Name: Oznaczanie tkanek za pomocą testu przeszczepu czapeczki zwierzęcej (ACT) u Xenopus laevis (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Poznaj metodę oznaczania tkanek za pomocą testu przeszczepu czapeczki zwierzęcej u Xenopus laevis. Technika ta pozwala badać determinację losu komórek w biologii rozwoju.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana przez granty z Research to Prevent Blindness (stypendia Career Development Awards dla MEZ i ASV oraz bezzobowiązujący grant dla Department of Ophthalmology), fundacji E. Matilda Zeigler Foundation (MEZ i ASV) oraz National Eye Institute/NIH (MEZ, granty R01EY015748 i R01EY017964).

Część I. Przygotowanie do testu ACT
<ol>
	<li>Przygotuj cappingowane RNA do iniekcji zgodnie z zaleceniami producenta, stosując jego metodę oczyszczania fenol:chloroform (np. zestaw mMessage mMachine; Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX). Jako marker wykorzystuje się RNA kodujące białko fluorescencyjne. Przeprowadzamy transkrypcję cDNA dla żółtego białka fluorescencyjnego (YFP) lub mCherry 5, znajdującego się w wektorze ekspresyjnym pCS2+.</li>
	<li>Wyciągnij kapilary szklane borokrzemianowe w celu utworzenia zwężonych końcówek szklanych za pomocą wyciągarki do mikropipet. Używamy wyciągarki Sutter Micropipette Puller, P-97 (Sutter Instruments, Inc., Novato, CA), zgodnie z wcześniejszym opisem 6.</li>
	<li>Przygotuj sterylne roztwory wymienione w Tabeli 1 z roztworu zapasowego 10 X Marc's Modified Ringer's (MMR) (10 mM MgCl2; 20 mM KCl; 20 mM CaCl2; 50 mM HEPES; 1 M NaCl; pH dostosowane do 7,5, autoklawowane i przechowywane w RT).</li>
	<li>Wyizoluj jądra z samca żaby i przechowuj tkankę w temperaturze 4°C w sterylnym roztworze 1X MMR/gentamycyna (50 μg/mL siarczanu gentamycyny; BioWhittaker, Kat # 17-518Z). Można to zrobić do tygodnia przed rozpoczęciem eksperymentu, jednak tkanka z czasem traci swoją skuteczność.</li>
	<li>Roztwór do składania jaj (1X: 150 mM NaCl, 2,62 mM KCl, 0,8 mM Na2HPO4, 20 mM Trizma base, 2,62 mM NaHCO3 oraz 2,75 mM MgSO4; pH dostosowane do 7,6) można przygotować jako stężenie zapasowe 8X, które można przechowywać w temperaturze 4°C do dwóch tygodni. Uwaga: należy uważać na zanieczyszczenia tego roztworu, ponieważ wpłyną one na jakość jaj.</li>
	<li>Przygotuj płytki do iniekcji. W tym celu rozpuść 1% agarozę w 0,4X MMR w kuchence mikrofalowej, wlej ok. 6 mL roztopionego roztworu agarozy do płytek 60 mm, ostrożnie rozwiń formę elastomerową (Rysunek 1) na powierzchni roztworu, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, i pozostaw do ostygnięcia na około 20 minut w RT. Aby określić wymaganą liczbę płytek, weź pod uwagę liczbę warunków eksperymentalnych (np. 1, YFP; 2, YFP+Noggin) oraz liczbę potrzebnych zarodków gospodarzy po transplantacji. W naszych eksperymentach przygotowujemy co najmniej 20 zarodków gospodarzy po transplantacji dla każdego warunku eksperymentalnego. W temperaturze 18-19°C zarodki pozostają w stadium 15 przez około godzinę. Jeśli wykonanie 20 transplantacji zajmuje jedną godzinę, konieczne są dwa punkty czasowe zapłodnienia, zakładając, że zarodki gospodarze przyjmą wszystkie transplantaty. W związku z tym potrzebne będą cztery płytki do iniekcji (2 warunki exp x 2 punkty czasowe zapłodnienia = 4). Płytki należy przechowywać w temperaturze 4°C do jednego tygodnia.</li>
	<li>Przygotuj płytki do izolacji czapeczek, używając 1% agarozy + 0,7X MMR z formami, tak jak w przypadku płytek do iniekcji. Przygotuj taką samą liczbę płytek do izolacji czapeczek jak płytek do iniekcji, plus jedną dodatkową na każdy punkt czasowy zapłodnienia (4 + 2 punkty czasowe zapłodnienia = 6).</li>
	<li>Wstrzyknij samicom 500 jednostek ludzkiej gonadotropiny kosmówkowej późno w dniu poprzedzającym mikroiniekcję. Samice przechowuj przez noc w temperaturze 16-18°C.</li>
</ol>
Część II. Mikroiniekcja RNA do zarodków Xenopus laevis
A. Przygotowanie do mikroiniekcji
