Name: Przygotowanie rozwijających się i dorosłych mózgów i siatkówk Drosophila do obrazowania na żywo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-03-15T17:55:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: Naucz się przygotowywać mózgi i siatkówki Drosophila do obrazowania na żywo i immunohistochemii. Protokół obejmuje preparaty dorosłych tkanek oraz rozwijających się dysków oka z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca została sfinansowana z grantów przyznanych przez Welch Foundation (I-1657) oraz NIH (RO1EY18884). P.R.H. jest stypendystą Eugene McDermott Scholar w zakresie badań biomedycznych.

1. Wstęp
W tym filmie zademonstrujemy, jak przygotować mózgi i siatkówki Drosophila do obrazowania żywych tkanek oraz immunohistochemii, ze szczególnym uwzględnieniem komórek fotoreceptorów. Najpierw pokażemy, jak przygotować się do wypreparowania mózgu. Następnie zaprezentujemy dwie podstawowe metody preparacji powszechnie stosowane w immunohistochemii, które stanowią bazę dla przygotowań do obrazowania na żywo. Są to preparacje mózgu i oka dorosłego osobnika. Kolejno zademonstrujemy preparacje stosowane do obrazowania na żywo dorosłego oraz rozwijającego się mózgu, kładąc nacisk na ich wykorzystanie w obrazowaniu żywych fotoreceptorów. Na koniec opiszemy sposób obrazowania żywych tkanek i przedstawimy przykłady obrazowania na żywo z wykorzystaniem rezonansowej mikroskopii konfokalnej.
2. Przygotowanie do sekcji
<ol>
	<li>Aby przeprowadzić prawidłową dyssekcję, niezbędne są ostre pęsety. Używając bloku do ostrzenia lub papieru ściernego o bardzo drobnej ziarnistości (&gt;1500), delikatnie przesuwaj pęsetę w przód i w tył po każdej z krawędzi, aż końcówki złączą się w ostrym punkcie. My stosujemy standardny kamień do ostrzenia. Nie będziemy tutaj omawiać techniki ostrzenia, jednak należy pamiętać, że ostre pęsety są niezbędne do dyssekcji na żywo. Ostrzymy pęsety przed każdą dyssekcją.</li>
	<li>W przypadku dyssekcji mózgu osobników dorosłych, umieść muchy na podkładce z CO2, aby je znieczulić, a następnie wyselekcjonuj pożądany genotyp. W przypadku dyssekcji poczwarki, po prostu sięgnij do fiolki i ostrożnie wyjmij poczwarkę pęsetą, uważając, aby nie uszkodzić jej łupiny.</li>
	<li>Zwilż chusteczkę Kimwipe wodą. Będzie ona służyć podczas dyssekcji do usuwania zanieczyszczeń z pęsety. Umieść szalkę do dyssekcji na stole stereomikroskopu i napełnij ją roztworem HL3 1. Wszystkie dyssekcje będą przeprowadzane w HL3, aby zapewnić, że tkanka pozostanie żywa i zdrowa podczas całej procedury. Stosujemy również szalkę do dyssekcji z dnem pokrytym Sylgardem, aby chronić pęsety podczas pracy.</li>
	<li>Teraz przygotuj roztwór utrwalający, jeśli planujesz przeprowadzić immunohistochemię. Do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 500μL wlej 180μL HL3. Dodaj 20μL 37% formaldehydu, aby otrzymać roztwór formaldehydu o stężeniu 3,7%.</li>
	<li>Na koniec, kluczowe dla udanej dyssekcji jest prawidłowe ułożenie dłoni. Dzięki właściwemu uchwytowi pęseta będzie stabilna, co umożliwi kontrolowane i precyzyjne ruchy. Najpierw oprzyj pęsetę o bok kciuka. Następnie skieruj palec wskazujący pionowo w dół tak, aby jego opuszek spoczywał na górze pęsety. Teraz oprzyj bok pęsety o bok palca środkowego i przesuń dłoń do szalki do dyssekcji. Dotykaj szalki kciukiem i palcem środkowym. Opierając kciuk i palec środkowy o szalkę, oprzyj nadgarstek o stół mikroskopu. W ten sposób uzyskasz trzy punkty stabilnego podparcia o powierzchnie podczas dyssekcji, co pozwala na wykonywanie bardzo subtelnych manipulacji pęsetą. Technika ta może początkowo wydawać się nieco nienaturalna, ale dzięki praktyce szybko opanujesz sztukę dyssekcji mózgu.</li>
</ol>
3. Mózg dorosły
<ol>
	<li>Na podkładce z CO2 ustaw dorosłą muchę stroną brzuszna do góry, tak aby głowa była skierowana w stronę przeciwną do dłoni. Chwyć tułowia tuż poniżej głowy. Jeśli zostanie to wykonane prawidłowo, odnóża i proboscis wyprostują się. Obserwując preparat pod stereoskopem, chwyć wyprostowany proboscis pęsetą, aby oddzielić głowę. Odrzuć ciało i zanurz głowę w roztworze. Ponownie ustaw ostrość na zanurzoną głowę. Cała sekcja będzie przeprowadzana w roztworze. Bardzo ważne jest, aby przez cały czas trzymać głowę pęsetą. W przeciwnym razie głowa może wypłynąć na powierzchnię, co utrudnia jej odzyskanie. Jeśli podczas sekcji głowa wyjdzie z obszaru ostrości, po prostu przesuń ją z powrotem w płaszczyznę ogniskową, nie regulując mikroskopu. To pozornie proste zadanie może być na początku trudne, ale utrzymywanie głowy w ostrości stanie się łatwiejsze z czasem.</li>
	<li>Rozpocznij sekcję, rozrywając najpierw tkankę łączną między proboscis a okiem. Rozrywaj oko, trzymając je mocno przynajmniej jedną pęsetą przez cały czas. Upewnij się, że końcówka pęsety znajduje się tuż pod siatkówką lub kutykulą, aby uniknąć uszkodzenia znajdującego się pod spodem mózgu. Używając pęsety, na przemian z lewej i prawej strony, odrywaj siatkówkę, kierując się ku tyłowi głowy. Odrywanie siatkówki zwiększy szansę, że lamina pozostanie przytwierdzona do płata optycznego podczas całej sekcji. Kontynuuj wokół tyłu głowy, odrywając po drodze kutykulę. Rozrywaj drugie oko i zacznij oddzielać kutykulę. Dopóki chwycisz kutykulę, masz pewność, że nie zgniatasz mózgu! Mając to na uwadze, nadal odrywaj kutykulę i siatkówkę, aż odsłonisz mózg.</li>
