Badanie odpowiedzi fitochromów specyficznych dla tkanek i organów z wykorzystaniem profilowania ekspresji specyficznej dla typów komórek wspomaganego przez FACS u Arabidopsis thaliana

Aby zbadać reakcje fitochromów w konkretnych typach komórek roślinnych, zastosowano pułapkę wzmacniacza GAL 4G FP oraz linie transgeniczne U-A-S-B-V-R w celu uzyskania roślin z deficytem fitochromu. Protoplasty liściowe potomstwa z krzyżówki U-A-S-B-V-R i GA 4G FP zostają wyizolowane z roślin.

Następnie protoplasty poddaje się sortowaniu w celu wyizolowania protoplastów GFP-ujemnych i GFP-dodatnich do osobnych próbek, a wyizolowane protoplasty analizuje się za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej. Aby potwierdzić pobranie protoplastów GFP-dodatnich, z protoplastów ekstrahuje się RNA i poddaje analizie spektralnej. Cześć, jestem Sanka Pivar z laboratorium BARDA Montgomery w Departamencie Energii Plant Research Laboratory na Michigan State University.

Dzisiaj przedstawimy procedurę izolacji protoplastów liściowych z Arabidopsis thaliana do sortowania komórek wspomaganego fluorescencją oraz analizy ekspresji genów specyficznej dla typu komórek. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania odpowiedzi zależnych od fitochromów, specyficznych dla danej tkanki i organu. Przejdźmy zatem do części praktycznej.

Linia Arabidopsis ANA wykorzystana w tej procedurze została wygenerowana z rodziców przy użyciu dwuczęściowego podejścia pułapki wzmacniacza (enhancer trap). Jeden z rodziców pochodzi z biblioteki linii pułapek wzmacniacza o różnych wzorach ekspresji gal. Pierwszy rodzic wykazuje również ekspresję GFP pod kontrolą sekwencji aktywacyjnej upstream (UAS).

Krótko mówiąc, czynnik transkrypcyjny GAL4 aktywuje każdy gen znajdujący się pod kontrolą UAS. U rodzica jednego GAL4 aktywuje GFP; rodzic pierwszy został skrzyżowany z rodzicem drugim, u którego gen BVR znajduje się pod kontrolą GAL4 poprzez UAS.

Linia powstała w wyniku krzyżówki to U-A-S-B-V-R cross G 4G FP. W liniach rodzicielskich biosynteza chromoforu fitochromu przebiega od $\delta$-aminolewulinianu (ALA), poprzez hem, do biliverdyny (BV). Jednak w potomstwie produkt genu BVR blokuje biogenezę chromoforu fitochromu poprzez redukcję prekursora BV. Ta linia potomstwa BVR typu enhancer trap została potwierdzona i może być wykorzystana do badania, w jaki sposób obniżenie poziomu aktywnego fitochromu wpływa na różne tkanki roślinne.

Procedurę należy rozpocząć od przygotowania gleby i doniczek do uprawy roślin w celu wygenerowania protoplastów liściowych. W doniczkach z glebą wysiewa się wysterylizowane nasiona w liczbie około 2000 na próbkę na eksperyment. Do dna tacy zawierającej doniczki dolewa się wodę, a całą tacę przykrywa folią spożywczą.

Rośliny hodować przez pięć tygodni przy białym oświetleniu w temperaturze 22 °C i wilgotności 70%. Po pierwszych pięciu do sześciu dniach, po potwierdzeniu kiełkowania nasion, należy usunąć folię plastikową z tacy. W celu izolacji protoplastów należy najpierw przygotować bufor TEX; na jeden litr buforu odważyć pięć soli GA's B: MES, chlorek wapnia, azotan amonu oraz sacharozę.

Całkowicie rozpuścić składniki w około 900 mililitrach odsolonej wody destylowanej (w skrócie DD H2O) i doprowadzić pH do poziomu 5.7 za pomocą jednomolarnego KOH. Następnie uzupełnić objętość końcową do jednego litra i poddać sterylizacji przez filtrację.

Następnie należy zebrać zdrowe, zielone liście z roślin. Zebrać około 250 mililitrów liści, luźno ułożonych w zlewce. Przepłukać liście 40 mililitrami.

Przemyj cztery razy podwójnie destylowaną wodą (DD H2O), a następnie dwa razy opłucz w sterylnej DD H2O, używając skalpela nr 20. Potnij liście na cienkie paski i podziel tkankę równo do dwóch sterylnych probówek plastikowych o pojemności 50 µL. Mieszaninę do trawienia liści 1x przygotowuje się poprzez dodanie 5 ml alikwotu 10-krotnego roztworu zapasowego (przygotowanego przez rozpuszczenie 2% w/v mazy R 10 oraz 4% w/v celulazy z azua R 10 w buforze TEX) do 45 ml świeżego buforu TEX.

Dodaj około 25 mililitrów 1x roztworu do trawienia liści. Wymieszaj z paskami liści w każdej probówce tak, aby cała tkanka liściowa została przykryta. Przejdź do próżniowania, aby infiltrować tkankę liściową roztworem trawiącym.