<ol>
	<li>Wyjąć indukowane hormonalnie samice i umieścić je w oddzielnych zbiornikach zawierających 1X roztwór do składania jaj (ELS). Uwaga: nie używamy jaj, które znajdowały się w ELS dłużej niż dwie godziny, ponieważ ich jakość spada. Dlatego około godziny przed zapłodnieniem in vitro usuwamy wszystkie jaja ze zbiornika, aby zbierać tylko świeżo złożone jaja.</li>
	<li>Przygotować igłę do mikroiniekcji, odcinając końcówkę tak, aby uzyskać średnicę 25-35 μm. Umieścić igłę w pikoinkektorze i skalibrować go tak, aby dozował 10 nL na jedną iniekcję.</li>
	<li>Ustawić inkubator na 14°C.</li>
	<li>Gdy samice będą składać jaja przez około godzinę, zebrać jaja ze zbiornika za pomocą pipety transferowej i umieścić je w szalkach Petriego o średnicy 60 mm. Usunąć z jaj jak najwięcej ELS i zastąpić go 1X MMR. Jaja można zapłodnić natychmiast lub pozostawić w 1X MMR do godziny. W przypadku testu transplantacyjnego najlepiej zapłodnić dwie szalki, wypełnione w 80% pojedynczą warstwą jaj, w maksymalnie trzech oddzielnych partiach około godziny 11:00, 12:00 i 13:00. Po iniekcji zostaną one umieszczone w temperaturze 14°C, aby rozwinęły się do etapów wymaganych do izolacji czapeczki (stadium 8.5-9) i transplantacji (stadium 15; patrz Część I, pkt 6 powyżej).</li>
	<li>Aby sprawdzić jakość jąder, przeprowadzamy zapłodnienie wczesnym rankiem (~8:00), co pozwala nam na pobranie jąder od innego samca, jeśli plemniki z pierwszego nie są żywotne. Uwaga: homogenizujemy ~0,25 jaja w 1 mL 1X MMR i dodajemy około 5 do 7 kropli na płytkę z oocytami.</li>
	<li>Zapłodnić jaja in vitro za pomocą homogenizowanych jąder, a godzinę później usunąć otoczkę galaretową z jaj, używając roztworu do usuwania galaretki (164μl 1M DTT + 10mL 1M Tris, pH 8.8 do objętości 50 mL autoklawowanej wody nanopure). Odczekać, aż osiągną stadium dwukomórkowe, aby rozpocząć sortowanie, co zajmuje około 2 godzin w 18°C lub 1,5 godziny w temperaturze pokojowej (22°C).</li>
	<li>Za pomocą pipety transferowej wyselekcjonować embriony o jednolitym zabarwieniu i równomiernym podziale, jak pokazano na lewej czapeczce zwierzęcej na Rycini 3, do dołka naczynia do iniekcji wypełnionego 0,4X MMR + 6% Ficoll.</li>
</ol>
B. Mikroiniekcja
<ol>
	<li>Naciągnij Parafilm na pokrywę szalki Petriego o średnicy 60 mm. Nanieś pipetą 2 μl pierwszej próbki RNA na Parafilm i wciągnij ją za pomocą PLI-100, aby napełnić igłę do iniekcji. Przed rozpoczęciem iniekcji upewnij się, że igła nadal dozuje 10 nL próbki.</li>
	<li>W jednej szalce wykonaj iniekcję 20-30 embrionów w stadium dwóch komórek (do obu blastomerów) z 500 pg RNA YFP, a w drugiej szalce iniekcję genu zainteresowania (np. 20 pg RNA Noggin) wraz z RNA YFP 7.</li>
	<li>Umieść 100-200 nieiniekcyjnych embrionów na każdy punkt czasowy w kolejnej szalce do iniekcji z roztworem Ficoll. Przenosić je do inkubatora i z niego w tym samym czasie co embriony iniekcyjne. Będą one służyć jako biorcy w Części IV.</li>
	<li>Po iniekcji inkubuj wszystkie embriony w temperaturze 14°C przez noc. Powtórz procedurę dla wszystkich punktów czasowych.</li>
</ol>
Część III. Izolacja czapeczek zwierzęcych z wstrzykniętych embrionów
<ol>
	<li>Przybyć wcześnie rano w celu określenia stadium rozwoju embrionów. Najwcześniejszy punkt czasowy powinien odpowiadać stadium 9. Usunąć embriony, które nie przeżyły. Postępować zgodnie z poniższymi krokami, pracując z każdym punktem czasowym w partiach.</li>
	<li>Odlać roztwór Ficollu z każdej płytki i ponownie dodać roztwór 0.7X MMR/gentamycyna. Do naczynia do izolacji czapeczek dodać obfitą ilość roztworu 0.7X MMR/gentamycyna. Wyjąć embriony z dołków naczynia do iniekcji za pomocą pipety transferowej i umieścić je w świeżo przygotowanym naczyniu do izolacji czapeczek.</li>
	<li>Wyizolować czapeczki zwierzęce w roztworze 0.7X MMR + gentamycyna, zachowując 2 lub 3 nienaruszone embriony do określenia stadium rozwoju. Można użyć narzędzia Gastromaster z żółtą końcówką zagiętą do 400 μm lub pary ostrych pęset nr 5.</li>
