Name: Niedobór Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI w defektach terenowych podczas progresji do raka jelita grubego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 28 min 15 s
Description: Poznaj metodę immunobarwienia tkanek jelita grubego w celu oceny ekspresji białek naprawy DNA Pms2 i ERCC1. Technika ta pozwala identyfikować defekty terenowe wskazujące na ryzyko progresji do raka jelita grubego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zapewnione przez grant 0142 VA Merit Review systemu Southern Arizona Veterans Affairs Health Care System oraz grant 0803 Arizona Biomedical Research Commission.

Przygotowanie tkanek do obserwacji na szkiełkach
<ol>
	<li>Kolonoskop można wprowadzić do jelita grubego przez odbyt. Kolonoskop to długa rurka wyposażona w oświetlenie i kamerę wideo na końcówce, funkcję wprowadzania powietrza do jelita grubego w celu jego rozszerzenia (podobnie jak długiego balonu), co umożliwia lepszą wizualizację narządu, oraz kanał dla kleszczyków do biopsji, które mogą wysunąć się poza kamerę wideo, aby odciąć obszar o wielkości 3-5 mm z wewnętrznej powierzchni „skóry”, czyli warstwy śluzowej jelita grubego, w celu pobrania materiału do biopsji. Kleszczyki do biopsji mogą być również wykorzystywane do usuwania polipów w jelicie grubym, które mogą mieć charakter przednowotworowy.</li>
	<li>Za świadomą zgodą pacjentów pobrano biopsje prawidłowych tkanek śluzówki jelita grubego. Pacjenci ci przechodzili kolonoskopię przesiewową w klinice gastroenterologicznej. Pobrane biopsje umieszczono w słoikach z formaliną. Po 4 godzinach formalinę zastąpiono 70% alkoholem.</li>
	<li>Podobne próbki tkanek pobrano z obszarów resekcji jelita grubego, usuniętych podczas operacji, w odległości 1 cm i 10 cm od nowotworów jelita grubego lub gruczolaków z zaawansowaną neoplazją. Próbki te również umieszczono w formalinie; w przypadku dużych próbek niektóre z nich pozostawiono w formalinie na dłuższy czas przed przeniesieniem do 70% alkoholu.</li>
	<li>Próbki tkanek przekazano do laboratorium histopatologicznego w celu przetworzenia i zatopienia w blokach parafinowych.</li>
	<li>Bloki parafinowe schłodzono w lodówce, aby ułatwić ich cięcie za pomocą mikrotomu.</li>
	<li>Z bloków tkankowych, przy użyciu mikrotomu, wycięto skrawki o grubości 4 µm, które następnie wyniesiono na powierzchnię wody.</li>
	<li>W celu porównania ekspresji dwóch białek, na przykład ERCC1 i Pms2, naprzemienne skrawki tkanek można nanosić na dwa szkiełka, aż na każdym z nich znajdą się trzy skrawki. Przykładowo, skrawki 1, 3 i 5 można umieścić na szkiełku opisanym jako ERCC1, a skrawki 2, 4 i 6 na szkiełku opisanym jako Pms2. Posiadanie trzech skrawków tkanek poddanych immunohistochemii w kierunku jednego białka na jednym szkiełku pozwala stwierdzić, czy nietypowy wzór barwienia krypty jest artefaktem, czy zjawiskiem rzeczywistym, ponieważ artefakty nie powtórzyłyby się na więcej niż jednym skrawku na szkiełku. Krypty jelita grubego mają średnicę około 60 µm, co oznacza, że przez jedną kryptę można wyciąć około 15 skrawków tkanki, a tę samą kryptę można obserwować na wielu skrawkach na jednym szkiełku.</li>
</ol>
Immunobarwienie skrawków tkanek
<ol>
	<li>Następnie preparaty poddawane są procedurze znakowania immunohistochemicznego. Jest to standardowa procedura trwająca 8 godzin. Elementami tej procedury, które nie są standardowe, są zastosowanie pojemników Sequenza do barwienia oraz użycie roztworu do redukcji tła o nazwie „Sniper”. Roztwór „Sniper” jest sprzedawany jako formuła zastrzeżona przez firmę Biocare Medical, Concord CA.</li>
	<li>Niektóre etapy naszych procedur przedstawiono tutaj.</li>
	<li>Przykładowo, w przypadku immunohistochemii Pms2, preparaty są najpierw odparafinyzowane poprzez umieszczenie w 3 zmianach ksylenu (po 3 minuty każda), następnie w 2 zmianach 100% etanolu (po 2 minuty każda), po czym w 2 zmianach 95% etanolu (po 2 minuty każda) i w 2 zmianach wody destylowanej (po 2 minuty każda). Procedury te są przeprowadzane pod dygestorium z ujemnym ciśnieniem powietrza, aby badacz nie był narażony na działanie oparów.</li>