Mieszać w otwartych probówkach przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej, używając eksykatora próżniowego podłączonego do pompy wodnej. Probówki z zakrętkami zawierające tkankę liściową i mieszaninę do trawienia liści należy owinąć folią aluminiową, aby zapobiec ekspozycji na światło. Następnie inkubować przez trzy godziny w temperaturze pokojowej na wytrząsarce przy łagodnym wstrząsaniu.

Po trzech godzinach zwiększ prędkość wytrząsarki na dwie minuty, aby uwolnić protoplasty. Przecedź surową zawiesinę protoplastów przez dwie warstwy sterylnej gazy, aby usunąć zanieczyszczenia, a przesącz zbierz do sterylnego zlewki szklanej. Przesącz przefiltruj przez sterylną siatkę nylonową o rozmiarze oczek 100 µm do sterylnej szalki Petriego.

Zebrać frakcję przepływową i przenieść ją do nowej sterylnej probówki o pojemności 50 ml. Użyć około 15 ml świeżego buforu TEX do wypłukania sterylnej szalki Petriego i zebrania protoplastów przylegających do powierzchni. Odwirować frakcję przepływową przy 100 ×g w temperaturze 10 °C przez 15 minut, używając wirówki z rotorem z koszyczkami, z przyspieszeniem ustawionym na 6 i hamowaniem na 0 po zakończeniu wirowania.

Używając sterylnej dziewięciocalowej szklanej pipety połączonej z pompą perystaltyczną, należy usunąć około 25 do 30 mililitrów cieczy znajdującej się poniżej warstwy pływających protoplastów, która zawiera osad i pozostałości zanieczyszczeń, uważając, aby nie naruszyć warstwy protoplastów; w probówce powinno pozostać około 10 do 50 mililitrów cieczy. Po usunięciu osadu należy dodać świeży bufor TEX do uzyskania objętości końcowej 40 mililitrów. Delikatnie resuspendując protoplasty, należy powtórzyć proces usuwania zanieczyszczeń i resuspensji pozostałych pływających protoplastów.

Powtórz tę procedurę jeszcze dwa razy, aby usunąć jak najwięcej debris komórkowych. Czas wirowania skróć do 10 minut w pierwszym powtórzeniu i do pięciu minut w ostatnim powtórzeniu. Na koniec, za pomocą sterylnej pipety transferowej o objętości 1 ml, odessij pływające protoplasty i przenieś je do nowej probówki o pojemności 15 ml.

Przejdź bezpośrednio do sortowania przed właściwym procesem sortowania. Zbadaj protoplasty za pomocą konfokalnej skaningowej mikroskopii laserowej (CLSM), używając lasera o długości fali 488 nanometrów do wzbudzenia, aby potwierdzić integralność protoplastów oraz obecność fluorescencji GFP w puli protoplastów. Niezbędna jest minimalna ilość zanieczyszczeń, aby uniknąć zapchania dyszy sortującej; sortuj wyizolowane PROTOPLASTY w buforze TEX za pomocą FACS.

Stosując dyszę o średnicy 200 µm w głowicy do makrosortowania przy częstotliwości zdarzeń od 6 000 do 15 000 i ciśnieniu systemowym około 9 PSI zgodnie z dostosowanym protokołem, należy wykorzystać protoplasty typu dzikiego niewyrażające GFP w celu określenia progów autofluorescencji do zbierania protoplastów wykazujących dodatni sygnał GFP. Sortowanie komórek należy przeprowadzić przy użyciu lasera argonowego pracującego z mocą 100 mW na linii argonowej 488 nm. W celu identyfikacji fluorescencji GFP należy zastosować filtr pasmowy 530/30 po zebraniu protoplastów dodatnich pod kątem GFP. Następnie należy ponownie zbadać posortowane protoplasty pod mikroskopem, analogicznie do procedury przed rozpoczęciem sortowania, w celu profilowania ekspresji.

Wyizoluj całkowite RNA z posortowanych protoplastów. Następnie można przygotować cDNA do hybrydyzacji. cDNA poddaje się następnie hybrydyzacji z macierzami całego genomu TH one OPSYS Ametri.

Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki sortowania protoplastów z kontrolnej linii typu dzikiego. Protoplasty nie wykazują żadnych sygnałów w bramce dodatniej dla GFP. Natomiast sygnały dodatnie dla GFP zidentyfikowano w próbkach protoplastów izolowanych z linii GAL 4G FP; przed sortowaniem protoplasty izolowane z roślin typu dzikiego nie wykazywały fluorescencji GFP w analizach CLSM.

Podczas gdy w próbkach protoplastów z linii GAL 4G FP po faktach wykrywano mieszaninę protoplastów niewykazujących i wykazujących fluorescencję GFP, analiza CLSM wskazuje na izolację protoplastów GFP-dodatnich z reprezentatywnej linii gal 4G FP. RNA można wyekstrahować z wyizolowanych protoplastów, a jeden mililitr dostarcza ilości RNA wystarczającej do detekcji za pomocą fluorospektrometrii. Przedstawiliśmy właśnie sposób izolacji protoplastów liściowych z atopy ANA w celu sortowania komórek wspomaganego fluorescencją oraz analizy ekspresji genów specyficznej dla typu komórek.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby ostrożnie obchodzić się z protoplastami i ograniczyć ich ekspozycję na światło. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.