosowana ze względu na szybki i wygodny protokół oraz względną czułość. Niestety, w szerokim zakresie stężeń białek występuje znaczny stopień zakrzywienia krzywej (Rys. 1). W związku z tym do wykresu kalibracyjnego wykorzystuje się jedynie wąski zakres stosunkowo wysokich stężeń białek, od 2-10 μg/ml BSA, co pozwala na lepsze dopasowanie regresji liniowej (Rys. 1, kolor zielony). Jednak nieliniowość ta sprawia, że stężenie białka w nieznanych próbkach musi mieścić się w ograniczonym zakresie wykresu kalibracyjnego, aby uniknąć dużego błędu, co ponadto zmniejsza dokładność pomiaru w tym zakresie. Nieliniowość stanowi poważny problem szczególnie wtedy, gdy nie dysponujemy mikrogramowymi ilościami białka, co często wymaga wielokrotnych rozcieńczeń nieznanych próbek.
Jak zaznaczono w oryginalnej pracy Bradforda, „źródłem nieliniowości jest sam odczynnik, ponieważ występuje nakładanie się widm dwóch różnych form barwnika” 1. W rzeczywistości trzy formy barwnika Coomassie brilliant blue znajdują się w równowadze kwasowo-zasadowej przy typowym dla tego testu niskim pH 2. Formy czerwona, niebieska i zielona mają maksima absorbancji odpowiednio przy 470, 590 i 650 nm (Rys. 2). Forma niebieska jest tą, która wiąże białko, tworząc kompleks intensywnie absorbujący światło przy 594 nm 3, 4 (Rys. 2). Bradford zauważył również, że „wartość tła dla odczynnika stale maleje w miarę wiązania coraz większej ilości barwnika z białkiem” 1 (Rys. 3). W związku z tym podjęliśmy próbę obliczenia redukcji tła przy 590 nm wraz z dodawaniem coraz większych ilości białka, mierząc zmianę absorbancji przy 450 nm, gdzie kompleks białko-barwnik nie absorbuje światła. Stwierdziliśmy, że malejące tło częściowo, ale nie w pełni, wyjaśnia występującą nieliniowość (Rys. 4).
Następnie wysunęliśmy hipotezę, że spadek stężenia wolnego barwnika powoduje kolejne zaburzenie odpowiedzi liniowej, ponieważ wiązanie białka z barwnikiem przebiega w stanie równowagi 5, zatem tworzenie kompleksu zależy nie tylko od stężenia wolnego białka, ale także od stężenia wolnego barwnika (Ryc. 5). Uwzględniając oba problemy związane ze zmiennym stężeniem wolnego barwnika, opracowaliśmy równanie matematyczne opisujące liniową zależność między stężeniem białka a stosunkiem pomiarów absorbancji przy 590 nm do 450 nm (Ryc. 6). Szczegółowy opis badania teoretycznego i eksperymentalnego znajduje się w naszej publikacji z 1996 roku w czasopiśmie Analytical Biochemistry 6. Równanie matematyczne zostało przetestowane eksperymentalnie, wykazując liniową krzywą kalibracyjną w całym zakresie stężeń białka (Ryc. 7). Ponadto równanie zostało zwalidowane poprzez niezależne wyznaczenie prawidłowej, zależnej od pH wartości punktu przecięcia z osią Y 6.
Szczegółowy protokół ulepszonego oznaczenia białka metodą Bradforda z wykorzystaniem mikro płytkowego czytnika absorbancji:
<ol>
	<li>Przygotować roztwór zapasowy standardu, albuminy surowicy bydlęcej (BSA), o stężeniu 0,1 mg/ml. Można wybrać inny standard, jednak należy pamiętać, że w każdym eksperymencie musi być stosowany ten sam standard.</li>
	<li>Próbki o nieznanym stężeniu rozcieńczyć w wodzie dejonizowanej. Należy dążyć do uzyskania stężenia 5-50 μg/ml. Wyższe lub niższe stężenia białka są dopuszczalne, ponieważ zakres liniowy testu nie posiada wyraźnego ograniczenia. Pomiary muszą być jednak przeprowadzone w zakresie liniowym czytnika absorbancji.</li>
	<li>Odczynnik Bradforda (Bio-Rad) rozcieńczyć 2,5-krotnie w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Do dołków w trzech powtórzeniach dodać 0 oraz 10-50 μl roztworu zapasowego BSA (tworząc krzywą kalibracyjną dla 0-5 μg BSA). Uzupełnić wodą dejonizowaną do objętości 100 μl/dołek.</li>
	<li>W oddzielnych dołkach dodać po 100 μl próbki o nieznanym stężeniu w trzech powtórzeniach. W celu zwiększenia dokładności można zastosować kilka stężeń próbki nieznanej.</li>
	<li>Do wszystkich dołków dodać 100 μl rozcieńczonego odczynnika Bradforda. Objętość całkowita wynosi 200 μl/dołek.</li>
	<li>Odczekać co najmniej 5 min, ale nie więcej niż 60 min, do czasu wybarwienia.</li>
	<li>Próba ślepa musi składać się z 200 μl wody dejonizowanej (a nie z dołka z samym barwnikiem bez białka).</li>
	<li>Zmierzyć absorbancję przy 590 nm oraz 450 nm.</li>