	<li>Podczas początkowego utrwalania tkanki w formalinie doszło do powstania wiązań krzyżowych między niektórymi białkami w próbce tkankowej. Obecnie musimy rozerwać te wiązania, aby przeciwciało mogło rozpoznać białko docelowe. Preparaty umieszcza się w roztworze buforowym, który doprowadza się do wrzenia w kuchence mikrofalowej. Następnie ogrzewa się go przez 10 minut na średnim ustawieniu, a potem chłodzi przez 20 minut na lodzie. Krok ten musi zostać przetestowany i dostosowany do konkretnej kuchenki mikrofalowej, aż do uzyskania dobrych wyników. Należy zauważyć, że w przypadku barwienia immunologicznego CcOI lub Ku86 stosowaliśmy bufor cytrynian sodu sporządzony z 9 mL kwasu cytrynowego + 41 mL cytrynianu sodu + 450 mL H2O (bufor zawierający jony sodu) o pH około 6,0; dla ERCC1 stosowaliśmy bufor cytrynianowy sporządzony z 2,1 g kwasu cytrynowego + 1 litr H2O + ok. 5 mL wodorotlenku sodu w celu doprowadzenia pH do 6,1 (bufor z minimalną ilością dodanych jonów sodu), a dla Pms2 stosowaliśmy roztwór sporządzony z 5 mL roztworu do odsłaniania antygenów (firmy VECTOR) + 533 mL H2O. Różne bufory są niezbędne w celu zwiększenia interakcji przeciwciał z konkretnymi epitopami białek. </li>
	<li>Następnie preparaty umieszcza się w 3% nadtlenku wodoru (rozcieńczonego w metanolu) na 20 minut, po czym płucze w wodzie destylowanej przez 3 minuty i przemywa solą fizjologiczną z buforem fosforanowym (zwaną PBS) przez 5 minut.</li>
	<li>Preparaty umieszcza się następnie w płaskich, wąskich statywach do barwienia Sequenza (Shandon Sequenza Immunostaining System firmy Thermo Scientific) i płucze PBS.</li>
	<li>Preparaty barwione immunologicznie pod kątem ERCC1 lub Pms2 poddaje się następnie 10-minutowej ekspozycji na dodatkową obróbkę z użyciem 3 kropli zastrzeżonego roztworu firmy Biocare o nazwie „Sniper”, który służy do redukcji niespecyficznego barwienia białek tła.</li>
	<li>Preparaty płucze się buforem „TBST”, który składa się z 1 ml Tween + 100 ml 10x Tris + 900 ml wody destylowanej [gdzie 10x Tris to 24,2 grama Trizma + 80 gramów NaCl + 1 000 ml wody destylowanej i dejonizowanej + stężony HCl (około 15 ml) w celu doprowadzenia roztworu do pH 7,6].</li>
	<li>Następnie preparaty płucze się trzy razy buforem, a potem dodaje 100 mikrolitrów biotynilowanego przeciwciała wtórnego DAKO w rozcieńczeniu 1:100 (w 2% albuminie surowicy bydlęcej w buforze TBST) i inkubuje przez 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Na tym etapie przygotowuje się odczynnik Vectastain ABC (Avidin Biotin Complex) (firmy Vector Laboratories), używając 2,5 ml PBS i 1 kropli roztworu A oraz 1 kropli roztworu B; roztwór pozostawia się na 30 minut.</li>
	<li>Preparaty płucze się 3 razy buforem TBST.</li>
	<li>Następnie dodaje się 3 krople odczynnika Vectastain ABC i inkubuje preparaty w temperaturze pokojowej przez 30 minut, po czym płucze 2 razy TBST.</li>
	<li>Preparaty zanurza się następnie w DAB (diaminobenzydynie) (2,9 ml DAB + 400 mikrolitrów PBS + 250 mikrolitrów nadtlenku wodoru) na około 5 minut.</li>
	<li>Następnie preparaty płucze się 2 razy wodą destylowaną i dejonizowaną.</li>
	<li>Kontrastowanie wykonuje się za pomocą rozcieńczonego roztworu hematoksyliny przez 10 sekund. Preparaty dokładnie płucze się w wodzie z kranu, a następnie w wodzie dejonizowanej.</li>
	<li>Następnie preparaty odwadnia się 2 razy po 2 minuty w 95% etanolu, 2 razy po 2 minuty w 100% etanolu i 2 razy po 2 minuty w ksylenie.</li>
	<li>Na preparaty nanosi się kilka kropli Cytoseal XYL (Richard-Allan Scientific), a następnie nakłada szkiełko nakrywkowe.</li>
	<li>Ocenę immunohistochemiczną ERCC1, Ku86 i CcOI przeprowadza się zgodnie z tym samym protokołem co dla Pms2, zastępując przeciwciało Pms2 przeciwciałami dla ERCC1, Ku86 i CcOI opisanymi w poniższej tabeli.</li>
</ol>
Ocena przekrojów tkankowych pod kątem krypt z niedoborem ekspresji ERCC1, Pms2, Ku86 oraz CcOI
<ol>
	<li>W pierwszej kolejności zbadamy skrawki tkanek pod fotomikroskopem Motic (DM-BA300) w celu oceny ekspresji Pms2 i ERCC1 w kryptach błony śluzowej okrężnicy.</li>
	<li>Pms2 i ERCC1 są enzymami naprawy DNA, dlatego znajdują się tam, gdzie znajduje się DNA, czyli w jądrach komórek krypt. Jest to zaznaczone na Rysunku 1, gdzie brązowy kolor reprezentujący barwienie na ERCC1 występuje w jądrach komórek w krypcie. Normalna krypta, którą pokazujemy jako pierwszą pod mikroskopem, została zabarwiona na ERCC1, a brązowe zabarwienie wskazuje lokalizację ERCC1. Wskazujemy typy komórek w kryptach, gdzie „komórki kubkowe” mają kształt przypominający kieliszek do wina, z jądrami w niewielkim obszarze u podstawy komórek przy zewnętrznej krawędzi krypty oraz z rozdętą częścią wypełnioną białymi ziarnistościami mucyny w części komórki skierowanej do wnętrza krypty. Dwa pozostałe typy komórek wyglądają w naszych zabarwionych skrawkach dość podobnie – są to enterocyty i komórki enteroendokrynne; ich jądra również znajdują się przy zewnętrznej krawędzi krypty, u podstawy komórek. W biopsjach pobranych od pacjentów, którzy nigdy nie mieli nowotworu okrężnicy, lub w biopsjach pobranych w dużej odległości od miejsca występowania raka jelita grubego, prawie wszystkie jądra we wszystkich kryptach wykazują normalnie wysoki poziom ekspresji ERCC1, jak pokazano tutaj.</li>
