Przygotowanie rozwijających się i dorosłych mózgów i siatkówk Drosophila do obrazowania na żywo

Jak to zrobić, w tym filmie pokażę, jak przygotować oph mózgu i siatkówki do obrazowania na żywo i immunohistochemii z naciskiem na komórki fotoreceptorowe. Najpierw pokażę Ci, jak przygotować się do sekcji mózgu. Następnie zademonstruję trzy różne sekcje: mózg dorosłego, siatkówkę dorosłego człowieka i rozwijające się oko.

Dla każdego z nich tkanka może być utrwalona do immunohistochemii lub zobrazowanego życia. Na koniec opiszę, w jaki sposób obrazujemy żywą tkankę i pokażę kilka przykładów obrazowania na żywo za pomocą rezonansowej skaningowej mikroskopii konfokalnej. Przejdźmy więc do tego.

Do sekcji dobroci potrzebujesz ostrych kleszczy. Za pomocą bloku do ostrzenia lub bardzo drobnego papieru ściernego delikatnie przesuwaj kleszcze w przód iw tył z każdej strony, aż końce się spotkają. W precyzyjnym miejscu używamy standardowego kamienia do ostrzenia.

Nie będę tutaj omawiał techniki ostrzenia, ale powiem, że ostre kleszcze są niezbędne do sekcji na żywo. Codziennie ostrzymy kleszcze do sekcji mózgu dorosłych. Umieść muchy na podkładce CO2, aby je znieczulić i uporządkować pożądany genotyp.

W przypadku sekcji źrenicy wystarczy sięgnąć do fiolki i ostrożnie usunąć źrenicę kleszczami, uważając, aby nie uszkodzić źrenicy. Zwiń chusteczkę i zwilż ją wodą. Użyjesz tego podczas sekcji, aby usunąć zanieczyszczenia z kleszczy.

Umieść naczynie preparacyjne na stoliku stereoskopu i napełnij je roztworem HL trzy. Wszystkie sekcje zostaną przeprowadzone w HL trzy, aby zapewnić, że tkanka pozostanie żywa i zdrowa podczas procedury preparacji. Lubię też używać naczynia do sekcji, które ma dolną powłokę z Syl guard, aby chronić moje kleszcze podczas sekcji.

Teraz przygotuj rozwiązanie naprawcze. Jeśli planujesz wykonać immunohistochemię. Umieść 180 mikrolitrów HL trzy w mikroprobówce wirówkowej o pojemności 500 mikrolitrów.

Dodaj 20 mikrolitrów 37% formaldehydu, aby uzyskać 3,7% roztwór formaldehydu. Wreszcie, właściwa pozycja ręki jest ważna dla dobrych sekcji z dobrą pozycją dłoni. Twoje kleszcze będą stabilne i zdolne do kontrolowanych subtelnych ruchów.

Najpierw umieść kleszcze z boku kciuka, a następnie przesuń palec wskazujący prosto w dół, tak aby czubek palca spoczywał na górze. Teraz oprzyj bok kleszczy na boku środkowego palca i przejdź do naczynia do sekcji. Utrzymuj fizyczny kontakt z naczyniem kciukiem i środkowym palcem, opierając kciuk i środkowy palec na talerzu.

Połóż swój nadgarstek na stoliku mikroskopu. Tą drogą. Podczas sekcji masz trzy punkty mocno osadzone na powierzchniach i teraz możliwe jest wykonywanie tylko bardzo subtelnych manipulacji kleszczami.

Na podkładce CO2. Ustaw dorosłego muchę brzuszną stroną do góry, z głową z dala od dłoni. Chwyć klatkę piersiową tuż pod głową.

Jeśli zrobisz to prawidłowo, nogi i probus wysuną się podczas oglądania pod stereoskopem, chwyć przedłużone traby kleszczami, aby zdjąć głowę, wyrzuć ciało i zanurz głowę. Ponownie ustaw ostrość na zanurzonej głowicy. Cała sekcja zostanie przeprowadzona w roztworze.