	<li>Umieścić czapeczki z powrotem w inkubatorze w temperaturze 14°C do następnego dnia. Embriony gospodarza należy wyjąć z inkubatora w tym samym czasie co czapeczki, aby utrzymać je w tym samym stadium rozwoju co tkanka donora.</li>
</ol>
Część IV. Transplantacja kapsułek na bok ciała
<ol>
	<li>Wyjmij czapy i embriony z pierwszego punktu czasowego z inkubatora 14°C i określ stadium rozwoju embrionów. Wyselekcjonuj jednorodne czapy wykazujące pozytywną fluorescencję żółtą lub czerwoną, w zależności od wstrzykniętego znacznika (Rycina 2).</li>
	<li>Policz liczbę czap i przenieś dwukrotną liczbę embrionów w stadium 12-13 do świeżo przygotowanej szalki do iniekcji z roztworem 0.7X MMR/gentamycyną. Za pomocą ostrych pęsety #5 usuń błonę witelinową z każdego z nich. Przenieś je na płytkę z czapami, zachowując ostrożność. Bez błon witelinowych embriony mogą szybko ulec dysocjacji na powierzchni wody.</li>
	<li>Używając gastromastera (żółta końcówka, wygięty drut 200-250μm, najwyższe ustawienie) lub pęsety #5, usuń kwadrat o boku 200 μm z boku embrionu w stadium 14-15 (Rycina 3). Następnie przetnij czapę na pół (za pomocą gastromastera lub pęsety #5) i umieść tkankę w otworze wykonanym w embrionie biorcy. Obróć embrion o ściankę dołka, aby umożliwić gojenie. Wykonaj tę czynność dla jak największej liczby embrionów, dopóki znajdują się one w stadium 15. Powtórz procedurę dla wszystkich punktów czasowych.</li>
	<li>Embrion zazwyczaj goi się w ciągu 30 minut. Usuń martwe komórki (białe), wykonując delikatny ruch zamiatania pęsetą #5. Inkubuj je w temperaturze 18°C przez noc.</li>
	<li>Pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym wyselekcjonuj embriony z oznakowaną fluorescencyjnie, przeszczepioną tkanką. Umieść je ponownie w temperaturze 18°C i hoduj do stadium 42-43.</li>
	<li>Zanurz zwierzęta w roztworze trikainy w celu znieczulenia. Na tym etapie można wykonać zdjęcia pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym. Po zakończeniu utrwal, wykonaj przekroje i przeprowadź immunostening lub hybrydyzację in situ z użyciem markerów dla badanej tkanki.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig1.jpg" alt="Schemat multipleksowej macierzy z siatką 8x12, stosowanej do wysokoprzepustowej analizy DNA lub białek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Projekt elementu z pleksiglasu do odlewania formy elastomerowej używanej do wytwarzania naczyń do utrzymywania embrionów. W kawałku pleksiglasu o wymiarach 50 x 50 mm i grubości 25 mm wyfrezowano kwadrat z zaokrąglonymi rogami o wymiarach 38 x 38 mm (głębokość ok. 5 mm). W plastiku wywiercono okrągłe, równomiernie rozmieszczone otwory (średnica 1,5 mm) o głębokości 1 mm. Aby wykonać formę elastomerową do naczyń do mikroiniekcji, wlano elastomer Sylgard do pleksiglasu i pozostawiono go do utwardzenia zgodnie z instrukcjami producenta. Ta forma elastomerowa jest wykorzystywana do produkcji płytek do iniekcji i izolacji zakrętki.
<img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig2.jpg" alt="Jasne pole, fluorescencja mCherry, nałożenie; obraz mikroskopowy procesu obserwacji komórek." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Sortowanie czapeczek zwierzęcych przed transplantacją jest istotne, ponieważ ekspresja może być zróżnicowana.Czapeczka zwierzęca po lewej wykazuje równomierną ekspresję mCherry w całej tkance, natomiast eksplant po prawej wykazuje ekspresję punktową i zostanie odrzucony.
<img src="/files/ftp_upload/1932/1932fig3.jpg" alt="Badanie systemu linii bocznej ryb; obraz mikroskopowy; szczegół narządu zmysłowego; badania biologiczne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. U kijanki gospodarza rozwinęła się struktura przypominająca oko na boku ciała z przeszczepionych komórek czapki zwierzęcej. Obraz fluorescencyjny został nałożony na obraz w świetle przechodzącym.