	<li>Gdy mózg będzie widoczny, możesz przystąpić do usuwania przylegających do niego tchawicek (Rys. 1A). Kontynuuj oddzielanie tchawicek i kutykuli, aż mózg zostanie wyizolowany. W tym momencie, na potrzeby pozostałych etapów, należy przenieść ostrość na dno naczynia. Usuń pozostałe tchawice, w przeciwnym razie mózg może wypłynąć podczas nocnych przemywań przeciwciałami. W celu obrazowania zakończeń fotoreceptorów pożądane jest zachowanie laminy, ale należy usunąć siatkówkę, która zawiera ciała komórek i silnie autofluorescencyjny pigment. Aby to zrobić, ostrożnie usuń puszyste i pigmentowane szczątki komórkowe, nie uszkadzając laminy. Wymaga to większej precyzji i wprawy.</li>
	<li>Dorosły mózg można utrzymać przy życiu przez wiele godzin, a nawet dni, stosując warunki, które zostaną omówione w sekcji 6. W przypadku immunohistochemii dorosły mózg jest teraz gotowy do utrwalenia w formaldehydzie.2 Użyj pipety P20 ustawionej na 5μL, aby przenieść dorosły mózg do wcześniej przygotowanego roztworu utrwalającego. Kontynuuj sekcję mózgów dorosłych osobników przez 20 minut, co powinno pozwolić na uzyskanie od 4 do 10 mózgów. Pozostaw mózgi w utrwalaczu przez kolejne 40 minut, choć czas ten może się różnić w zależności od optymalnego barwienia przeciwciałem pierwotnym. Usuń roztwór formaldehydu i przemyj mózgi 3 razy przez 5 minut każdy w 400μL roztworu zawierającego PBS i 0,4% TritonX-100, zwanego dalej PBS-Triton. Po całkowitym wypłukaniu roztworu utrwalającego można dodać roztwór przeciwciała pierwotnego.</li>
</ol>
4. Oko dorosłego osobnika
<ol>
	<li>Rozpocznij tę sekcję zgodnie z opisem dla mózgu dorosłego osobnika. Po zanurzeniu głowy i ponownym ustawieniu ostrości mikroskopu, zacznij od przerwania tkanki łącznej między trąbką a okiem. Nad trąbką oddziel kutykulę od oka. Następnie oddziel kutykulę od dolnej strony oka, przesuwając się w stronę tyłu głowy. Jedną pęsetą chwyć środek tyłu głowy. Drugą pęsetą chwyć oko i pociągnij. Pozwól, aby oko opadło na dno naczynia (Ryc. 1B). Lamina prawdopodobnie wciąż będzie przytwierdzona do oka i może zostać w tym momencie wykorzystana do obrazowania na żywo zakończeń całkowicie nienaruszonych komórek fotoreceptorowych. Aby kontynuować obrazowanie na żywo ciał komórek fotoreceptorowych, przejdź do sekcji 4.5. Kolejne trzy sekcje wyjaśniają immunohistochemię utrwalonego oka.</li>
	<li>W przypadku immunohistochemii przenieś oko do roztworu utrwalającego, używając mikropipety P20 ustawionej na 5μL. Kontynuuj sekcję oczu dorosłych osobników przez łącznie 10 minut. Pozostaw oczy w utrwalaczu na kolejne 30 minut. Usuń roztwór utrwalający i przeprowadź płukanie zgodnie z opisem dla sekcji mózgu dorosłego osobnika.</li>
	<li>Jeśli ostatecznie chcesz obrazować strukturę ommatidialną oka, lamina musi zostać teraz usunięta. Przenieś utrwalone oczy z powrotem do naczynia sekcyjnego i usuń wszelkie tchawki lub komórki tłuszczowe, które mogą być nadal przytwierdzone. Następnie, trzymając zewnętrzną stronę oka jedną pęsetą, usuń laminę drugą pęsetą. Powinna ona oddzielić się w jednym kawałku, odsłaniając znajdujące się pod nią ciała komórkowe (Ryc. 1B). Pamiętaj, aby chwytać wyłącznie laminę! W przeciwnym razie ryzykujesz oddzielenie fotoreceptorów od siatkówki.</li>
	<li>Używając mikropipety P20, przenieś oczy do 400uL PBS-Triton w probówce 500uL. Delikatnie wstrząsaj nimi w temperaturze 4 stopni przez noc, aby usunąć autofluoryzacyjny czerwony pigment z fotoreceptorów. Następnego dnia można wylać roztwór płuczący i dodać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego.</li>
	<li>Do obrazowania na żywo oczu dorosłych osobników używamy wyłącznie much w stadium pharate adult, czyli późnych stadiów poczwarki tuż przed wykluciem. Na tym etapie ciała komórek fotoreceptorowych oddzielają się od zakończeń w laminie podczas sekcji.</li>
	<li>Poczwarki w stadium pharate adult mają wyraźnie zarysowane skrzydła, oczy i kutykulę widoczną przez łupinę poczwarki. Wybierz poczwarkę i usuń przednią część łupiny, aby odsłonić region głowy. Ostrożnie usuń cienką wewnętrzną błonę, która dodatkowo otacza rozwijającą się muchę. Chwyć pęsetą podstawę głowy i pociągnij. Usuń resztę poczwarki, utrzymując głowę zanurzoną.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z procedurą sekcji oka dla immunohistochemii. Jednak w stadium pharate adult ciała komórek fotoreceptorowych odłączą się łatwiej od laminy, co umożliwi obrazowanie ciał komórkowych wbudowanych w siatkówkę. Ponadto lamina pozostaje przytwierdzona do płata optycznego, co pozwala na obrazowanie dystalnej części laminy. Jeśli chcesz obrazować laminę proksymalną, w której widoczne są kartridże zakończeń fotoreceptorowych, wykonaj sekcję oka u dorosłej muchy, u której lamina jest mocniej przytwierdzona do oka.</li>
</ol>
5. Rozwój kompleksów tarczka oka-mózg
<ol>
	<li>Rozwijający się krążek oka w 20% rozwoju poczwarki (P+20%) stał się w naszym laboratorium preferowanym obiektem do obrazowania na żywo, ponieważ ta pojedyncza warstwa stosunkowo dużych, rozwijających się komórek jest łatwo obserwowalna przy użyciu mikroskopii konfokalnej.3</li>