	<li>Przygotować wykres kalibracyjny, dzieląc wartości absorbancji netto przy 590 nm przez wartości przy 450 nm. Należy pamiętać, aby wartość dla braku białka (sam barwnik) uwzględnić jako punkt danych (Rys. 8).</li>
	<li>Obliczyć stężenie próbki nieznanej na podstawie równania liniowego krzywej kalibracyjnej (Rys. 9).</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
W przeciwieństwie do absorbancji przy pojedynczej długości fali 590 nm, stosunek wartości absorbancji przy 590 nm do 450 nm jest liniowy względem stężenia białka (Rys. 10).
Stężenie białka w nieznanej próbce można łatwo obliczyć, korzystając z równania liniowego krzywej kalibracyjnej (Rys. 10, równanie).
Jednakże większą dokładność uzyskuje się poprzez pomiar kilku rozcieńczeń nieznanej próbki. W tym celu należy przygotować dwa wykresy. Pierwszy to wykres kalibracyjny dla wzorca, z wartością μg białka na osi X (Rys. 11, prawa strona). Drugi wykres dotyczy nieznanej próbki, z wartością μl oryginalnej, nierozcieńczonej próbki na osi X (Rys. 11, lewa strona). Wartość dla samego barwnika powinna zostać uwzględniona na obu wykresach (Rys. 11). Stężenie białka w nieznanej próbce wyznacza się poprzez podzielenie nachylenia prostej dla nieznanej próbki przez nachylenie prostej dla wzorca (Rys. 11, równanie).
<img alt="Analiza absorbancji BSA, wykres krzywej kalibracyjnej; absorbancja 590 nm w funkcji stężenia BSA (µg/ml)." src="/files/ftp_upload/1918/1918fig2.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Konwencjonalny wykres kalibracyjny metodą Bradforda. Zakres liniowy przedstawiono za pomocą zielonych symboli.
<img alt="Widma absorbancji kompleksu białko-barwnik; Coomassie Brilliant Blue; wykres analizy spektroskopowej." src="/files/ftp_upload/1918/1918fig1.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Widma kompleksu białko-barwnik oraz samego barwnika.
<img alt="Równowaga statyczna; ΣFx=0; diagram oddziaływań; demonstruje równowagę cząsteczki; rozkład sił." src="/files/ftp_upload/1918/1918fig3.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3. Równowaga białko-barwnik.
<img alt="Wykres analizy białek przedstawiający absorbcję netto w stosunku do stężenia BSA z korektą liniowości i tła." src="/files/ftp_upload/1918/1918fig4.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rysunek 4. Redukcja poprawnie obliczonego tła częściowo zmniejsza nieliniowość.
<img alt="Schemat równowagi chemicznej z równaniami K_eq=[DP]/[D][P]; badanie oddziaływań białek." src="/files/ftp_upload/1918/1918fig5.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Równowaga białko-barwnik.
<img alt="Równania równowagi statycznej; Σ dla dopasowania widma; analiza wzoru; stosunek A590/A450; Y=aX+b." src="/files/ftp_upload/1918/1918fig6.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Podstawy matematyczne linearyzacji metody Bradforda do oznaczania białek.
<img alt="Wykres kalibracyjny BSA; stosunek absorbancji do stężenia; regresja liniowa; R²=0.9995; analiza testu." src="/files/ftp_upload/1918/1918fig7.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 7"> 
Rysunek 7. Linearyzacja wykresu kalibracyjnego metody Bradforda.
<img alt="Wykres analizy stężenia BSA, dane absorbancji 590/450 nm, wyniki ilościowego oznaczenia białka." src="/files/ftp_upload/1918/1918fig8.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rycina 8"> 
Rycina 8. Obliczanie wartości stosunku absorbancji.
<img alt="Wykres regresji liniowej absorbancji w funkcji BSA; równanie Y=0.353X+0.434, R²=0.999." src="/files/ftp_upload/1918/1918fig9.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 9"> 
Rysunek 9. Liniowy wykres kalibracyjny metody Bradforda.
<img alt="Wykres spektroskopowy porównujący absorbancję i stosunek absorbancji przy 590 nm dla analizy stężenia BSA." src="/files/ftp_upload/1918/1918fig10.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 10"> 
Rysunek 10. Linearyzacja wykresu kalibracyjnego metodą Bradforda.
<img alt="Wykresy ilościowego oznaczania białka z równaniami; absorbancja lizatu w stosunku do BSA, wykazująca wyniki liniowe." src="/files/ftp_upload/1918/1918fig11.jpg" data-altupdatedat="1788304762000" data-alt="Rysunek 11"> 
Rysunek 11. Obliczanie stężenia nieznanej próbki.