	<li>Aby zorientować nasze obserwacje, w skrawkach tkanek uzyskanych z biopsji pacjentów bez nowotworu okrężnicy obserwuje się poziomy ekspresji Pms2, ERCC1, CcOI lub Ku86 w normalnej błonie śluzowej okrężnicy. Możemy obserwować wszystkie krypty w normalnym skrawku tkanki za pomocą obiektywu 40x, powoli przeglądając cały skrawek i wskazując krypty, komórki śródmiąższowe, wszelkie grudki chłonne na preparacie oraz warstwę mięśniową (jeśli występuje w biopsji).</li>
	<li>Wskazujemy również, że u podstawy krypty znajduje się zaledwie kilka komórek, którymi są komórki macierzyste. Te komórki macierzyste generują wszystkie z około 2000 komórek kompletnej krypty. Komórka macierzysta z mutacją lub epimutacją może przejąć całą niszę komórek macierzystych. Wówczas cała krypta może wykazywać zmienione barwienie dla badanego enzymu (konwersja krypty), co pokazujemy na tym nowym preparacie, gdzie widzimy całe krypty z niedoborem CcOI obok krypt o wysokiej ekspresji CcOI.</li>
	<li>Następnie pokazujemy preparat od pacjenta z rakiem jelita grubego lub gruczolakiem z zaawansowaną neoplazją. Na tym preparacie niektóre krypty mają normalny wysoki poziom ekspresji ERCC1, a niektóre niższe poziomy ekspresji. Wszystkie krypty w skrawku tkanki są fotografowane w niskiej rozdzielczości za pomocą obiektywu 10x, a obrazy są łączone w mozaikę tak, aby cały skrawek tkanki był widoczny na jednym zdjęciu. Następnie krypty są numerowane.</li>
	<li>Krypty z wysoką ekspresją enzymu, typową dla krypt w biopsjach oddalonych od nowotworu, określa się jako barwienie poziomu „4”. Pozostałe poziomy to „0”, jeśli ekspresja jest niewykrywalna, „1”, jeśli widoczna jest ekspresja ledwo wykrywalna, „2”, jeśli ekspresja występuje, ale na znacznie niższym poziomie niż poziom 4, oraz „3”, jeśli ekspresja występuje na poziomie niższym niż 4, ale jest dość silna. Na obrazie w niskiej rozdzielczości zaznaczamy każdy preparat kropką: niebieską dla 4, zieloną dla 3, żółtą dla 2, pomarańczową dla 1 i czerwoną dla 0. Tutaj pokazujemy przeglądanie skrawka z biopsji przy użyciu obiektywu 40x. Zaznaczamy krypty kropkami na obrazie w niskiej rozdzielczości.</li>
</ol> 
<img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig1.jpg" alt="Histologia nabłonka gruczołowego; obraz mikroskopowy; struktura komórkowa; analiza tkanki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Krypta okrężnicy wykazująca wysoką ekspresję ERCC1 w jądrach komórek krypty. Wszystkie kolory na tym obrazie zostały w równym stopniu wzmocnione pod względem kontrastu i nasycenia przy użyciu programu Paint Shop Pro 5.
Reprezentatywne wyniki
<ol>
	<li>Naprzemienne przekroje tkanek na oddzielnych szkiełkach pozwalają nam badać te same krypty jelita grubego z ekspresją dwóch różnych białek wykazaną za pomocą immunohistochemii. Obraz jednej krypty barwionej na Pms2 oraz tej samej krypty barwionej na ERCC1 jest prezentowany na sąsiednich mikroskopach z przyległymi monitorami komputerowymi. Pozwala to ustalić, czy występuje wspólny niedobór dwóch białek, czy też niedobory każdego z białek, mimo że oba są częste, występują niezależnie. Na każdym szkiełku mamy trzy przekroje tkanki, dzięki czemu wszelki pozorny niedobór ekspresji białka można zweryfikować, sprawdzając, czy niedobór występuje w więcej niż jednym przekroju i czy nie jest on wynikiem artefaktu. W tkankach otaczających raki jelita grubego, gdzie występuje efekt pola prowadzący do powstania nowotworu, obserwuje się wysoką częstotliwość krypt z niedoborem ERCC1 i Pms2.</li>
	<li>Immunohistochemii użyliśmy również do określenia częstotliwości występowania krypt z niedoborem Ku86 i CcOI. Na tym szkiełku analizujemy cały przekrój tkanki poddany barwieniu immunohistochemicznemu na Ku86 przy użyciu obiektywu 40x i możemy zauważyć, że w tym przekroju tkanki niewiele krypt wykazuje niedobór Ku86.</li>
	<li>Podobnie na tym szkiełku analizujemy cały przekrój tkanki poddany barwieniu immunohistochemicznemu na CcOI przy użyciu obiektywu 40x i widzimy, że jedynie umiarkowana liczba krypt wykazuje niedobór CcOI.</li>
</ol>