<ol><li>Smith, W. C., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+cloning+of+noggin%2C+a+new+dorsalizing+factor+localized+to+the+Spemann+organizer+in+Xenopus+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Expression cloning of noggin, a new dorsalizing factor localized to the Spemann organizer in Xenopus embryos.</a> Cell. 70, 829-840 (1992).</li>
<li>Lamb, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+induction+by+the+secreted+polypeptide+noggin%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neural induction by the secreted polypeptide noggin.</a> Science. 262, 713-718 (1993).</li>
<li>Green, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Methods+in+Developmental+Biology%3A+Xenopus+%26+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular Methods in Developmental Biology: Xenopus & Zebrafish.</a> Methods in Developmental Biology. , Humana Press. Towata, N.J. (1999).</li>
<li>Viczian, A. S., Solessio, E. C., Lyou, Y., Zuber, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+eyes+from+pluripotent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional eyes from pluripotent cells.</a> PLoS Biol. 7, e1000174-e1000174 (2009).</li>
<li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2, 905-909 (2005).</li>
<li>Brown, A. L., Johnson, B. E., Goodman, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+patch-pipettes+and+sharp+electrodes+with+a+programmable+puller%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Making patch-pipettes and sharp electrodes with a programmable puller.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Lan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noggin+Elicits+Retinal+Fate+in+Xenopus+Animal+Cap+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Noggin Elicits Retinal Fate in Xenopus Animal Cap Embryonic Stem Cells.</a> Stem Cells. , (2009).</li>
</ol>