	<li>Aby wybrać poczwarkę w stadium 20%, należy szukać cewek Malpighiego oraz zielonej plamki widocznej pod osłonką poczwarki i unikać poczwarek o „ciemnym ciele”4. Po wybraniu poczwarki P+20% należy zanurzyć ją w medium HL3 w naczyniu sekcyjnym i ostrożnie usunąć przednią część worka poczwarki, uważając, aby nie przebić cienkiej wewnętrznej błony. Chwyć wewnętrzną błonę pęsetą i rozdziel ją.</li>
	<li>Uważnie przeszukaj uwolnioną zawartość, aby znaleźć rozwijający się mózg i krążki oka, które są bardzo wyraźne (Ryc. 1C). Kompleks krążek oka-mózg jest łatwo oddzielny na tym etapie metamorfozy. Odizoluj mózg na dnie naczynia sekcyjnego. Ostrożnie oddziel mózg centralny od płata optycznego. Płat optyczny/krążek oka zostanie wykorzystany do obrazowania na żywo.</li>
</ol>
6. Obrazowanie na żywo: przy mikroskopie
<ol>
	<li>Jeśli planują Państwo obrazowanie przez krótki czas w tylko jednym lub dwóch roztworach, tkankę można obrazować na szkiełku przedmiotowym. W takim przypadku należy przygotować szkiełko, pokrywając najpierw jego powierzchnię Sylgardem zgodnie z instrukcją producenta. Na środek szkiełka należy nanieść 20μL HL3. Wypreparowaną tkankę należy przenieść na szkiełko w dodatkowych 20μL HL3. Tkanka NIGDY nie może być wystawiona na działanie powietrza. Ponadto należy unikać jakichkolwiek naprężeń lub odkształceń wynikających z obsługi pipetą lub napięcia powierzchniowego roztworu.</li>
	<li>W przypadku obrazowania żywych tkanek, tkanka musi być stabilnie zamocowana przy minimalnej manipulacji i kontakcie. Pozycjonujemy mózg, używając polimeryzującego w wodzie kleju chirurgicznego GluShield aplikowanego za pomocą mikroelektrody, co jest techniką rutynowo stosowaną w preparatach embrionalnych do elektrofizjologii5. Należy użyć elektrody szklanej, takiej jak te wyciągane do rejestracji elektrofizjologicznej. Należy odłamać końcówkę i napełnić koniec GluShieldem, wykorzystując ujemne ciśnienie powietrza generowane ustami. Należy odłamać tylko tyle elektrody, aby klej mógł wniknąć do środka. Następnie za pomocą dodatniego ciśnienia należy nanieść niewielką ilość kleju na Sylgard pod kroplą HL3. Teraz należy szybko położyć tkankę na kleju, zachowując pożądaną orientację do obrazowania na żywo. Do obrazowania można teraz użyć obiektywu imersyjnego wodnego. Jeśli chcą Państwo dodać barwnik przenikający przez błonę, można go dodać do kąpieli w trakcie obrazowania.</li>
	<li>Używamy konfokalnego mikroskopu z rezonansowym skanowaniem, który umożliwia szybkie obrazowanie przy zredukowanym fotobieleniu.6 Do obrazowania przez dłuższy czas lub w celu całkowitej bądź wielokrotnej wymiany roztworów, stosujemy komorę perfuzyjną (komora do obrazowania konfokalnego Harvard IC30) podłączoną do pompy perystaltycznej, która powoli perfunduje żywą tkankę roztworem hodowlanym (Rys. 2A). Ciągła wymiana cieczy oraz minimalny kontakt z GluShield ograniczają spłaszczanie tkanki, które obserwowano w dłuższych okresach czasu7. Należy pamiętać, że w przypadku obrazowania okresów rozwojowych, kompleks tarczka oka-mózg musi pozostać nienaruszony i powinien mieć minimalny kontakt z klejem.</li>
	<li>Należy użyć szkiełka nakrywkowe pokrytego kroplą Sylgardu, który został zeskrobany, aby był cienki i płaski. Na środek nakrywki należy nanieść 20μL HL3 i przykleić żywą tkankę do Sylgardu. Należy utworzyć uszczelkę, która pozwoli pęcherzykom powietrza przechodzić przez komorę bez wystawiania żywej tkanki na działanie powietrza (Rys. 2B). Uszczelka powinna być wystarczająco gruba, aby uniknąć zmiażdżenia tkanki, ale wystarczająco cienka, aby zbliżyć tkankę do obiektywu mikroskopu konfokalnego; w naszej konfiguracji stosujemy 250μm. Należy złożyć komorę perfuzyjną, dbając o to, aby tkanka była przez cały czas całkowicie zanurzona. Perfuzję należy rozpocząć początkowo z prędkością bliską 100μL na minutę, używając pompy perystaltycznej. Prędkość ta jest dość wysoka, w zależności od grubości uszczelki definiującej wysokość komory. Do obrazowania w skali godzin może być konieczne dodanie 20-hydroksyekdyzonu i antybiotyku (ale nie środka przeciwgrzybiczego) oraz prowadzenie perfuzji z znacznie mniejszą prędkością, około 10μl na minutę. Na koniec napowietrzamy tlenem pożywkę hodowlaną dostarczaną do komory perfuzyjnej.</li>
</ol>
7. Reprezentatywne wyniki:
Na koniec naszego protokołu wideo przedstawiamy przykład obrazowania na żywo w rozwijających się komórkach fotoreceptorów z wykorzystaniem preparacji opisanej w Sekcji 5. Preparacja ta wykorzystuje transgenezę Drosophila do specyficznej dla danych komórek ekspresji reporterów fluorescencyjnych. W pokazanym przykładzie dwa reportery fluorescencyjne są ekspresowane pod kontrolą specyficznego dla fotoreceptorów sterownika GMR-Gal48: myrRFP znakowany błonowo oraz marker endosomalny 2xFYVE-GFP9. Dwukanałowe zestawy danych 3D o obszarze obrazowania 70x70x17.5μm i rozmiarze woksela 137x137x700nm (512x512x26) pozyskiwano co 1 min. Film przedstawia wybraną płaszczyznę w czasie w tym 4D zbiorze danych, co ujawnia dynamikę wewnątrzkomórkowego transportu endosomalnego oraz zdarzenia fuzji pęcherzyków. Reprezentatywne obrazy dla utrwalonych preparatów tkanki oka i lamina znajdują się na Ryc. 3.