<ol><li>Slaughter, D. P., Southwick, H. W., Smejkal, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+cancerization+in+oral+stratified+squamous+epithelium%3B+clinical+implications+of+multicentric+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Field cancerization in oral stratified squamous epithelium; clinical implications of multicentric origin.</a> Cancer. 6, 963-968 (1953).</li>
<li>Vauthey, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Importance+of+field+cancerisation+in+clinical+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Oncol%22%5BJournal%5D)">Importance of field cancerisation in clinical oncology.</a> Lancet Oncol. 1, 15-16 (2000).</li>
<li>Bernstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field+defects+in+progression+to+gastrointestinal+tract+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Field defects in progression to gastrointestinal tract cancers.</a> Cancer Lett. 260, 1-10 (2008).</li>
<li>Calabrese, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colorectal+pretumor+progression+before+and+after+loss+of+DNA+mismatch+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Colorectal pretumor progression before and after loss of DNA mismatch repair.</a> Am J Pathol. 164, 1447-1453 (2004).</li>
<li>Bernstein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+Pms2+expression+in+non-neoplastic+flat+mucosa+from+patients+with+colon+cancer+correlates+with+reduced+apoptosis+competence%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Immunohistochem+Mol+Morphol%22%5BJournal%5D)">Reduced Pms2 expression in non-neoplastic flat mucosa from patients with colon cancer correlates with reduced apoptosis competence.</a> Appl Immunohistochem Mol Morphol. 14, 166-172 (2006).</li>
<li>Huang, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase+1+is+a+marker+for+normal+and+malignant+human+colonic+stem+cells+%28SC%29+and+tracks+SC+overpopulation+during+colon+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase 1 is a marker for normal and malignant human colonic stem cells (SC) and tracks SC overpopulation during colon tumorigenesis.</a> Cancer Res. 69, 3382-3389 (2009).</li>
<li>Kim, K. M., Shibata, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation+reveals+a+niche%3A+stem+cell+succession+in+human+colon+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Methylation reveals a niche: stem cell succession in human colon crypts.</a> Oncogene. 21, 5441-5449 (2002).</li>
<li>Greaves, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+DNA+mutations+are+established+in+human+colonic+stem+cells%2C+and+mutated+clones+expand+by+crypt+fission%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial DNA mutations are established in human colonic stem cells, and mutated clones expand by crypt fission.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103, 714-719 (2006).</li>
<li>Nara, K., Nagashima, F., Yasui, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+elevated+ultraviolet-induced+mutation+frequency+in+isolated+Chinese+hamster+cell+lines+defective+in+nucleotide+excision+repair+and+mismatch+repair+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Highly elevated ultraviolet-induced mutation frequency in isolated Chinese hamster cell lines defective in nucleotide excision repair and mismatch repair proteins.</a> Cancer Res. 61, 50-52 (2001).</li>
<li>Payne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deoxycholate+induces+mitochondrial+oxidative+stress+and+activates+NF-kB+through+multiple+mechanisms+in+HCT-116+colon+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Deoxycholate induces mitochondrial oxidative stress and activates NF-kB through multiple mechanisms in HCT-116 colon epithelial cells.</a> Carcinogenesis. 28, 215-222 (2007).</li>
<li>Lim, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+changes+induced+by+reactive+oxygen+species+in+hepatocellular+carcinoma%3A+methylation+of+the+E-cadherin+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Epigenetic changes induced by reactive oxygen species in hepatocellular carcinoma: methylation of the E-cadherin promoter.</a> Gastroenterology. 135, 2128-2140 (2008).</li>
<li>Bernstein, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bile+acids+as+carcinogens+in+human+gastrointestinal+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Bile acids as carcinogens in human gastrointestinal cancers.</a> Mutat Res. 589, 47-65 (2005).</li>