W tym filmie zaprezentowaliśmy naszą wersję klasycznych technik stosowanych przez biologów badających Xenopus, które zmodyfikowaliśmy w celu stworzenia testu przeszczepu czepek zwierzęcy. W temperaturze pokojowej zarodki Xenopus rozwijają się bardzo szybko między stadiami 9 a 15. Przechowywanie ich w temperaturze 14°C spowalnia rozwój zarodka, co pozwala na wykonanie znacznie większej liczby przeszczepów w jednym eksperymencie. Jeśli konieczne jest doprowadzenie zarodków do późniejszych stadiów (&gt;42/...

<table><tbody><tr><td>Zestaw mMessage mMachine SP6</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>Borokrzemowe kapilary (1.0mm OD x 0.5mm ID)</td><td>FHC, Inc.</td><td>27-30-1</td><td></td></tr><tr><td>Wytciągacz mikropipet Sutter</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan gentamycyny [50 mg/ml]</td><td>Fisher Scientific</td><td>BW17-528Z</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Sylgard/elastomer 1.1lb</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9644388</td><td></td></tr><tr><td>Polistyrenowa szalka Petri 60 x 15 mm</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0160</td><td></td></tr><tr><td>Ludzka gonadotropina kosmórkowa</td><td>Intervet Inc.</td><td>22219</td><td></td></tr><tr><td>Systemy mikroiniekcyjne Pico-Injector</td><td>Harvard Apparatus</td><td>650003</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator Torrey Pines Scientific ECHOtherm</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-680-21</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa</td><td>Krackeler Scientific, Inc.</td><td>6290-20635A</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumostar #5</td><td>Fisher Scientific</td><td>11295-10</td><td></td></tr></tbody></table>

wyznaczanie rodzaju tkanki przy użyciu testu przeszczepu czapy zwierzęcej (act) u xenopus laevis

Tissue Determination Using the Animal Cap Transplant (ACT) Assay in Xenopus laevis

Wiele białek pełni podwójną rolę w rozwoju zarodkowym. Białka regulujące determinację losu komórek w konkretnej tkance mogą jednocześnie wpływać na rozwój większego obszaru zarodka. Powoduje to trudności w analizie i zdefiniowaniu ich roli w danej tkance. Na przykład,nogginnadekspresja wXenopus laeviszarodki powodują ekspansję całego regionu przedniego, w tym oka1,2Na podstawie tego wyniku nie wiadomo, czy Noggin odgrywa bezpośrednią rolę w determinacji oka, czy też poprzez wywoływanie ekspansji tkanki nerwowej Noggin pośrednio wpływa na formowanie się oka. Taki złożony fenotyp sprawia, że analiza specyficznej dla oka roli tego białka w determinacji losu komórek jest trudna. Opracowaliśmy test, który pozwala rozwiązać ten problem. Wykorzystując pluripotencjalną naturęXenopus laevisskórek zwierzęcych3opracowaliśmy test pozwalający sprawdzić zdolność produktów genów, takich jaknogginlub czynników transkrypcyjnych pola oka (EFTFs), aby przekształcić czapy w konkretne typy tkanek lub komórek poprzez przeszczepienie tej tkanki na bok embrionu4Podczas gdy ustaliliśmy, że traktowanie białkiem Noggin lub zestawem czynników transkrypcyjnych może determinować los komórek siatkówki w czapkach zwierzęcych, procedura ta może zostać wykorzystana do identyfikacji produktów genów zaangażowanych w specyfikację innych tkanek.

