Pomiar 50% aktywności hemolitycznej dopełniacza (CH₅₀) w surowicy

Pomiar 50% aktywności hemolitycznej dopełniacza CH 50 w surowicy. Będą potrzebne pipety umożliwiające pobranie 200 µL oraz 1000 µL surowicy testowej, która była przechowywana w lodzie, uwrażliwione erytrocyty owcze, bufor solny Varone oraz woda destylowana, probówki do testu surowicy, a także probówki do lizy bazowej i całkowitej, mieszadło wortex oraz 96-dołkowa płytka z płaskim dnem. Należy indywidualnie oznakować probówki jako kontrolne oraz rozcieńczenie końcowe. W tym przypadku rozpoczynamy od rozcieńczenia 1:8.

Kontynuuj dwukrotne rozcieńczanie, aby uzyskać rozcieńczenia 1:16, 1:32, 1:64 oraz 1:128, a pozostałe probówki opisz jako próbę ślepą i lizę całkowitą. Po opisaniu wszystkich probówek można przystąpić do rozcieńczania surowicy badawczej. Rozpocznij od przeniesienia 300 µL soli buforowej R do nowej probówki.

Następnie przenieś 100 µL surowicy do 300 µL soli buforowej R. Pozwoli to uzyskać rozcieńczenie początkowe w stosunku 1:4. Upewnij się, że próbka surowicy została dokładnie wymieszana.

Następnie przenieś 200 µL roztworu soli fizjologicznej (PBS) do wcześniej oznakowanych probówek. Dodaj również 200 µL roztworu soli fizjologicznej do dwóch pustych probówek w zestawie probówek do lizy całkowitej. Do probówek kontrolnych dodaj 200 µL wody destylowanej zamiast roztworu soli fizjologicznej.

Następnie przenieś 200 µL serum w rozcieńczeniu 1:4 do probówki oznaczonej jako 1:8. Wcześniej do serii probówek od 1:8 do 1:128 przeniesiono 200 µL soli fizjologicznej z albuminą. Pozwoli to teraz na uzyskanie rozcieńczenia 1:8.

Dokładnie wymieszać próbkę, a następnie przenieść 200 µL do probówki oznaczonej jako jedna w punkcie 16. Powtarzać czynność do momentu rozcieńczenia całej serii probówek. Odrzucić 200 µL z probówki o rozcieńczeniu 1:28, aby objętość końcowa wynosiła 200 µL.

Uczulone owcze erytrocyty mogły z czasem osiąść. Należy je resuspender, delikatnie odwracając probówkę kilka razy. Po dokładnej resuspensji przenieść 200 µL uczulonych owczych erytrocytów do każdej z przygotowanych probówek.

Należy upewnić się, że surowica jest dokładnie wymieszana z erytrocytami. Dodanie uwrażliwionych owczych erytrocytów do probówki z próbą ślepą pozwoli na oznaczenie lizy spontanicznej, natomiast dodanie krwi do probówki z lizą całkowitą umożliwi wyznaczenie wartości 100%. Używając wirówki typu vortex ustawionej na niskie obroty, należy delikatnie wymieszać każdą z probówek. Następnie probówki należy umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C i inkubować przez 30 minut.

Po 15 minutach inkubacji delikatnie wymieszaj zawartość probówek wirówką wortex ponownie i inkubuj przez kolejne 15 minut. Po inkubacji przenieś probówki do wirówki ustawionej na temperaturę 4 °C i wiruj przy 1500 G przez pięć minut. Po wirowaniu ostrożnie wyjmij probówki i umieść je w odpowiednim stojaku. W tym momencie widoczny będzie osad erytrocytów, natomiast SNA będzie miało czerwony kolor.

W celu oznaczania hemoglobiny, do odpowiedniej liczby dołków płaskodنnej płytki 96-dołkowej należy nalać 100 µL wody destylowanej. Uważając, aby nie przenieść osadu, należy przenieść 100 µL supernatantu do odpowiedniego dołka płytki 96-dołkowej. Po naniesieniu wszystkich próbek na płytkę, należy zmierzyć absorbancję za pomocą spektrofotometru do płytek ustawionego na 540 nm.

Oto surowe dane absorbancji dla dwóch powtórzeń: A1 i B1. Należy odnieść się do rozcieńczenia 1:8.

Następnie dysponujemy danymi dla rozcieńczeń 1:16, 1:32, 1:64 oraz 1:128. Próbki A6 i B6 stanowią próbę ślepą, natomiast A7 i B7 to całkowita liza.

Po zebraniu danych należy obliczyć średnią absorbancję dla każdej z powtórzonych próbek. Następnie od wszystkich próbek należy odjąć absorbancję tła, która odpowiada lizie spontanicznej. Po zgromadzeniu wszystkich danych można obliczyć procentową lizę dla każdego rozcieńczenia, korzystając z poniższego wzoru.

Po obliczeniu wszystkich danych, należy nanieść procentową lizę na oś pionową, a rozcieńczenie surowicy na oś poziomą. Powstały wykres można następnie wykorzystać do obliczenia rozcieńczenia surowicy wymaganego do lizy 50% uczulonych krwinek czerwonych. Wykres ten przedstawia procentową lizę w funkcji stopnia rozcieńczenia surowicy.

Następnie można poprowadzić linię od poziomu 50% lizy aż do punktu przecięcia z krzywą. W punkcie przecięcia z krzywą prowadzi się linię pionową w dół do osi poziomej. Wartość ta reprezentuje stopień rozcieńczenia, do którego należy rozcieńczyć surowicę, aby zapewnić 50% lizy; przy porównywaniu dwóch próbek surowicy w celu ustalenia, czy istnieje różnica w CH 50, rozcieńczenie zapewniające 50% lizy może służyć jako miara.