Badanie specyficznych dla tkanek i narządów odpowiedzi fitochromów przy użyciu wspomaganego FACS profilowania ekspresji specyficznej dla typu komórki u Arabidopsis thaliana

Badanie odpowiedzi fitochromów w określonych typach komórek roślinnych. Pułapka wzmacniająca GAL 4G FP i transgeniczne linie U-A-S-B-V-R w poprzek w celu wytworzenia niedoboru fitochromu. Protoplasty liści potomnych U-A-S-B-V-R krzyżówkują GA 4G FP z roślin.

Następnie protoplasty są sortowane według faktów w celu wyizolowania protoplastów GFP ujemnych i GFP dodatnich w oddzielnych próbkach, izolowane protoplasty są analizowane za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej. Aby potwierdzić zbiór protoplastów GFP dodatnich, RNA jest ekstrahowane z protoplastów i analizowane spektralnie. Cześć, nazywam się Sanka Pivar i pracuję w laboratorium BARDA Montgomery w Laboratorium Badawczym Zakładów Energetycznych na Uniwersytecie Stanowym Michigan.

Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę izolowania protoplastów liściowych od góry ANA w celu sortowania komórek wspomaganego fluorescencją i analizy ekspresji genów specyficznej dla typu komórki. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania odpowiedzi zależnych od fitochromu specyficznych dla tkanek i narządów. Więc zacznijmy.

Linia ANA Arabidopsis użyta w tej procedurze została wygenerowana przez rodziców z dwuczęściowym podejściem do pułapki wzmacniającej. Jedna z nich pochodzi z biblioteki linii pułapek wzmacniających z różnymi wzorami gal lub ekspresji. Rodzic pierwszy wyraża również GFP pod kontrolą sekwencji aktywacji nadrzędnej lub UAS.

Krótko mówiąc, czynnik transkrypcyjny GA 4 aktywuje dowolny gen umieszczony pod kontrolą UAS. W rodzicu jedna linia GA cztery aktywuje GFP rodzic jeden został skrzyżowany z rodzicem dwa w rodzicu drugim. Gen BVR jest pod kontrolą GAL four za pośrednictwem UAS.

Linia wynikająca z krzyżowania to krzyż U-A-S-B-V-R krzyż G 4G FP.In linii rodzicielskich, biosynteza chromochromu fitochromu cztery przebiega od LA przez hem do bivera w skrócie bv. Ale w potomstwie produkt genu BVR blokuje biogenezę chromoforu fitochromu poprzez redukcję prekursora BV. Ta linia potomna BVR została potwierdzona i może być wykorzystana do zbadania, w jaki sposób obniżenie poziomu aktywnego fitochromu wpływa na różne tkanki roślinne.

Rozpocznij tę procedurę od przygotowania gleby i doniczek do uprawy roślin w celu wytworzenia protoplastów liściowych. Tak więc wysterylizowane nasiona około 2000 na próbkę na eksperyment na glebie w doniczkach. Na dno tacki zawierającej doniczki dodaje się wodę, a całą tacę przykrywa się folią.

Uprawiaj rośliny przez pięć tygodni pod białym oświetleniem w temperaturze 22 stopni Celsjusza i wilgotności 70%. Po pierwszych pięciu do sześciu dniach potwierdza się kiełkowanie nasion i usuwa się folię z tacy. W celu wyizolowania protoplastów najpierw przygotuj bufor TEX na jeden litr buforu, odważ GA, B, pięć soli, MES, chlorek wapnia, azotan amonu i sacharozę.

Całkowicie rozpuść składniki w około 900 mililitrach dejonizowanej wody destylowanej. W skrócie DD H2O i doprowadzić pH do 5,7 za pomocą jednego molowego KOH. Następnie doprowadź końcową objętość do jednego litra i wysterylizuj filtrem.

Następnie zbierz zielone, zdrowe liście z roślin. Zbierz około 250 mililitrów liści luźno zapakowanych w zlewkę. Opłucz liście 40 mililitrami.

DD H2O cztery razy, a następnie dwukrotnie spłukać sterylnym DD H2O za pomocą skalpela numer 20. Pokrój liście w cienkie paski i podziel tkankę równo na dwie 50 sterylnych plastikowych probówek. Mieszankę do wytrawiania jednego x liść, przygotowuje się przez dodanie pięciomililitrowej porcji 10 x roztworu podstawowego przygotowanego przez rozpuszczenie 2% wagowych dla objętości labiryntu R 10 i 4% wagowych dla objętości celulazy na azua R 10 w buforze TEX do 45 mililitrów świeżego buforu TEX.

Dodaj około 25 mililitrów jednego x trawienie liści. Wymieszaj z paskami liści w każdej tubce, tak aby cała tkanka liścia została pokryta. Przystąp do odkurzania, naciekaj tkankę liścia podczas trawienia.

Mieszać w otwartych probówkach przez godzinę w temperaturze pokojowej za pomocą próżniowego środka osuszającego podłączonego do pompy wodnej. Rurki z nakrętką zawierające tkankę liścia i mieszankę do trawienia liści należy przechowywać owinięte w folię aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło. Następnie wykonaj trzygodzinną inkubację w temperaturze pokojowej na bujaku, delikatnie potrząsając.