Kapturki zwierzęce nadekspresujące produkty genów są transplantowane do boku rozwijających się embrionów Xenopus laevis w celu ustalenia, czy tkanka jest zdeterminowana.

Wyznaczanie rodzaju tkanki przy użyciu testu przeszczepu czapy zwierzęcej (ACT) u Xenopus laevis

Wiele białek pełni podwójną rolę w rozwoju embrionalnym. Te, które regulują determinację losu komórek w konkretnej tkance, mogą również wpływać na rozwój...

Ogólnym celem testu A CT jest sprawdzenie, czy dany gen lub grupa genów może określać los komórkowy prymitywnej skóry. Procedura rozpoczyna się od nadekspresji RNA kodujących fluorescencyjny gen reporterowy oraz gen lub geny zainteresowania w rozwijających się embrionach X. laevis. Następnym krokiem jest wycięcie czapki zwierzęcej lub prymitywnego odum wykazującego nadekspresję RNA i ich hodowla do stadium 15.Trzecim krokiem procedury jest usunięcie tkanki z boku zarodka gospodarza w stadium 15. Ostatnim krokiem jest przeszczepienie połowy tkanki czapeczki zwierzęcej donora na bok zarodka gospodarza i hodowla gospodarza do stadium 42 lub 43. Wyniki wykazują tworzenie tkanki ektopowej, takiej jak struktury przypominające oko, co potwierdzono poprzez przygotowanie przekrojów i barwienie immunologiczne markerami specyficznymi dla danej tkanki.Witajcie, nazywam się i pracuję w Katedrze Okulistyki na Upstate Medical University. Dzisiaj zaprezentuję procedurę zwaną testem przeszczepu czapki zwierzęcej (animal cap transplant assay), którą opracowałem we współpracy z Mike'iem Suberem. Stosujemy ten test w obu naszych laboratoriach do badania genów, które są wystarczające do indukcji formowania oka.Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować RNA z czapeczką do iniekcji poprzez transkrypcję noggin lub innego genu zainteresowania oraz YFP, który będzie służył jako znacznik. Przygotuj również roztwory na bazie MMR, zapas 8x roztworu do składania jaj oraz igły do iniekcji zarodków.Do wykonania naczyń do utrzymywania zarodków wykorzystuje się specjalnie wykonaną formę elastomerową. Dla każdego warunku eksperymentalnego przygotowuje się jedną płytkę wtryskową poprzez roztapianie 1% AROS w 0,4 XMMR w kuchence mikrofalowej. Około sześciu mililitrów roztworu przenosi się do płytki 60 mm.Ostrożnie umieść formę elastomerową na powierzchni roztworu, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza, i pozostaw do ostygnięcia na około 20 minut. W temperaturze pokojowej przygotuj jedną płytkę izolacyjną z kapsułkami dla każdego warunku doświadczalnego, stosując 1% AGROS oraz 0,7 XMMR z formami, w sposób przedstawiony wcześniej dla płytek do iniekcji. Przygotuj dodatkowe płytki dla każdego punktu czasowego.Szczegóły obliczania punktów czasowych znajdują się w towarzyszącym protokole pisemnym. Następnie należy wyizolować i przetestować te tkanki z samca żaby, a następnie przechowywać tkankę w temperaturze 4 °C w sterylnym roztworze 1X MMR uzupełnionym o 50 µg/mL Gentamycyny.Można to zrobić do tygodnia przed rozpoczęciem eksperymentu, należy jednak pamiętać, że plemniki z czasem tracą swoją skuteczność, szczególnie pod koniec dnia poprzedzającego mikroiniekcję. Wstrzyknij samicom 500 jednostek ludzkiej gonadotropiny kosmórkowej. Przechowuj samice w temperaturze od 16 do 18 °C przez noc.Wszystko jest teraz przygotowane do mikroiniekcji w następnym dniu. Należy zacząć od wybrania samic poddanych indukcji hormonalnej i umieszczenia ich w oddzielnych zbiornikach, z których każdy zawiera jeden XELS. Przygotuj igłę do mikroiniekcji, odcinając jej końcówkę.Aby uzyskać średnicę od 25 do 35 mikrometrów, umieść igłę w pikowstrzykiwaczu PLI 100 i skalibruj go tak, aby dozował 10 nanolitrów na jedną iniekcję. Ustaw inkubator na 14 stopni Celsjusza; przeniesienie ich do niższej temperatury po wstrzyknięciu RNA spowalnia rozwój zarodka, co pozwala na wykonanie znacznie większej liczby przeszczepów w ramach jednego eksperymentu. Około godziny przed zapłodnieniem wyjmij jaja ze zbiornika. Gdy samice będą składać jaja przez dodatkową godzinę, użyj pipety transferowej, aby usunąć nowo złożone jaja ze zbiornika.Należy pamiętać, aby nie używać jaj, które znajdowały się w roztworze ELS przez więcej niż dwie godziny. W miarę jak jakość jaj spada, należy umieścić je w 60 mm szalkach Petriego. Szalka powinna być wypełniona w około 80% pojedynczą warstwą jaj.Usunąć z jaj jak najwięcej ELS i zastąpić je jedną porcją XMMR. Jaja mogą pozostawać w XMMR przez maksymalnie jedną godzinę. Następnie przeprowadzić zapłodnienie jaj in vitro przy użyciu homogenizatu jąder.Zaleca się zapłodnienie zarodków w trzech oddzielnych partiach, około godziny 11:00, w południe oraz o 13:00, aby mogły one rozwinąć się do pożądanego stadium: od 8,5 do 9 dla izolacji czapeczki oraz do stadium 15 dla transplantacji. Godzinę po zapłodnieniu jaj usunąć otoczkę galaretowatą za pomocą roztworu D jelly, płucząc obficie 0.1 XMMR, a następnie odczekać, aż zapłodnione jaja osiągną stadium dwukomórkowe.Aby rozpocząć sortowanie, należy przygotować szalkę do iniekcji wypełnioną 0.4 XMMR oraz 6%F ccal. Gdy zarodki osiągną stadium dwóch komórek, za pomocą pipety transferowej należy przenieść zarodki o jednolitej pigmentacji i równomiernym podziale do dołka szalki do iniekcji.Przejdź do mikroiniekcji; najpierw naciągnij folię nad pokrywką szalki Petriego o średnicy 60 mm. Nanieś pipetą 2 µL próbki RNA na biofilm, a następnie ją odessać. Używając