<ol><li>Stewart, B. A., Atwood, H. L., Renger, J. J., Wang, J., Wu, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+stability+of+Drosophila+larval+neuromuscular+preparations+in+haemolymph-like+physiological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Improved stability of Drosophila larval neuromuscular preparations in haemolymph-like physiological solutions.</a> J Comp Physiol A. 175 (2), 179-191 (1994).</li>
<li>Walther, R. F., Pichaud, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescent+staining+and+imaging+of+the+pupal+and+adult+Drosophila+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescent staining and imaging of the pupal and adult Drosophila visual system.</a> Nat Protoc. 1, 2635-2642 (2006).</li>
<li>Fischbach, K. F., Hiesinger, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+lobe+development%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Optic lobe development.</a> Adv Exp Med Biol. 628, 115-136 (2008).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+-+A+Laboratory+Handbook%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Drosophila - A Laboratory Handbook.</a> , Cold Spring Harbor Press. Cold Spring Harbor, New York. (2005).</li>
<li>Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+preparing+Drosophila+embryos+for+electrophysiological+recording+and+other+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Borlinghaus, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRT+letter%3A+high+speed+scanning+has+the+potential+to+increase+fluorescence+yield+and+to+reduce+photobleaching%5BTitle%5D)+AND+%22Microsc+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">MRT letter: high speed scanning has the potential to increase fluorescence yield and to reduce photobleaching.</a> Microsc Res Tech. 69, 689-692 (2006).</li>
<li>Ayaz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+injury+and+regeneration+in+the+adult+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Axonal injury and regeneration in the adult brain of Drosophila.</a> J Neurosci. 28 (23), 6010-6021 (2008).</li>
<li>Freeman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reiterative+use+of+the+EGF+receptor+triggers+differentiation+of+all+cell+types+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye.</a> Cell. 87 (4), 651-660 (1996).</li>
<li>Wucherpfennig, T., Wilsch-Brauninger, M., Gonzalez-Gaitan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Drosophila+Rab5+during+endosomal+trafficking+at+the+synapse+and+evoked+neurotransmitter+release%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release.</a> J Cell Biol. 161, 609-624 (2003).</li>
<li>Merzlyak, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((monomeric+red+fluorescent+protein+with+an+extended+fluorescence+lifetime%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">monomeric red fluorescent protein with an extended fluorescence lifetime.</a> Nat Methods. 4 (7), 555-557 (2007).</li>
<li>Ng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+of+olfactory+information+between+three+populations+of+neurons+in+the+antennal+lobe+of+the+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Transmission of olfactory information between three populations of neurons in the antennal lobe of the fly.</a> Neuron. 36 (3), 463-474 (2002).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Cooper, M. T., Bray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Frizzled+regulation+of+Notch+signalling+polarizes+cell+fate+in+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Frizzled regulation of Notch signalling polarizes cell fate in the Drosophila eye.</a> Nature. 397 (6719), 526-530 (1999).</li>
<li>Cook, T., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+subtype+specification%3A+from+flies+to+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor subtype specification: from flies to humans.</a> Semin Cell Dev Biol. 12 (6), 509-518 (2001).</li>
<li>Gurskaya, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li>
<li>Reinke, R., Krantz, D. E., Yen, D., Zipursky, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaoptin%2C+a+cell+surface+glycoprotein+required+for+Drosophila+photoreceptor+cell+morphogenesis%2C+contains+a+repeat+motif+found+in+yeast+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chaoptin, a cell surface glycoprotein required for Drosophila photoreceptor cell morphogenesis, contains a repeat motif found in yeast and human.</a> Cell. 52 (2), 291-301 (1988).</li>
<li>Richardt, A., Rybak, J., Stortkuhl, K. F., Meinertzhagen, I. A., Hovemann, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ebony+protein+in+the+Drosophila+nervous+system%3A+optic+neuropile+expression+in+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Ebony protein in the Drosophila nervous system: optic neuropile expression in glial cells.</a> J Comp Neurol. 452 (1), 93-102 (2002).</li>
<li>Beronja, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+function+of+Drosophila+Sec6+in+apical+exocytosis+of+epithelial+photoreceptor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Essential function of Drosophila Sec6 in apical exocytosis of epithelial photoreceptor cells.</a> J Cell Biol. 169 (4), 635-646 (2005).</li>
<li>Mehta, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+Drosophila+sec15+reveal+a+function+in+neuronal+targeting+for+a+subset+of+exocyst+components%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mutations in Drosophila sec15 reveal a function in neuronal targeting for a subset of exocyst components.</a> Neuron. 46 (2), 219-232 (2005).</li>
</ol>

Sondy fluorescencyjne użyte do obrazowania
W niniejszym opracowaniu opisujemy zalety i ograniczenia preparacji systemu wzrokowego Drosophila dla wybranych sond fluorescencyjnych z trzech klas: (1) sond dodawanych egzogennie do preparatu z żywej tkanki; (2) białek fluorescencyjnych kodowanych genetycznie, stosowanych zarówno w obrazowaniu żywych, jak i utrwalonych tkanek; (3) barwników fluorescencyjnych dodawanych do utrwalonej tkanki w celu przeprowadzenia immunohistochemii.
1. Sondy egzogenne:
Lysotracker Green DND-26 lub Red DND-99 (Invitrogen, Inc.) Są to dostępne komercyjnie fluorescencyjne związki przenikające przez błony, które gromadzą się w silnie zakwaszonych przedziałach komórkowych, przede wszystkim w lizosomach, późnych endosomach i autofagosomach. Lysotracker w stężeniach nanomolowych (zazwyczaj stosujemy 50 nM) w pełni przenika przez tarczkę oka L3 i P+20% w czasie krótszym niż jedna minuta. Ponieważ Lysotracker stale się gromadzi i wykazuje efekt alkalizujący, obrazowanie przeprowadzamy w czasie krótszym niż 5 minut. W przeciwieństwie do tarczek oka, Lysotracker nie przenika do mózgu bez przerwania ciągłości tkanki. Jednak ostrożne przerwanie zewnętrznej błony pozwala na przenikanie na głębokość kilku średnic komórek w płacie wzrokowym.