<ol><li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Chial, H. J., Thompson, H. B., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+spectral+study+of+the+charge+forms+of+Coomassie+blue+G%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A spectral study of the charge forms of Coomassie blue G.</a> Anal Biochem. 209, 258-266 (1993).</li>
<li>Chial, H. J., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+the+binding+of+Coomassie+brilliant+blue+to+proteins+at+low+and+neutral+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A comparison of the binding of Coomassie brilliant blue to proteins at low and neutral pH.</a> Anal Biochem. 213, 362-369 (1993).</li>
<li>Compton, S. J., Jones, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+dye+response+and+interference+in+the+Bradford+protein+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay.</a> Anal Biochem. 151, 369-374 (1985).</li>
<li>Congdon, R. W., Muth, G. W., Splittgerber, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+binding+interaction+of+Coomassie+blue+with+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">The binding interaction of Coomassie blue with proteins.</a> Anal Biochem. 213, 407-413 (1993).</li>
<li>Zor, T., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+Bradford+protein+assay+increases+its+sensitivity%3A+theoretical+and+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Linearization of the Bradford protein assay increases its sensitivity: theoretical and experimental studies.</a> Anal Biochem. 236, 302-308 (1996).</li>
</ol>

Metoda Bradforda do oznaczania białek jest popularna ze względu na łatwość wykonania i względną czułość. Linearyzacja w całym zakresie stężeń białek uzyskana dzięki przedstawionemu tutaj protokołowi dodatkowo upraszcza analizę, ponieważ próbki o nieznanym stężeniu nie muszą mieścić się w zakresie wykresu kalibracyjnego.
Co istotne, ulepszony protokół zapewnia dodatkowo następujące korzyści w porównaniu z oryginalnym protokołem Bradforda:
<ol>
 <li>Zwiększona dokładność.</li>
 <li>Czułość...