piko-inkektora, napełnij igłę do iniekcji.Przed rozpoczęciem iniekcji należy upewnić się, że igła nadal dozuje 10 litrów próbki. RNA jest wstrzykiwane do obu blastomerów embrionu w stadium dwóch komórek. Wstrzyknij 500 picogramów Y-F-P-R-N-A do każdego z 20–30 embrionów i umieść je w jednej szalce.Wstrzyknij kolejnym 20 do 30 embrionom po 20 picogramów Nain, RNA wymieszanego wcześniej z Y-F-P-R-N-A, i umieść je w szalce. Dodatkowo, w innym czasie wstrzykiwania, umieść od 100 do 200 nieiniekcyjnych embrionów na punkt czasowy w osobnej szalce zawierającej roztwór FICO. Przenosź te embriony do inkubatora i z niego w tym samym czasie, co embriony poddane iniekcji.Są to gospodarze, które zostaną wykorzystane do przeszczepienia czapeczek po iniekcji. Wszystkie embriony należy inkubować w temperaturze 14 °C przez noc. Powtórz czynność dla wszystkich zaplanowanych punktów czasowych.Po inkubacji nocnej można wyizolować czepek zwierzęcy. Należy stawić się wcześnie rano, aby określić stadium rozwoju embrionów. Pamiętaj również o wyjęciu z inkubatora nieiniekcyjnych embrionów gospodarza.Najwcześniejszy punkt czasowy powinien przypadać na dziewiąty etap rozwoju. Najpierw należy usunąć zarodki, które nie przeżyły. Następnie należy przystąpić do izolacji czapeczek zwierzęcych z żywotnych zarodków, przetwarzając każdy punkt czasowy w partiach w naczyniu do izolacji czapeczek.Dodaj obfitą ilość roztworu 0.7 XMMR z dodatkiem gentamycyny. Następnie odlej roztwór fol z każdej płytki zawierającej wstrzyknięte embriony i ponownie dodaj roztwór 0.7 XMMR z dodatkiem gentamycyny. Wyjmij embriony z dołków naczynia do wstrzykiwania za pomocą pipety transferowej i umieść je w świeżo przygotowanym naczyniu do izolacji w zakrętce.Do wyizolowania czapek zwierzęcych w roztworze 0,7 XMMR z dodatkiem gentamycyny należy użyć albo narzędzia gastro master z żółtą końcówką zgiętą do 400 µm, albo pary ostrych pęsety numer pięć. Dwa lub trzy nienaruszone embriony należy zachować do określenia stadium rozwoju. Po wyizolowaniu czapki zwierzęcej należy umieścić je z powrotem w inkubatorze w temperaturze 14 °C wraz z embrionami gospodarzami do następnego dnia, kiedy czapki zostaną przeszczepione na bok embrionów gospodarzy.Wyjąć kapsułki wraz z embrionami gospodarza z pierwszego punktu czasowego z inkubatora ustawionego na 14 stopni Celsius i określić stadium rozwoju embrionów, sortując je w celu wybrania kapsułek o jednolitej fluorescencji dodatniej. Policzyć liczbę kapsułek i usunąć je. Za pomocą ostrych pęsety numer pięć przenieść dwukrotność liczby embrionów gospodarza do świeżo przygotowanej szalki do iniekcji z roztworem 0.7 XMMR z dodatkiem Gentamycyny.Usuń błonę Lene z każdego embrionu gospodarza. Przenieś je na płytkę z nakładkami, zachowując ostrożność ze względu na brak błon Lene. Embriony mogą szybko rozdzielić się na powierzchni wody; należy użyć do tego gastro mastera z żółtą końcówką i wygiętym drutem o średnicy 200 do 250 µm w najwyższym ustawieniu lub pęsety numer pięć.Wyciąć fragment o wymiarach 200 µm kwadrat na boku zarodka w stadium 14 do 15. Następnie, ponownie używając gastro mastera lub pęsety numer pięć, przeciąć czepkę na pół i umieścić tkankę w otworze wykonanym w zarodku gospodarza.Obróć embrion o ściankę dołka, aby umożliwić gojenie. Wykonaj tę czynność dla jak największej liczby embrionów, gdy znajdują się one w stadium 15. Powtórz procedurę dla wszystkich punktów czasowych.Zarodek zazwyczaj goi się w ciągu 30 minut. Następnie za pomocą pęsety nr 5, delikatnym ruchem szczotkowania należy usunąć martwe komórki, które mają biały kolor. Przeszczepione zarodki należy inkubować w temperaturze 18 °C przez noc.Po inkubacji nocnej, pracując pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym, należy wyselekcjonować embriony z fluorescencyjnie znakowaną tkanką przeszczepioną. Wybrane embriony należy ponownie umieścić w temperaturze 18 stopni Celsiusa i inkubować do stadium 42 lub 43. Po osiągnięciu przez zwierzęta pożądanego stadium, należy je znieczulić w roztworze trica, a następnie zbadać pod fluorescencyjnym mikroskopem stereoskopowym i wykonać dokumentację fotograficzną.Przeszczepione embriony można następnie utrwalić, pociąć na sekcje i poddać barwieniu immunologicznemu lub przeprowadzić hybrydyzację in situ z wykorzystaniem markerów dla interesującej tkanki. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki dla kijanki biorcy z tkanką donora wykazującą ekspresję fluorescencyjnego znacznika oraz noggin jeden dzień po transplantacji. Zwróć uwagę, jak tkanka formuje się w kule po boku kijanki.Zarodki gospodarzy, które otrzymały kontrolowaną tkankę donora wykazującą ekspresję jedynie fluorescencyjnego znacznika, zaczynają już wbudowywać komórki czapki zwierzęcej w swój bok. Kilka dni później kijanki, które otrzymały komórki donora wykazujące ekspresję nain, tworzą na boku struktury przypominające oczy, podczas gdy kijanki, które otrzymały kontrolną tkankę donora, mają komórki fluorescencyjne na powierzchni skóry. Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak przeprowadzić test przeszczepu czapki zwierzęcej u Xenopus laevis.Podczas wykonywania tego testu ważne jest, aby pamiętać o przygotowaniu wszystkich materiałów przed rozpoczęciem procedury w danym dniu, aby embriony nie rozwijały się szybciej, niż jest możliwe ich przetworzenie. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