Lysosensor DND-189 (Invitrogen, Inc.) W przeciwieństwie do Lysotrackera, Lysosensor nie gromadzi się w zakwaszonych przedziałach, lecz wykazuje zwiększoną fluorescencję przy niskim pH. Lysosensor posiada właściwości penetracyjne bardzo podobne do Lysotrackera. Stosujemy Lysosensor w stężeniu 1μM.
2. Sondy kodowane genetycznie:
W przypadku wielu eksperymentów z obrazowaniem na żywo ekspresujemy geny znakowane różnymi cząsteczkami fluorescencyjnymi, takimi jak GFP, TagRFP10 lub czułym na pH pHluorin11, pod kontrolą binarnego systemu ekspresji Gal4/UAS12. Linie Gal4 wykazujące ekspresję w rozwijających się fotoreceptorach obejmują GMR-Gal4 (wszystkie fotoreceptory)8 oraz mDelta0.5-Gal4 (rozwijające się R4 i R7)13. Istnieje kilka linii sterujących Gal4 specyficznych dla poszczególnych podtypów, które wykorzystują różne promotory rodopsyny14. Szczególnie użytecznymi sondami fluorescencyjnymi w obrazowaniu na żywo są białka fotokonwertowalne. Z powodzeniem zastosowaliśmy Dendra2, monomerowe białko fotokonwertowalne z zielonego na czerwony15. Należy zauważyć, że Dendra2 została zaprojektowana do fotokonwersji przy użyciu linii lasera argonowego o długości fali 488nm. Jednakże, przy użyciu naszej aparatury nie byliśmy w stanie przeprowadzić konwersji za pomocą widzialnego niebieskiego światła, zarówno w konwencjonalnym, jak i rezonansowym trybie skanowania konfokalnego. W przeciwieństwie do tego, konwersja za pomocą lasera UV 405nm jest efektywna.
3. Immunohistochemia:
W przypadku utrwalonego oka dorosłego osobnika do wizualizacji struktury rhabdomerycznej często wybieramy rodaminową falloidynę (Invitrogen, Inc.) lub przeciwciało anty-Chaoptin (przeciwciało specyficzne dla fotoreceptorów16) (Ryc. 1A). Dobrą metodą analizy struktury wkładów lamina jest połączenie przeciwciał anty-chaoptin16, markera glejowego anty-ebony17 oraz anty-sec618 (Ryc. 1B). Jak pokazano na Ryc. 3, ta kombinacja przeciwciał pozwala rozróżnić główne wypustki presynaptyczne (chaoptin) i postsynaptyczne (sec6), a także gleję nabłonkową (ebony) w lamina19.
Montaż komory perfuzyjnej
Do obrazowania na żywo wykorzystujemy komorę perfuzyjną, która umożliwia powolną wymianę roztworów bez zakłócania preparatu tkankowego. Demonstracja montażu komory perfuzyjnej została zawarta w filmie oraz przedstawiona schematycznie na Rysunku 2. Montaż komory perfuzyjnej zilustrowano na Rys. 2A. Należy rozpocząć od położenia uszczelki na próbce, a następnie kontynuować montaż zgodnie z instrukcją. Celem uszczelki jest stworzenie przestrzeni między podstawą komory a pokrywą – przestrzeni, w której tkanka zostaje uszczelniona i przez którą będzie przepływał roztwór. Przestrzeń wewnątrz uszczelki musi obejmować wlot (tutaj wprowadzany jest roztwór), preparat tkankowy oraz wylot, przez który roztwór opuszcza komorę. Kluczowe są dwie cechy uszczelki: po pierwsze, musi być ona wystarczająco gruba dla mózgu, a jednocześnie na tyle cienka, aby umożliwić obrazowanie za pomocą soczewki o wysokiej rozdzielczości. Idealna grubość uszczelki zależy od parametrów specyficznych dla danej konfiguracji. Po drugie, wcięcie w uszczelce tworzy komorę, która pozwala pęcherzykowi powietrza przejść bez kontaktu z próbką (Rys 2B).
Obrazowanie pod mikroskopem
Do komory perfuzyjnej wykorzystujemy obiektyw imersyjny glicerynowy 63x (apertura 1,3), a bezpośrednio w medium hodowlanym na szkiełku – obiektyw imersyjny wodny 63x. Obiektywy glicerynowe zapewniają większą odległość roboczą niż obiektywy olejowe. Stosujemy rezonansowy konfokalny mikroskop skanujący, który skanuje z znacznie większą prędkością niż skaner konwencjonalny (odpowiednio 8000 Hz w porównaniu do 1400 Hz). Skanowanie rezonansowe umożliwia trójwymiarowe rejestracje w czasie przy wyższych częstotliwościach odświeżania klatek. Ponadto szybsze prędkości skanowania znacząco redukują fototoksyczność laserową6, co jest kluczowe przy wielokrotnych skanowaniach żywych tkanek. Należy osiągnąć równowagę między intensywnością lasera a napięciem PMT (wzmocnieniem), aby zmaksymalizować sygnał przy jednoczesnej minimalizacji szumu i fotobleachingu. Ważnym dodatkowym aspektem jest to, że stopień oddziaływania lasera na dany obszar jest określony przez rozdzielczość i powiększenie (zoom). Na przykład wybrany obszar jest skanowany z taką samą rozdzielczością przy ustawieniach 256x256, zoom 2x, jak i przy 512x512, zoom 1x, jednak maksymalna możliwa prędkość obrazowania na żywo jest 4-krotnie większa przy 256x256, zoom 2x. Aby zarejestrować aktywność szybko przemieszczających się przedziałów wewnątrzkomórkowych, z powodzeniem stosowaliśmy następujące ustawienia: 5 klatek na stos z (z-stack) przy częstotliwości jednego stosu z na 10 sekund, z prędkością skanowania 8000 Hz i dwukrotnym uśrednianiem linii (2x line averaging). Podczas długich sesji obrazowania trwających wiele godzin często zmniejszamy częstotliwość klatek do jednej na kilka minut i wybieramy większe obszary, ponieważ preparat jest bardziej podatny na przesunięcia.