Bardzo ważne jest, aby przez cały czas trzymać się głowy kleszczami. W przeciwnym razie głowa będzie unosić się na wodzie. I pamiętaj, że pływająca głowa jest zawsze trudna do odzyskania.

Jeśli głowica przesunie się z ostrości podczas sekcji, po prostu przesuń ją z powrotem do płaszczyzny ogniskowej bez regulacji mikroskopu. To pozornie proste zadanie może być na początku trudne, ale z czasem utrzymanie ostrości w głowie stanie się łatwiejsze. Rozpocznij sekcję od zerwania tkanki łącznej między probusem a okiem.

Rozerwij oko, trzymając mocno co najmniej jednym kleszczem przez cały czas. Upewnij się, że palec kleszczy znajduje się tylko tuż pod siatkówką lub naskórkiem. Aby uniknąć uszkodzenia mózgu pod spodem, na przemian w lewo i w prawo.

Użyj kleszczy, aby oderwać siatkówkę działającą w kierunku tyłu głowy. Oderwanie siatkówki zwiększy szanse, że blaszka pozostanie przyczepiona do płata wzrokowego. Podczas tego rozbioru kontynuuj wokół tyłu głowy, rozrywając po drodze naskórek, przeerwij drugie oko i zacznij odrywać naskórek.

Tak długo, jak chwytasz naskórek, wiesz, że nie miażdżysz mózgu. Mając to na uwadze, kontynuuj odciąganie naskórka i siatkówki, aż ujawni się mózg. Gdy mózg jest widoczny, możesz zacząć usuwać tchawicę przyczepioną do mózgu, kontynuować jej ciągnięcie, tchawicę i naskórek, aż mózg zostanie odizolowany.

W tym momencie należy ponownie skupić się na dnie naczynia, aby wykonać pozostałe kroki obrazowania zakończeń fotoreceptorów. Pożądane jest zachowanie blaszki, ale należy usunąć siatkówkę, która zawiera ciała komórkowe i silnie autofluorescencyjny pigment. Aby to zrobić, ostrożnie pociągnij za krzaczaste resztki ciała komórki, nie uszkadzając blaszki.

Jest to subtelniejsza umiejętność i wymaga praktyki. Usuń pozostałą tchawicę Ponieważ twój mózg może w przeciwnym razie unosić się na wodzie podczas nocnego płukania przeciwciałami, dorosły mózg może być utrzymywany przy życiu przez wiele godzin, a nawet przez noc w warunkach, które omówię w sekcji siódmej. Do celów immunohistochemicznych dorosły mózg jest teraz gotowy do utrwalenia i formaldehydu.

Użyj pipety P 20 o pojemności pięciu mikrolitrów, aby przenieść mózg dorosłego człowieka do roztworu utrwalającego, który już przygotowałeś. Kontynuuj sekcję mózgów dorosłych przez 20 minut, co powinno dać od czterech do 10 mózgów. Zostaw mózgi i napraw na dodatkowe 40 minut.

Jednak ten czas trwania może się różnić. W celu optymalnego barwienia przeciwciał pierwotnych należy usunąć roztwór formaldehydu i umyć mózgi trzy razy przez pięć minut każdy i 400 mikrolitrów roztworu zawierającego PBS i 0,4% TRITTON X 100, zwanego dalej PBS Triton. Po całkowitym wypłukaniu utrwalonego roztworu można dodać pierwszorzędowy roztwór przeciwciała.

Rozpocznij tę sekcję zgodnie z opisem dla dorosłego mózgu Po zanurzeniu głowy i ponownym ustawieniu ostrości mikroskopu zacznij od rozerwania tkanki łącznej między probusem a okiem powyżej probusa. Oddziel naskórek od oka. Teraz oddziel naskórek od spodu oka, kierując się w stronę tyłu głowy, za pomocą jednego kleszcza.