<li>Payne, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hydrophobic+bile+acids%2C+genomic+instability%2C+Darwinian+selection%2C+and+colon+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">hydrophobic bile acids, genomic instability, Darwinian selection, and colon carcinogenesis.</a> Clinical and Experimental Gastroenterology. 1, 19-47 (2008).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bardzo ważne jest umieszczenie 3 przekrojów tkanki na jednym szkiełku. Podczas nakładania medium zawierającego przeciwciało mogą powstawać pęcherzyki powietrza, przez co niektóre krypty lub ich fragmenty mogą nie zostać odpowiednio zabarwione tylko dlatego, że pęcherzyk uniemożliwił reakcję przeciwciała z przekrojem tkanki. Krypty mają średnicę około 60 µm, a przekroje tkanki mają grubość 4 µm, zatem przez tę samą kryptę może przechodzić nawet 15 przekrojów tkanki. Zazwyczaj możliwe jest odnalezienie tej samej krypty na wielu przekrojach tkanki umieszczonych na szkiełku, kierując się morfologią krypty.</li>
	<li>W naszych ostatnich badaniach, w przypadku dużych próbek tkanki, barwienie w systemie Sequenza może nie zapewniać odpowiedniego pokrycia tkanki przeciwciałem. W takich przypadkach można preferować ręczne barwienie tkanki, polegające na ręcznym naniesieniu kropli medium zawierającego przeciwciało na każdą próbkę tkanki.</li>
	<li>Aby wyraźnie widzieć brązowe zabarwienie wskazujące ekspresję białka poddanego immunobarwieniu oraz niebieskie zabarwienie wskazujące nuklearne DNA na monitorze komputera, oprogramowanie fotomikroskopu Motic jest konfigurowane w następujący sposób: Gain 0, Offset 0, Enhance 0, 255, Gamma 1.00, 0, Sharpness 1, Color Correction 7, R, G, B Gain 1.00 oraz R, G, B Brightness 0. Rozdzielczość jest ustawiona na 1024 x 768, a funkcja White Balance jest włączona.</li>
	<li>Nasza metoda może być stosowana w przypadku dowolnych białek uznanych za istotne w progresji raka jelita grubego, aby ocenić częstotliwość ich niedoboru lub ewentualnie nadekspresji w defektach pola otaczających raki jelita grubego lub gruczolaki z zaawansowaną neoplazją. </li>
	<li>Defekty pola są częścią progresji do nowotworu Termin „kancleryzacja pola” (field cancerization) został po raz pierwszy użyty przez Slaughter et al. w 1953 roku1 w celu opisania obszaru lub „pola” nabłonka, który został poddany wstępnemu uwarunkowaniu przez w dużej mierze nieznane (wówczas) procesy, co predysponuje go do rozwoju nowotworu. Pierwotnie termin ten stosowano w kontekście raków jamy ustnej. Od tego czasu terminy „kancleryzacja pola” i „defekt pola” są używane szerzej do opisania każdej tkanki przednowotworowej, w której nowotwory powstają z większym prawdopodobieństwem, a koncepcja kancleryzacji pola w onkologii klinicznej zyskuje coraz większą uwagę2. Niedawno przeanalizowaliśmy dowody na występowanie defektów pola w raku przewodu pokarmowego3. W przeglądzie tym zawarto wyniki kilkunastu badań dostarczających dowodów na występowanie defektów pola w jelicie grubym. Defekty pola w błonie śluzowej jelita grubego powstają prawdopodobnie w wyniku doboru naturalnego komórek zmutowanych lub komórek zmienionych epigenetycznie wśród komórek macierzystych krypty, tak że jedna komórka macierzysta przeżywa sukcesję niszy4. Niestabilność genetyczna lub fenotyp mutatora, być może wynikający z ograniczenia naprawy przez wycinanie nukleotydów DNA lub naprawy niedopasowań DNA, przyspieszałaby ten proces (wcześniej zgłoszono częsty defekt Pms2 w obszarach otaczających raki jelita grubego5). Jeśli w normalnej populacji komórek macierzystych błony śluzowej jelita grubego komórka uzyska przewagę selekcyjną poprzez mutację lub epimutację, będzie miała tendencję do ekspansji klonalnej kosztem sąsiednich komórek macierzystych. W błonie śluzowej jelita grubego nisza komórki macierzystej jest zajmowana przez ≤5 komórek6, które następnie dają początek wszystkim (około 2000) komórkom krypty. Przejęcie niszy komórki macierzystej przez zmutowany lub epigenetycznie zmieniony typ komórek prowadzi do „konwersji krypty”7. Rozprzestrzenianie się zmutowanych klonów (skonwertowanych krypt) w nabłonku jelita grubego najczęściej zachodzi poprzez podział krypty (crypt fission)8. Przykład podziału krypty przedstawiono na rysunku 2. W ten sposób powstaje obszar tkanki abnormalnej. W obrębie takiego obszaru może wystąpić druga taka mutacja, w wyniku której dana krypta zyskuje przewagę nad innymi kryptami w tym obszarze, a krypta