<table><tbody><tr><td>Odczynik Bradforda</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Albuminy surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Amersco</td><td>0332</td><td></td></tr><tr><td>Wielopłytkowy czytnik absorbancji</td><td>BioTek</td><td>Synergy2</td><td></td></tr></tbody></table>

linearyzacja testu bradforda na oznaczenie białek

Linearization of the Bradford Protein Assay

Oznaczanie mikrogramowych ilości białka w teście Bradforda z użyciem Coomassie brilliant blue odbywa się poprzez pomiar absorbancji przy 590 nm. Ten najpowszechniejszy test umożliwia szybką i prostą kwantyfikację białek w lizatach komórkowych, frakcjach komórkowych lub próbkach białek rekombinowanych w celu normalizacji pomiarów biochemicznych. Jednakże immanentna nieliniowość obniża czułość i dokładność tej metody. Wykazano, że w standardowych warunkach testu stosunek pomiarów absorbancji przy 590 nm i 450 nm jest ściśle liniowy względem stężenia białka. Ta prosta procedura zwiększa dokładność i poprawia czułość testu około 10-krotnie, umożliwiając kwantyfikację białka w ilościach sięgających 50 ng albuminy surowicy bydlęcej. Ponadto nowy protokół znacznie redukuje interferencję powszechnie wywoływaną przez detergenty stosowane do przygotowania lizatów komórkowych. Równanie liniowe opracowane na podstawie prawa działania mas oraz prawa Beer-a idealnie pasuje do danych eksperymentalnych.

Dokładność i czułość oznaczania białek za pomocą szybkiej i wygodnej metody Bradforda są ograniczone przez wewnętrzną nieliniowość. Przedstawiamy prostą procedurę linearyzacji, która znacznie zwiększa dokładność, poprawia czułość analizy około 10-krotnie i istotnie redukuje interferencje wywołane przez detergenty.

Linearyzacja testu Bradforda na oznaczenie białek

Oznaczanie ilości białka w zakresie mikrogramowym w metodzie Bradforda z użyciem Coomassie brilliant blue przeprowadza się poprzez pomiar absorbancji przy 590 nm.

Analiza białek metodą Bradforda rozpoczyna się od dodania standardu BSA w rosnących ilościach oraz rozcieńczeń nieznanej próbki do płytki 96-dołkowej; w celu uzupełnienia zmiennej objętości dodaje się wodę dejonizowaną. Następnie do wszystkich dołków, z wyjątkiem dołka kontrolnego (blank), w którym musi znajdować się woda, dodaje się odczynnik Bradforda. Po pięciu minutach odczytuje się absorbancję przy 590 nanometrach w celu wykrycia kompleksu barwnika z białkiem oraz przy 450 nanometrach.W celu linearyzacji wykresu zastosowano stosunek wartości absorbancji przy 590 nanometrach i 450 nanometrach, który jest ściśle liniowy w stosunku do ilości białka. Cześć, jestem z Katedry Biochemii na Uniwersytecie w Tel Awiwie w Izraelu, reprezentuję nasz zespół laboratoryjny. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wyznaczania stężenia białka przy użyciu ulepszonego, zlinearyzowanego protokołu Bradforda.Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu normalizacji ilości białka w SZaS, na przykład przed nakładaniem próbek na żele. Przejdźmy zatem do pracy. W metodzie Bradforda trzy formy barwnika Kumasi brilliant blue znajdują się w równowadze kwasowej przy typowym dla tego badania niskim pH.Formy

linearization-of-the-bradford-protein-assay

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Linearyzacja testu białka Bradford

Film demonstruje technikę western blottingu opartą na normalizacji całkowitego białka do ilościowego określania docelowej ekspresji białka w próbce. Wykorzystując całkowite barwienie białka w próbce, przeprowadza się analizę ratiometryczną w celu określenia względnego poziomu ekspresji białka docelowego.

Ilościowe Western Blot w celu oszacowania poziomów ekspresji białka

Protokoły tutaj opisują kinetyczne testy interakcji białko-białko za pomocą interferometrii warstwy biologicznej. Syntaza ATP typu F, która bierze udział w metabolizmie energii komórkowej, może być hamowana przez swoją ε podjednostka u bakterii. Dostosowaliśmy interferometrię biowarstw do badania oddziaływań kompleksu katalitycznego z hamującą domeną C-końcową ε.