Chwyć środek tyłu głowy, aby przeprowadzić tę sekcję. Nie ma nic złego w zmiażdżeniu mózgu innymi kleszczami. Chwyć wzrok i rozsuń się.

Pozwól oku osiąść na dnie naczynia. Blaszka prawdopodobnie nadal będzie przyczepiona do oka i będzie mogła być używana do obrazowania na żywo zakończeń fotoreceptorów z całkowicie nienaruszonych komórek fotoreceptorowych. Kolejne trzy sekcje wyjaśniają, jak przygotować oko do immunohistochemii.

W przypadku immunohistochemii przesuń oko do roztworu utrwalającego. Używając rurki P 20 Petman ustawionej na pięć mikrolitrów, kontynuuj sekcję oczu dorosłych przez łącznie 10 minut. Pozostaw oczy i utrwal na dodatkowe 30 minut.

Usunąć utrwalony roztwór i przeprowadzić płukanie zgodnie z opisem w sekcji mózgu osoby dorosłej. Jeśli ostatecznie chcesz zobrazować materialną strukturę oka, musisz ją usunąć. Teraz przywróć nieruchome oczy do naczynia preparacyjnego i usuń wszelkie tchawice lub komórki tłuszczowe, które mogą być nadal przyczepione.

Następnie, trzymając zewnętrzną stronę oka jednym kleszczem, usuń blaszkę drugim. Powinien zejść w jednym kawałku, odsłaniając ciała komórek pod spodem. Uważaj, aby chwycić tylko blaszkę W przeciwnym razie ryzykujesz oderwanie ciał komórkowych od siatkówki.

Za pomocą rury P 20 Eman, przesuń oczy na 400 mikrolitrów PBS Triton w probówce o pojemności 500 mikrolitrów. Delikatnie kołysz nimi w temperaturze czterech stopni przez noc, aby następnego dnia usunąć autofluorescencyjny czerwony pigment z fotoreceptorów. Możesz wyrzucić roztwór do płukania i dodać go do pierwotnego obrazowania na żywo oczu dorosłych bez blaszki.

Używamy tylko dorosłych fretek muchowych, które są w późnym stadium puy na krótko przed elo. Na tym etapie ciała komórek fotoreceptorów oddzielają się od zakończeń blaszki podczas rozwarstwienia. Dorosłe osobniki mają dobrze zarysowane skrzydła, oczy i naskórek widoczny przez obudowę źrenicy.

Wybierz poczwarkę i zanurz ją w HL trzy. Usuń przednią część obudowy źrenicy, aby odsłonić obszar głowy. Ostrożnie usuń cienką błonę wewnętrzną, która dodatkowo otacza rozwijającą się muchę.

Chwyć podstawę głowy kleszczami i pociągnij. Wyrzuć resztę poczwarki, trzymając głowę zanurzoną. Postępuj zgodnie z opisem w sekcji oka pod kątem immunohistochemii w stadium dorosłym

Jednak ciała komórek fotoreceptorowych łatwiej odczepią się od blaszki, co pozwoli na zobrazowanie ciał komórkowych zagnieżdżonych w siatkówce. Ponadto blaszka pozostaje przymocowana do płata wzrokowego, co pozwala na zobrazowanie blaszki dystalnej. Jeśli chcesz zobrazować blaszkę proksymalną, w której widoczne są wkłady końcowe fotoreceptorów, wykonaj sekcję oka na dorosłej muchy, w której blaszka jest silniej przyczepiona do oka.

Rozwijający się dysk oka przy 20% rozwoju źrenicy stał się ulubieńcem obrazowania na żywo w naszym laboratorium. Ponieważ ta pojedyncza warstwa stosunkowo dużych rozwijających się komórek jest łatwa do zaobserwowania za pomocą mikroskopii konfokalnej. Aby wybrać poczwarkę o stężeniu 20%, poszukaj kanalików Iana, zielonej plamki, która pojawia się pod obudową źrenicy i unikaj poczwarek, które mają ciemne ciało, które tworzy się po 20% rozwoju źrenicy.