ta będzie rozszerzać się klonalnie, tworząc wtórny obszar w obrębie pierwotnego. W tym nowym obszarze proces ten może powtórzyć się jeszcze kilka razy, być może na przestrzeni dziesięcioleci, aż pojawi się złośliwa komórka macierzysta, która rozrośnie się klonalnie w nowotwór. Jeśli jest to ogólny proces powstawania sporadycznych gruczolaków jelita grubego, to gruczolaki te powinny być zazwyczaj powiązane z polami abnormalności i być przez nie poprzedzone. Zatem można oczekiwać, że obszar skonwertowanych krypt będzie wykazywał wykrywalne defekty w okolicy otaczającej gruczolaka z zaawansowaną neoplazją lub okolicy otaczającej raka jelita grubego. Z tego modelu progresji przednowotworowej można by oczekiwać znalezienia zmian genetycznych lub epigenetycznych związanych z progresją przednowotworową w próbkach tkanki pobranych z nieżełuzkowej błony śluzowej jelita grubego w obszarach otaczających zmiany nowotworowe jelita grubego, które mogą przejść w raka. W szczególności defekty w enzymach naprawy DNA lub w białkach niezbędnych do apoptozy przyczyniałyby się do progresji poprzez zwiększenie niestabilności genomowej i można by się spodziewać ich obecności w defektywnym polu.</li>
	<li>Selekcja w kierunku niedoboru Pms2, gdy komórki wykazują niedobór ERCC1 i są poddane działaniu czynnika uszkadzającego DNA Nara et al.9 hodowali 25 kultur komórek jajnika chomika chińskiego 43-3B, wszystkie z mutacją inaktywującą gen naprawy DNA ERCC1, i traktowali kultury czynnikiem uszkadzającym DNA, MNNG. spośród komórek, które przeżyły traktowanie uszkadzające DNA, z każdej kultury wyizolowano jedną komórkę i pozwolono jej utworzyć klon. Wszystkie wyizolowane klony były około 10-krotnie bardziej odporne na zabijanie przez MNNG niż szczep rodzicielski. Wykazano, że 22 z wyizolowanych klonów posiada defekt naprawy niedopasowań DNA (MMR). Pięć z tych 22 klonów przebadano metodą sekwencjonowania, a trzy z pięciu wykazały niedobór Pms2. Ta selekcja w kierunku defektu Pms2 wynikała prawdopodobnie z tego, że niedobór Pms2 powodował oporność na apoptozę, a tym samym zdolność do przeżycia dodatkowego uszkodzenia DNA pozostającego w komórkach przy braku ERCC1. (Normalnie Pms2 wykrywa poziom uszkodzeń DNA i powoduje apoptozę komórek, gdy uszkodzenia DNA są nadmierne). Zatem niedobór Pms2 jest selekcjonowany, gdy komórki z niedoborem ERCC1 są poddane działaniu czynników uszkadzających DNA. Wykazano, że klony z defektem zarówno ERCC1, jak i Pms2 mają około 500 do 1000-krotnie wyższą stopę mutacji po naświetlaniu UV niż komórki rodzicielskie. </li>
	<li>Kwasy żółciowe powodują stres oksydacyjny, są czynnikami uszkadzającymi DNA i są istotne w progresji raka jelita grubego Kwas deoksycholowy, kwas żółciowy, zwiększa stres oksydacyjny poprzez generowanie reaktywnych form tlenu (ROS) za pomocą wielu procesów, w tym uszkadzania mitochondriów10. Istnieją niedawne dowody na to, że ROS powodują zmiany epigenetyczne11, a co najmniej 15 badań wykazało, że kwasy żółciowe, w zwiększonych stężeniach towarzyszących diecie bogatej w tłuszcze, powodują uszkodzenia DNA12. Jak wskazali w przeglądzie Bernstein et al.12, istnieje pozytywna korelacja między spożyciem tłuszczów w diecie a zapadalnością na raka jelita grubego. Kwasy żółciowe są wydzielane do przewodu pokarmowego w odpowiedzi na tłuszcze w diecie i działają jako detergenty pomagające w trawieniu tłuszczów. Zatem dieta bogata w tłuszcze wiąże się ze zwiększonym wydzielaniem kwasów żółciowych. Stężenia kwasów żółciowych w kale są podwyższone w populacjach o wysokiej zapadalności na raka jelita grubego, a nadmierna ekspozycja na kwasy żółciowe jest uważana za główny czynnik ryzyka kancerogenezy jelita grubego13. Kwasy żółciowe mogą być przyczyną defektów pola w jelicie grubym.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1931/1931fig2.jpg" alt="Mikroskopia tkanki jelita; barwiona próbka histologiczna; szczegół struktury komórkowej; badanie patologiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Krypta okrężnicy dzieląca się na 3 krypty.
Podsumowanie
Stwierdzono wysoką częstotliwość występowania krypt z niedoborem genów naprawy DNA ERCC1 i Pms2 (Pms2 jest również niezbędny do apoptozy) w rozległych zmianach polowych otaczających raki jelita grubego. Niedobory ERCC1 i Pms2 (wynikające ze zmian epigenetycznych lub mutacji) mogą być wczesnymi etapami niestabilności genetycznej, która odgrywa centralną rolę w progresji do raka jelita grubego.