Drosophila Anatomia układu wzrokowego
Rysunek 3 przedstawia anatomię oka dorosłej muchy Drosophila (Rys. 3A), mózgu dorosłego osobnika (Rys. 3B) oraz kompleksu tarczy oka i mózgu poczwarki w stadium 20% -25% (Rys. 3C). Rysunek 3A ilustruje oko dorosłego osobnika z przytwierdzoną laminą i komórkami tłuszczowymi oraz bez nich. Podczas sekcji oka dorosłego osobnika laminę, która znajduje się w centrum oka, osadzoną w zagłębieniu utworzonym przez ciała komórek fotoreceptorów (po lewej), należy usunąć w taki sposób, aby nie naruszyć znajdujących się pod nią ciał komórkowych (po prawej). W przypadku sekcji mózgu dorosłego osobnika powinno być możliwe rozróżnienie ciał komórek fotoreceptorów, laminy, płata optycznego, mózgu centralnego oraz tchawki (Rys. 3B). Do przeprowadzenia tej sekcji konieczne jest usunięcie fotoreceptorów i tchawki, przy jednoczesnym pozostawieniu laminy przytwierdzonej do płata optycznego. Aby ułatwić identyfikację kompleksu tarczy oka i mózgu poczwarki w stadium 20-25%, na Rysunku 3C przedstawiono obraz z żywego organizmu.
<img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig1.jpg" alt="Schemat anatomii układu nerwowego przedstawiający mózg, płat wzrokowy, ciała komórek; sekcja lamina, fotoreceptory." data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. (A) mózg osobnika dorosłego. (B) oko osobnika dorosłego. (C) kompleks tarczy oka/mózgu w stadium poczwarki (20%-25%).
<img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig2.jpg" alt="Schemat układu mikroprzepływowego z przepływem próbki, obiektywem, wlotami, wylotami, pompą, uszczelką i podstawą." data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. (A) Montaż komory perfuzyjnej oraz (B) rozmieszczenie uszczelki względem próbki.
<img src="/files/ftp_upload/1936/1936fig3.jpg" alt="Obrazy z mikroskopii fluorescencyjnej; struktury komórkowe, markery zielone/czerwone, porównanie eksperymentalne." data-altupdatedat="1754907495000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. (A) Barwienie rhabdomerów u osobników dorosłych z użyciem przeciwciał anty-chaoptin. (B) Barwienie lamina u osobników dorosłych z użyciem przeciwciał anty-chaoptin (zielone, fotoreceptory), anty-ebony (czerwone, glej) oraz sec6 (niebieskie, interneurony).

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td>103251252</td><td></td></tr><tr><td>GluShield</td><td>GluStitch, Inc.</td><td>GB055QO</td><td></td></tr><tr><td>20-hydroksyekdyzon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5142-10mg</td><td>5 mg/ml w EtOH</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;tytuł_jove&quot;&gt;Specjalistyczny sprzęt:&lt;/p&gt;&lt;ol&gt;&lt;li&gt;Stereomikroskop do sekcji: Leica Mz12.5 z kamerą cyfrową&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Konfokalny mikroskop z tandemowym skanerem Leica TCS SP5 do konwencjonalnego i rezonansowego obrazowania żywych tkanek&lt;mózg/&gt; mikroskopia obrazująca, w tym lasery niebieski (488 nm), zielony (561 nm), pomarańczowy (594 nm) i dalekiej czerwieni (633 nm), a także specjalistyczne obiektywy 63x/1,4 w glicerynie oraz 63x/1,3 w wodzie.&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Komora do obrazowania konfokalnego RC-30 oraz pompa perystaltyczna model 720 firmy Harvard Instruments&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Sutter Pipette puller P-97&lt;/li&gt;&lt;li&gt;Oprogramowanie: Amira 5.2, Visage Imaging&lt;/li&gt;&lt;/ol&gt;</td></tr></tbody></table>

przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek drosophila do obrazowania na żywo

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

TheDrosophilaMózg i układ wzrokowy są powszechnie wykorzystywanymi układami modelowymi do badania rozwoju, funkcji i degeneracji neuronów. W niniejszej pracy przedstawiamy trzy preparaty mózgu i układu wzrokowego, które obejmują zakres od kompleksu tarczy oka i mózgu w rozwijających się poczwarkach, po oddzielną dyssekcję oka i mózgu u dorosłych much. Wszystkie protokoły zostały zoptymalizowane pod kątem hodowli żywych preparatów. Przedstawiamy jednak również warunki dla immunohistochemii tkanek utrwalonych, tam gdzie jest to możliwe. Na koniec prezentujemy warunki obrazowania na żywo dla tych preparatów z wykorzystaniem konwencjonalnego i rezonansowego obrazowania konfokalnego 4D w komorze perfuzyjnej. Wspólnie protokoły te stanowią podstawę do obrazowania na żywo w różnych skalach czasowych – od funkcjonalnych testów wewnątrzkomórkowych w skali minut, po procesy rozwojowe lub degeneracyjne w skali wielu godzin.

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Mózg i układ wzrokowy Drosophila są szeroko wykorzystywanymi systemami modelowymi do badania rozwoju, funkcji i degeneracji neuronów. Przedstawiamy tutaj trzy...