Po wybraniu poczwarki zanurz ją w HL 3 w naczyniu preparacyjnym i ostrożnie usuń przednią część worka źrenicy. Uważając, aby nie przeniknąć przez cienką membranę wewnętrzną. Chwyć wewnętrzną membranę kleszczami i rozsuń.

Dokładnie przeszukaj wydaną zawartość, aby znaleźć rozwijające się dyski mózgowe i oczne, które są dość widoczne. Odizoluj mózg na dnie naczynia preparacyjnego. Ostrożnie oddziel centralną część mózgu od płata wzrokowego.

Kompleks dysku płata wzrokowego I zostanie wykorzystany do obrazowania na żywo. Jeśli pacjent chce wykonać obrazowanie przez krótki okres czasu w jednym lub dwóch roztworach, może zobrazować swoją tkankę na szkiełku podstawowym na szkiełku podstawowym (ang. W takim przypadku należy przygotować szkiełko, najpierw pokrywając powierzchnię osłoną syl guard, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.

Umieść 20 mikrolitrów HL trzy. W środku szkiełka przetransportuj wypreparowaną tkankę w dodatkowych 20 mikrolitrach HL trzy do szkiełka. Tkanka nigdy nie może być wystawiona na działanie powietrza.

Ponadto należy unikać wszelkich naprężeń i naprężeń związanych z obsługą pipet. W przypadku obrazowania na żywo tkanka musi być mocno zabezpieczona. Zaopatrz się w szklaną elektrodę, taką jak te wyciągane do zapisów elektrofizjologicznych.

Oderwij końcówkę i wypełnij koniec ściegiem klejowym za pomocą podciśnienia powietrza wytwarzanego przez usta, oderwij tylko tyle elektrody, aby klej mógł wejść. Teraz użyj nadciśnienia, aby nałożyć niewielką ilość kleju na osłonę progu pod kroplą HL trzy. Teraz szybko ustaw tkankę na kleju, zachowując pożądaną orientację do obrazowania na żywo.

Do obrazowania można teraz używać soczewki zanurzonej w wodzie. Jeśli chcesz dodać barwnik przepuszczalny przez membranę, możesz dodać go do kąpieli. Podczas obrazowania w celu obrazowania przez długi czas lub w celu całkowitej lub wielokrotnej wymiany roztworów, używamy komory perfuzyjnej, która łączy się z pompą perystaltyczną, która powoli rozprowadza roztwór hodowlany na żywej tkance.

Użyj szkiełka nakrywkowego pokrytego kroplą osłony syl, która jest ogolona, aby była cienka i płaska. Dozuj 20 mikrolitrów HL trzy na środek pokrywy. Wsuń i przyklej żywą tkankę do osłony parapetu.

Wygeneruj uszczelkę, która pozwoli pęcherzykom przejść przez komorę bez wystawiania żywej tkanki na działanie powietrza. Uszczelka powinna być wystarczająco gruba, aby uniknąć zgniecenia tkanki, ale wystarczająco cienka, aby zbliżyć tkankę do soczewki mikroskopu konfokalnego. Zmontuj komorę obfitości, uważając, aby tkanka była przez cały czas całkowicie zanurzona.

Tak więc wymiana roztworów może odbywać się z szybkością do 100 mikrolitrów na minutę. Do obrazowania w skali godzin może być konieczne dodanie 20 hydroksy Dysona i antybiotyku, ale nie środka przeciwgrzybiczego i wykonanie obfitości ze znacznie wolniejszymi prędkościami około 10 mikrolitrów na minutę. Ponadto wprowadzamy tlen do pożywki hodowlanej, która zasila pompę perystaltyczną.

Teraz masz wszystkie umiejętności niezbędne do udanego wypreparowania mózgu i siatkówki drosophila. Możesz także obrazować na żywo rozwijające się krążki gałki oczne lub dorosłe fotoreceptory. Więc dzięki za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.