<table><tbody><tr><td>przeciwciało PMS2</td><td>BD Biosciences</td><td>556415</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało ERCC1</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>MS-671-P1</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało Ku86</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>SC-9034</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało CcO1</td><td>Invitrogen</td><td>459600</td><td></td></tr><tr><td>biotynilowane przeciwciało wtórne</td><td>Dako</td><td>E0413</td><td></td></tr><tr><td>22% BSA</td><td>Informagen, Inc.</td><td>2327</td><td></td></tr><tr><td>Sniper</td><td>Biocare Medical</td><td>BS966</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain ABC</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>DAB</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>34001</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>USB Corp., Affymetrix</td><td>20605</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal XYL</td><td>VWR international</td><td>48212-196</td><td></td></tr><tr><td>Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr></tbody></table>

niedobory pms2, ercc1, ku86, ccoi w defektach polowych podczas progresji do raka jelita grubego

Deficient Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI in Field Defects During Progression to Colon Cancer

W procesie kancerogenezy „defekt pola” (ang. field defect) rozpoznaje się klinicznie ze względu na wysoką skłonność osób, które przeżyły niektóre nowotwory, do rozwoju innych zmian nowotworowych w obrębie tego samego typu tkanki, często w sąsiedniej lokalizacji. Takie defekty pola stwierdzono w raku jelita grubego. Nieprawidłowości molekularne odpowiedzialne za defekt pola w jelicie grubym powinny być wykrywalne z wysoką częstotliwością w histologicznie prawidłowej tkance otaczającej gruczolakoraka jelita grubego lub gruczolaka z zaawansowaną neoplazją (znajdującego się na etapie rozwoju w kierunku raka jelita grubego), natomiast z niską częstotliwością w błonie śluzowej jelita grubego u pacjentów bez neoplazji jelita grubego.
Z zastosowaniem immunohistochemii wykazano, że w całych kryptach w obrębie 10 cm po każdej stronie gruczolaków okrężnicy lub zaawansowanych nowotworów okrężnicy często stwierdzano obniżoną lub nieobecną ekspresję dwóch białek naprawy DNA: Pms2 i/lub ERCC1. Pms2 jest białkiem o podwójnej roli, aktywnym w naprawie niedopasowań DNA, a także niezbędnym w apoptozie komórek z nadmiernymi uszkodzeniami DNA. ERCC1 bierze udział w naprawie przez wycinanie nukleotydów DNA. Obniżona lub nieobecna ekspresja zarówno ERCC1, jak i Pms2 prowadziłaby do powstania komórek o zwiększonej zdolności do przeżycia (oporność na apoptozę) oraz zwiększonym poziomie zmienności mutacyjnej. Obniżona lub nieobecna ekspresja obu białek, ERCC1 i Pms2, jest prawdopodobnie wczesnym etapem progresji do raka jelita grubego.
Doniesiono, że ekspresja genu naprawy DNA Ku86 (aktywnego w niehomologicznym łączeniu końców DNA) oraz oksydazy cytochromowej c podjednostki I (zaangażowanej w apoptozę) ulega obniżeniu w obszarach śluzówki położonych blisko nowotworów jelita grubego. Jednak ocena immunohistochemiczna poziomów ich ekspresji wykazała jedynie niską lub umiarkowaną częstość występowania krypt z niedoborem tej ekspresji w obrębie defektu polowego otaczającego raka jelita grubego lub zaawansowaną neoplazję jelita grubego.
Przedstawiamy tutaj naszą metodę oceny krypt pod kątem ekspresji ERCC1, Pms2, Ku86 oraz CcOI. Wykazujemy, że częstotliwość występowania całych krypt z niedoborem Pms2 i ERCC1 często wynosi od 70% do 95% w obszarach o długości 20 cm otaczających nowotwór okrężnicy, podczas gdy częstotliwość krypt z niedoborem Ku86 ma wartość mediany 2%, a częstotliwość krypt z niedoborem CcOI ma wartość mediany 16% w tych obszarach. Cały okrężnica ma 150 cm długości (około 5 stóp) i posiada około 10 milionów krypt w warstwie śluzowej. Defekt Pms2 i ERCC1 w otoczeniu raka jelita grubego może zatem obejmować 1 milion krypt. To właśnie z wadliwej krypty powstaje rak jelita grubego.

Zredukowana lub brakująca ekspresja Pms2 i/lub ERCC1 w całych kryptach jest częstym zjawiskiem w obszarze 10 cm po każdej stronie gruczolaków okrężnicy, co prawdopodobnie stanowi podstawę defektu pola o wysokiej zmienności i progresji do nowotworu. Niedobór Ku86 lub CcOI jest znacznie rzadszy w tych defektach pola.