Po trzech godzinach zwiększ prędkość wahacza na dwie minuty, aby uwolnić protoplasty. Przefiltrować surową zawiesinę protoplastów przez dwie warstwy sterylnej gazy w celu usunięcia abri i zebrać filtrat w sterylnej szklanej zlewce. Przefiltrować filtrat przez sterylną siatkę nylonową o grubości 100 mikrometrów do sterylnej szalki Petriego.

Zbierz przepływ i przenieś go do nowej sterylnej probówki o pojemności 50 mililitrów. Użyj około 15 do mililitrów świeżego buforu TEX, aby umyć sterylną naczynie petro i zebrać wszelkie protoplasty podczas wydostania się na powierzchnię. Odwirować przepływ przy 100-krotności grawitacji w temperaturze 10 stopni Celsjusza przez 15 minut za pomocą wirówki kubełkowej z odchylanym krokiem z przyspieszeniem ustawionym na sześć i zwalnianiem przy zerze po zakończeniu wirowania.

Użyj sterylnego dziewięciocalowego szklanego makaronu na zwierzę podłączonego do pompy perystaltycznej, aby usunąć około 25 do 30 mililitrów płynu poniżej pływającej warstwy protoplastów, która zawiera resztki i granulki bez naruszania pływającej warstwy protoplastów, pozostawiając około 10 do 50 mililitrów. Po usunięciu granulowanych zanieczyszczeń dodaj świeży bufor TEX do końcowej objętości 40 mililitrów. Podczas delikatnego resusowania zawieszania protoplastów, powtórz usuwanie zanieczyszczeń i zawiesinę resus pozostałych pływających protoplastów.

Jeszcze dwa razy, aby usunąć jak najwięcej zanieczyszczeń komórkowych D. Czas wirowania skraca się do 10 minut w pierwszym powtórzeniu i do pięciu minut w ostatnim powtórzeniu. Na koniec użyj sterylnej pipety transferowej o pojemności jednego mililitra, aby zassać pływające protoplasty i przenieść je do nowej 15-mililitrowej probówki.

Przejdź bezpośrednio do sortowania przed sortowaniem. Zbadaj protoplasty za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej lub w skrócie CLSM, używając lasera o długości 488 nanometrów do wzbudzenia, aby potwierdzić integralność protoplastów i obecność fluorescencji GFP w puli protoplastów. Minimalna ilość zanieczyszczeń w ciągu dnia jest konieczna, aby uniknąć zatkania dyszy sortującej, sortowania izolowanych PROTOPLASTÓW w buforze TEX za pomocą faksu.

Używając dyszy o długości 200 mikrometrów na głowicy sortującej makro z szybkością zdarzeń od 6 000 do 15 000 przy ciśnieniu systemowym około dziewięciu PSI zgodnie z dostosowanym protokołem, użyj PROTOPLASTÓW typu dzikiego bez GFP do określenia progów autofluorescencji w celu zebrania komórek protoplastów GFP dodatnich za pomocą powietrza zwanego laserem Argonne działającym z prędkością 100 miliwatów na linii argonu o długości 488 nanometrów. Identyfikacja fluorescencji GFP za pomocą filtra pasmowego 530 ukośników 30 po zebraniu protoplastów GFP dodatnich. Ponownie zbadaj posortowane protoplasty pod mikroskopem, tak jak przed rozpoczęciem sortowania w celu profilowania ekspresji.

Ekstrahować całkowite RNA z posortowanych protoplastów. CDNA można następnie przygotować do hybrydyzacji. CD NA jest następnie przesyłany do hybrydyzacji z jedną macierzą całego genomu OPSYS Ametri.

Oto kilka reprezentatywnych wyników sortowania kontroli typu dzikiego przez protoplasty. Protoplasty nie mają żadnych sygnałów w bramce dodatniej GFP. Jednak pozytywne sygnały GFP są identyfikowane dla próbek protoplastów wyizolowanych z linii GAL 4G FP przed sortowaniem protoplastów wyizolowanych z roślin typu dzikiego nie mają fluorescencji GFP w analizach CLSM.

Natomiast mieszanina protoplastów pozbawiona i wykazująca fluorescencję GFP jest wykrywana w próbkach protoplastów z linii GAL 4G FP po faktach. Analiza CLSM wskazuje, że izolacja PROTOPLASTÓW GFP dodatnich od reprezentatywnej linii gal 4G FP RNA jest ekstrahowana z izolowanych protoplastów, a jeden mililitr daje RNAA wystarczającą ilość do wykrycia za pomocą spektrometrii fluorowej. Właśnie pokazaliśmy, jak wyizolować protoplasty liści z atopii ANA w celu sortowania komórek wspomaganego fluorescencją i analizy ekspresji genów specyficznej dla typu komórki.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o delikatnym obchodzeniu się z protoplastami i ograniczeniu ich ekspozycji na światło. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.