tissue-determination-using-animal-cap-transplant-act-assay-xenopus

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Oznaczanie tkanki za pomocą testu przeszczepu czapeczki zwierzęcej (ACT) u Xenopus laevis

Xenopus embrionalne nabłonki stanowią idealny system modelowy do badania zachowań komórkowych, takich jak rozwój polaryzacji i zmiana kształtu podczas morfogenezy nabłonkowej. Tradycyjna histologia utrwalonych próbek jest coraz częściej uzupełniana przez konfokalne obrazowanie żywych komórek. W niniejszej pracy prezentujemy metody izolacji tkanek żaby oraz wizualizacji żywych komórek nabłonkowych i ich cytoszkieletu z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii żywych komórek.

Obrazowanie żywych komórek i analiza ilościowa embrionalnych komórek nabłonkowych u Xenopus laevis

Xenopus laevis dostarcza idealnego systemu modelowego do badania specyfikacji losu komórki i funkcji fizjologicznych poszczególnych komórek siatkówki w pierwotnej hodowli komórkowej. Tutaj przedstawiamy technikę preparowania tkanek siatkówki i generowania pierwotnych kultur komórkowych, które są obrazowane pod kątem aktywności wapnia i analizowane przez hybrydyzację in situ.

Sekcja, hodowla i analiza embrionalnej tkanki siatkówki Xenopus laevis

Technika przeszczepiania tkanki twarzy "Extreme Anterior Domain" pomiędzy embrionami Xenopus laevis została opracowana. Tkanka może być przenoszona z jednego tła ekspresji genów do drugiego, co pozwala na badanie lokalnych wymagań dotyczących rozwoju twarzoczaszki i sygnalizowania interakcji między regionami twarzy.

Przeszczepy twarzy w zarodkach Xenopus laevis

Manuskrypt tutaj dostarcza prosty zestaw metod do analizy wydzielania i dyfuzji fluorescencyjnie znakowanych ligandów w Xenopus. Stwarza to kontekst do testowania zdolności innych białek do modyfikowania rozkładu ligandów i umożliwia przeprowadzanie eksperymentów, które mogą dać wgląd w mechanizmy regulujące gradienty morfogenu.

Wykorzystanie analizy konfokalnej Xenopus laevis do badania modulatorów gradientów morfogenicznych Wnt i Shh

W embrionach Xenopus, komórki z dachu blastocoelu są pluripotencjalne i mogą być zaprogramowane do generowania różnych tkanek. W tym miejscu opisujemy protokoły stosowania eksplantatów dachowych z blastocoelu jako systemu testowego do badania kluczowych cech in vivo i in vitro wczesnego rozwoju neuronalnego.

Podobne do komórek macierzystych eksplantaty embrionalne Xenopus do badania wczesnych cech rozwojowych neuronów in vitro i in vivo

Opisujemy system oocytów i czapeczek zwierzęcych Xenopus do klonowania ekspresji genów zdolnych do wywołania odpowiedzi w kompetentnej ektodermie i omawiamy techniki późniejszej analizy takich genów. System ten jest przydatny w funkcjonalnej identyfikacji szerokiej gamy produktów genowych.

Klonowanie funkcjonalne przy użyciu systemu ekspresji oocytów Xenopus

Ten artykuł przedstawia wygodną i szybką metodę wizualizacji różnych populacji komórek nerwowych w ośrodkowym układzie nerwowym zarodków Xenopus za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego na skrawkach.

Ocena pierwotnej neurogenezy w zarodkach Xenopus za pomocą barwienia immunologicznego

Ten protokół demonstruje metodę opartą na fluorescencji do wizualizacji układu naczyniowego i ilościowego określenia jego złożoności u Xenopus tropicalis. Naczynia krwionośne można obrazować kilka minut po wstrzyknięciu barwnika fluorescencyjnego do bijącego serca zarodka po manipulacjach genetycznych i/lub farmakologicznych w celu zbadania rozwoju układu sercowo-naczyniowego in vivo.

Wizualizacja i analiza ilościowa angiogenezy embrionalnej u Xenopus tropicalis

Opisujemy protokół ksenotransplantacji do żółtka przezroczystych zarodków danio pręgowanego, który jest zoptymalizowany za pomocą prostej, szybkiej metody oceny poziomu. Analizy po wstrzyknięciu obejmują przeżycie i ocenę obciążenia chorobowego ksenoprzeszczepionymi komórkami za pomocą cytometrii przepływowej.

Prosta, szybka i skuteczna metoda analizy ksenotransplantacji guza w przezroczystych zarodkach danio pręgowanego

To jest pierwsza część kompleksowego protokołu próbkowania Xenopus. Pobrane tkanki to komora serca, pień tętniczy, lewy płat wątroby, pęcherzyk żółciowy, płuco, trzustka, śledziona, krtań, przełyk, żołądek, jelita, jądra, ciała tłuszczowe, jajowód, sparowane nerki, splot kulszowy, skóra, grasica i całe oko.

Skuteczne techniki kompleksowego pobierania próbek dostępnych tkanek u dorosłych Xenopus

Poznaj metodę oznaczania tkanek za pomocą testu przeszczepu czapeczki zwierzęcej u Xenopus laevis. Technika ta pozwala badać determinację losu komórek w biologii rozwoju.

Wyznaczanie rodzaju tkanki przy użyciu testu przeszczepu czapy zwierzęcej (ACT) u Xenopus laevis

Przeglądaj więcej filmów