Niedobory Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI w defektach polowych podczas progresji do raka jelita grubego

W procesie kancerogenezy „defekt pola” jest rozpoznawany klinicznie ze względu na wysoką skłonność osób, które przeżyły niektóre nowotwory, do rozwoju innych...

deficient-pms2-ercc1-ku86-ccoi-field-defects-during-progression-to

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Niedobór Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI w defekcie pola podczas progresji do raka jelita grubego

Opisana jest prosta metoda ustalania pierwotnego organoidu guza jelita grubego u myszy. Metoda ta wykorzystuje tę cechę, że komórki nowotworowe jelita grubego przeżywają i rosną w organoidy w pożywkach zawierających ograniczone czynniki wzrostu, podczas gdy normalny nabłonek okrężnicy nie.

Metody in vitro Hodowla organoidowa pierwotnych guzów jelita grubego myszy

Zgłaszamy znaczące ulepszenia w zakresie powtarzalnego pomiaru mutacji somatycznych komórek macierzystych okrężnicy po ekspozycji myszy na potencjalne czynniki uszkadzające DNA.

Kwantyfikacja mutacji komórek macierzystych okrężnicy

Przedstawiono protokół tworzenia genetycznie modyfikowanego mysiego modelu raka jelita grubego poprzez segmentowe zakażenie adeno-cre i jego nadzorowanie za pomocą kolonoskopii o wysokiej rozdzielczości.

Genetycznie zmodyfikowany mysi model sporadycznego raka jelita grubego

Prezentowany zestaw diagnostyczny FL-DNA to oszczędzająca czas i przyjazna dla użytkownika metoda określania wiarygodnego prawdopodobieństwa wystąpienia zmian rakowych jelita grubego.

Ocena ryzyka i rozpowszechnienia raka jelita grubego za pomocą wykrywania integralności DNA kału

Ten protokół przedstawia nowatorski, solidny i powtarzalny system hodowli do generowania i hodowania trójwymiarowych sferoidów z komórek gruczolakoraka jelita grubego Caco2. Wyniki stanowią pierwszy dowód na słuszność koncepcji tego podejścia do badania biologii nowotworowych komórek macierzystych, w tym odpowiedzi na chemioterapię.

Trójwymiarowy model sferoid do badania komórek macierzystych raka jelita grubego

Badanie wykazało, że płeć męska, słaby stopień nowotworu i zaawansowany stopień przerzutów do węzłów nowotworowych były związane z gorszym przeżyciem specyficznym dla raka (CSS) u pacjentów z mnogim pierwotnym rakiem jelita grubego (MPCC) po operacji. Opracowaliśmy nomogram, aby przewidzieć CSS pacjentów z MPCC i przyczynić się do podejmowania decyzji dotyczących leczenia klinicznego.

Nomogram ryzyka konkurencyjnego do przewidywania przeżycia specyficznego dla raka u pacjentów z wieloma pierwotnymi rakami jelita grubego po operacji

Celem prezentacji jest zademonstrowanie wysoce powtarzalnej metody generowania implantów komórek macierzystych związanych z macierzą w ubytkach chrząstki, które można wizualizować za pomocą obrazowania MR. Komórki macierzyste są znakowane zatwierdzonymi przez FDA ferumoksydami, mieszane z agarozą, implantowane w ubytkach chrząstki i obrazowane za pomocą skanera MR 7T.

Implantacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych znakowanych ferumoksydami w ubytkach chrząstki

Niniejszy protokół umożliwia badaczom zajmującym się naukami o sporcie i wysiłku fizycznym określenie względnego udziału trzech różnych systemów energetycznych w całkowitym wydatku energetycznym podczas szerokiej gamy ćwiczeń.

Wyznaczanie udziału systemów energetycznych podczas wysiłku fizycznego

Analiza specyficzna dla tkanki w modelu regeneracji mieszka włosowego z wykorzystaniem lentiwirusów do mediacji funkcji wzmocnionej (gain-of-function) lub utraconej (loss-of-function).

Szybka analiza genetyczna sygnalizacji nabłonkowo-mezenchymalnej podczas regeneracji włosa

Tutaj opisujemy skuteczną metodę badania dynamiki apoptotycznego oczyszczania komórek in vivo. Metoda ta wykorzystuje żywe zarodki Drosophila jako potężny model do monitorowania fagocytozy komórek apoptotycznych przy użyciu specyficznego znakowania komórek apoptotycznych i fagocytów.

Obrazowanie na żywo apoptotycznego usuwania komórek podczas embriogenezy Drosophila

Poznaj metodę immunobarwienia tkanek jelita grubego w celu oceny ekspresji białek naprawy DNA Pms2 i ERCC1. Technika ta pozwala identyfikować defekty terenowe wskazujące na ryzyko progresji do raka jelita grubego.

Niedobory Pms2, ERCC1, Ku86, CcOI w defektach polowych podczas progresji do raka jelita grubego

Przeglądaj więcej filmów