W tym filmie zaprezentuję, jak przygotować preparaty mózgu i siatkówki do obrazowania na żywo oraz immunohistochemii, ze szczególnym uwzględnieniem fotoreceptorów. Najpierw pokażę, jak przygotować się do sekcji mózgu. Następnie zademonstruję trzy różne rodzaje sekcji: mózgu dorosłego osobnika, siatkówki dorosłego osobnika oraz rozwijającego się oka.W każdym z tych przypadków tkankę można utrwalić do badań immunohistochemicznych lub obrazować na żywo. Na koniec opiszę sposób obrazowania żywych tkanek i zaprezentuję kilka przykładów obrazowania żywych komórek z wykorzystaniem konfokalnej mikroskopii skanującej z rezonansowym skanerem. Przejdźmy zatem do szczegółów.Do sekcji tkanek potrzebne są ostre pęsety. Używając bloku ostrzącego lub bardzo drobnoziarnistego papieru ściernego, delikatnie przesuwaj pęsetę w przód i w tył z każdej strony, aż końce się spotkają. W przypadku pęset z cienkim czubkiem stosujemy standardny kamień ostrzący.Nie będę tutaj omawiać techniki ostrzenia, ale zaznaczę, że ostre pincety są niezbędne do sekcji żywych organizmów. W przypadku sekcji mózgów dorosłych osobników ostrzymy pincety codziennie. Umieść muchy na podkładce z CO2 w celu ich znieczulenia i wyselekcjonuj pożądany genotyp.W przypadku preparowania źrenic, należy po prostu sięgnąć do fiolki i ostrożnie wyjąć źrenicę za pomocą pęsety, uważając, aby nie uszkodzić jej otoczki. Zwinąć chusteczkę typu Kimwipe i zwilżyć ją wodą. Będzie ona wykorzystywana podczas preparowania do oczyszczania pęsety z zanieczyszczeń.Umieść naczynie do sekcji na stole stereomikroskopu i napełnij je roztworem HL 3. Wszystkie sekcje będą przeprowadzane w roztworze HL 3, aby zapewnić żywotność i zdrowie tkanki podczas procedury sekcji. Dodatkowo, preferuję używanie naczynia do sekcji z dnem pokrytym Sylguardem, aby chronić pęsety podczas pracy.Następnie należy przygotować roztwór utrwalający. Jeśli planują Państwo przeprowadzić immunohistochemię, należy odmierzyć 180 µL HL 3 do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 500 µL.Dodaj 20 µL 37% formaldehydu, aby uzyskać 3,7% roztwór formaldehydu. Na koniec, odpowiednie ułożenie dłoni jest kluczowe dla prawidłowego przeprowadzenia sekcji; właściwa pozycja dłoni zapewni stabilność pęsety i umożliwi wykonywanie kontrolowanych, precyzyjnych ruchów.Najpierw przyłóż pęsetę do boku kciuka, a następnie skieruj palec wskazujący prosto w dół tak, aby jego opuszka spoczywała na górze. Teraz oprzyj bok pęsety o bok palca środkowego i przesuń dłoń w stronę naczynia do sekcji. Dotknij naczynia kciukiem i palcem środkowym, opierając oba te palce o jego krawędź.Oprzyj nadgarstek o stolik mikroskopu. W ten sposób uzyskasz trzy punkty stabilnego podparcia o powierzchnie podczas sekcji, co umożliwi wykonywanie jedynie bardzo precyzyjnych manipulacji pęsetą.Na podkładce z CO2. Ułóż dorosłą muchę grzbietem do dołu, tak aby głowa była skierowana w stronę przeciwną do dłoni. Chwyć tułów tuż poniżej głowy.Przy prawidłowym wykonaniu, podczas obserwacji pod stereomikroskopem, odnóża i proboscis wysuną się; należy chwycić wysunięty proboscis pęsetą i odciąć głowę, odrzucić ciało, a następnie zanurzyć głowę. Należy ponownie ustawić ostrość na zanurzonej głowie. Cała sekcja zostanie przeprowadzona w roztworze.Bardzo ważne jest, aby przez cały czas trzymać głowę za pomocą pęsety. W przeciwnym razie głowa wypłynie na powierzchnię. Należy pamiętać, że odzyskanie pływającej głowy jest zawsze trudne.Jeśli podczas sekcji głowa wyjdzie poza obszar ostrości, należy ją po prostu przesunąć z powrotem do płaszczyzny ogniskowej, nie regulując mikroskopu. To pozornie proste zadanie może być na początku trudne, ale utrzymywanie głowy w ostrości stanie się z czasem łatwiejsze. Sekcję należy rozpocząć od rozerwania tkanki łącznej pomiędzy proboscis a okiem.Rozrywaj tkankę oka, trzymając je przez cały czas mocno przynajmniej jedną pęsetą. Upewnij się, że końcówka pęsety znajduje się tuż pod siatkówką lub skórką. Aby uniknąć uszkodzenia znajdującego się poniżej mózgu, naprzemiennie operuj lewą i prawą stroną.Używając pęsety, odrywaj siatkówkę, kierując się w stronę tyłu głowy. Oderwanie siatkówki zwiększy szansę na to, że lamina pozostanie przytwierdzona do płata wzrokowego. W trakcie tej sekcji kontynuuj pracę wokół tyłu głowy, odrywając po drodze kutykulę, przerwij przez drugie oko i zacznij usuwać kutykulę.Dopóki chwytasz kutykulę, masz pewność, że nie zgniatasz mózgu. Pamiętając o tym, kontynuuj oddzielanie kutykuli i siatkówki, aż odsłonisz mózg. Gdy mózg będzie widoczny, możesz przystąpić do usuwania przymocowanych do niego tchawic; kontynuuj usuwanie kutykuli i tchawic, aż mózg zostanie odizolowany.W tym momencie należy ponownie skupić się na dnie naczynia, aby wykonać pozostałe kroki obrazowania zakończeń fotoreceptorów. Pożądalne jest zachowanie warstwy lamina, jednak konieczne jest usunięcie siatkówki, która zawiera ciała komórek oraz silnie autofluorescencyjny pigment. Aby to osiągnąć, należy ostrożnie odciągnąć pozostałości krzaczastych ciał komórkowych, nie uszkadzając przy tym warstwy lamina.Jest to bardziej precyzyjna umiejętność, która wymaga praktyki. Usuń pozostałą tchawicę. Ponieważ w przeciwnym razie mózg mógłby wypłynąć podczas nocnych przemywań przeciwciałami, dorosły mózg można utrzymać przy życiu przez wiele godzin, a nawet całą noc, stosując warunki, które omówię w sekcji siódmej. W przypadku immunohistochemii dorosły mózg jest teraz gotowy do utrwalenia w formaldehydzie.Za pomocą pipety P 20 ustawionej na 5 µL przenieś mózg osobnika dorosłego do wcześniej przygotowanego roztworu utrwalającego. Kontynuuj sekcję mózgów osobników dorosłych przez 20 minut, co powinno pozwolić na