Interferometria biowarstwowa do pomiaru kinetyki oddziaływań białko-białko i efektów ligandów allosterycznych

Zademonstrowano test immunologiczny oparty na naczyniach włosowatych, wykorzystujący komercyjną platformę do pomiaru docelowych białek z całkowitych preparatów białkowych. Ponadto parametry testowe czasu ekspozycji, stężenia białka i rozcieńczenia przeciwciał są zoptymalizowane pod kątem systemu modelowego hodowli komórkowych.

Procedura i kluczowe strategie optymalizacyjne dla zautomatyzowanej metody immunologicznego opartego na elektroforetycznych naczyniach włosowatych

Ten protokół opisuje bezkalibracyjne podejście do ilościowego określania homo-oligomeryzacji białek in vitro na podstawie spektroskopii fluktuacji fluorescencji przy użyciu komercyjnej mikroskopii skaningowej światła. Wyświetlane są prawidłowe ustawienia akwizycji i metody analizy.

Kwantyfikacja homooligomeryzacji białek in vitro bez kalibracji przy użyciu komercyjnego oprzyrządowania i bezpłatnego oprogramowania do analizy jasności typu open source

Ten protokół opisuje, jak wytwarzać komety aktynowe na powierzchni koralików przy użyciu dostępnych na rynku składników białkowych. Takie systemy naśladują wystające struktury znajdujące się w komórkach i mogą być wykorzystywane do badania fizjologicznych mechanizmów wytwarzania siły w uproszczony sposób.

Rekonstrukcja ruchliwości opartej na aktynie za pomocą dostępnych na rynku białek

Ten artykuł zawiera protokół do oznaczania ilościowego białek przy użyciu testu Bradforda i smartfona jako urządzenia analitycznego. Poziomy białka w próbkach można określić ilościowo za pomocą danych o kolorach uzyskanych ze zdjęcia mikropłytki wykonanego smartfonem.

RGBradford: Kwantyfikacja białka za pomocą aparatu w smartfonie

Tutaj opisujemy protokoły biofizycznej charakterystyki tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS), które obejmują ligazy ubikwityny: ligazę Von Hippel-Lindau, ligazę E3 (VHL) i Cereblon (CRBN).  Metody biofizyczne zilustrowane w niniejszym artykule obejmują powierzchniowy rezonans plazmonowy (SPR), interferometrię biowarstwową (BLI) i izotermiczną kalorymetrię miareczkową (ITC).

Opracowanie i zastosowanie testów biofizycznych do oceny tworzenia kompleksów trójskładnikowych indukowanych przez chimery ukierunkowane na proteolizę (PROTACS)

Ten artykuł opisuje protokół badania interakcji DNA-białko za pomocą systemu interferometrii biowarstwowej (BLI) opartego na streptawidynie. Przedstawiono w nim podstawowe kroki i rozważania dotyczące wykorzystania podstawowej lub zaawansowanej kinetyki wiązania w celu określenia powinowactwa wiązania równowagi (KD) oddziaływania.

Analiza interakcji DNA-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie

Opisujemy metodę użycia cyklodekstryny do pośredniczenia w wymianie między lipidami błony komórkowej a lipidami egzogennymi. Technikę tę można połączyć z eksperymentami badającymi białka transbłonowe, które zachowują się inaczej w środowiskach podobnych do tratw lipidowych niż w środowiskach niepodobnych do tratwy.

Test wymiany lipidów w żywych komórkach

Białka wiążą się z aktyną filamentową (F-aktyną) poprzez odrębne moduły wiążące aktynę. W tym filmie prezentujemy procedurę współsedymentacji aktyny, która jest testem in vitro rutynowo stosowanym do analizy białek lub specyficznych domen wiążących F-aktynę.

Test współwytrącania aktyny; do analizy wiązania białek z F-aktyną

Poznaj procedurę linearyzacji testu Bradforda w celu dokładnego oznaczania stężenia białka. Ta metoda biochemiczna poprawia czułość dziesięciokrotnie i zmniejsza zakłócenia detergentami w próbkach biologicznych.

Linearyzacja testu Bradforda na oznaczenie białek

Przeglądaj więcej filmów