uzyskanie od 4 do 10 mózgów. Pozostaw mózgi w utrwalaczu na kolejne 40 minut.Czas ten może się jednak różnić. Aby uzyskać optymalne barwienie przeciwciałem pierwszorzędowym, należy usunąć roztwór formaldehydu i przemyć mózgi trzykrotnie po pięć minut za każdym razem, używając 400 µL roztworu zawierającego PBS i 0,4% TRITON X 100, zwanego dalej PBS Triton. Po całkowitym wypłukaniu utrwalającego roztworu można dodać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego.Rozpocznij tę sekcję zgodnie z opisem dla mózgu dorosłego osobnika. Po zanurzeniu głowy i ponownym ustawieniu ostrości mikroskopu, zacznij od rozerwania tkanki łącznej między trąbkiem a okiem powyżej trąbka. Oddziel kutykulę od oka. Następnie, używając jednej pęsety, oddziel kutykulę od dolnej strony oka, przesuwając się w kierunku tyłu głowy.Podczas tej sekcji chwyć środek tylnej części głowy. Dopuszczalne jest zmiażdżenie mózgu drugą pęsetą. Chwyć oko i rozsuń tkanki.Pozostaw oko do czasu, aż osiądzie na dnie naczynia. Blaszka (lamina) prawdopodobnie nadal będzie przylegająca do oka i może zostać wykorzystana do obrazowania na żywo zakończeń fotoreceptorów z całkowicie nienaruszonych komórek fotoreceptorowych. Kolejne trzy sekcje wyjaśniają, jak przygotować oko do immunohistochemii.W celu przeprowadzenia immunohistochemii przenieść oko do roztworu utrwalającego. Używając pipety P 20 ustawionej na 5 µL, kontynuować preparowanie oczu dorosłych osobników przez łącznie 10 minut. Pozostawić oczy w utrwalaczu na kolejne 30 minut.Usunąć utrwalający roztwór i przeprowadzić przemycia zgodnie z opisem w sekcji dotyczącej sekcji mózgu dorosłego osobnika. Jeśli celem jest obrazowanie struktury materiałowej oka, należy je usunąć. Następnie przełożyć utrwalone oczy z powrotem do naczynia do sekcji i usunąć wszelkie pozostałe fragmenty tchawicy lub komórki tłuszczowe.Następnie, przytrzymując zewnętrzną część oka jedną pęsetą, usuń blaszkę drugą pęsetą. Powinna ona oddzielić się w jednym kawałku, odsłaniając znajdujące się pod nią ciała komórek. Należy uważać, aby chwytać wyłącznie blaszkę; w przeciwnym razie istnieje ryzyko oddzielenia ciał komórek od siatkówki.Używając pipety P 20, przenieś oczy do 400 µL PBS z Tritonem w probówce o pojemności 500 µL. Delikatnie kołysz nimi w temperaturze 4 °C przez noc, aby usunąć autofluorescencyjny czerwony pigment z fotoreceptorów. Następnego dnia można odrzucić roztwór płuczący i dodać przeciwciało pierwszorzędowe do obrazowania na żywo oczu dorosłych bez lamina.Używamy wyłącznie dorosłych much z linii ferret, które znajdują się w późnym stadium pociekowym tuż przed wykluciem. Na tym etapie ciała komórek fotoreceptorowych oddzielają się od zakończeń w blaszce (lamina) podczas preparowania much ferret. Dorosłe pocieki mają wyraźnie zarysowane skrzydła, oczy oraz kutykulę widoczną przez pocieczkę.Wybierz poczwarkę i zanurz ją w roztworze HL 3. Usuń przednią część pochewki poczwarki, aby odsłonić region głowy. Ostrożnie usuń cienką błonę wewnętrzną, która dodatkowo otacza rozwijającą się muchę.Chwyć podstawę głowy pęsetą i pociągnij. Pozostałą część poczwarki wyrzuć, utrzymując głowę zanurzoną. Postępuj zgodnie z opisem sekcji oka do immunohistochemii w stadium dorosłym dla gatunku fer rate.Jednak ciała komórek fotoreceptorowych będą łatwiej oddzielać się od lamina, co umożliwi obrazowanie ciał komórkowych zatopionych w siatkówce. Ponadto lamina pozostaje przytwierdzona do płata optycznego, co pozwala na obrazowanie dystalnej części lamina. Jeśli chcą Państwo obrazować proksymalną część lamina, w której widoczne są kartridże końcowe fotoreceptorów, należy przeprowadzić sekcję oka na dorosłej muszce, u której lamina jest mocniej przytwierdzona do oka.Rozwijający się dysk oka w 20% rozwoju poczwarki stał się w naszym laboratorium preferowanym obiektem do obrazowania na żywo. Wynika to z faktu, że ta pojedyncza warstwa stosunkowo dużych, rozwijających się komórek jest łatwo obserwowalna przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Aby wybrać poczwarkę w stadium 20%, należy szukać kanalików Ian — zielonej plamki pojawiającej się pod pokrywą poczwarki — i unikać osobników z ciemnym ciałem, które formuje się po 20% rozwoju poczwarki.Po wybraniu poczwarki zanurz ją w roztworze HL three w naczyniu do sekcji i ostrożnie usuń przednią część torebki poczwarki, uważając, aby nie przebić cienkiej wewnętrznej błony. Chwyć wewnętrzną błonę pęsetą i rozchyl ją.Uważnie przeszukaj uwolnione treści, aby odnaleźć rozwijający się mózg oraz krążki oczne, które są dość wyraźne. Wyizoluj mózg znajdujący się na dnie naczynia sekcyjnego. Ostrożnie oddziel mózg centralny od płata optycznego.Kompleks tarczy płata optycznego I zostanie wykorzystany do obrazowania na żywo. Jeśli chcą Państwo przeprowadzić obrazowanie przez krótki czas w tylko jednym lub dwóch roztworach, można obrazować tkankę na szkiełku przedmiotowym. W takim przypadku należy przygotować szkiełko, pokrywając najpierw jego powierzchnię preparatem Sylgard zgodnie z instrukcją producenta.Nanieś 20 µL buforu HL three na środek szkiełka. Przenieś wypreparowaną tkankę w dodatkowych 20 µL buforu HL three na szkiełko. Tkanka nie może zostać wystawiona na działanie powietrza.Dodatkowo należy unikać jakichkolwiek naprężeń lub obciążeń wynikających z posługiwania się pipetą. W przypadku obrazowania na żywo tkanka musi być stabilnie zamocowana. Należy przygotować elektrodę szklaną, taką jak te wyciągane do rejestracji elektrofizjologicznej.Odłam końcówkę i wypełnij koniec klejem, wykorzystując ujemne ciśnienie powietrza wytwarzane ustami; odłam tylko tyle elektrody, aby klej mógł wniknąć do środka. Następnie wykorzystaj nadciśnienie, aby nałożyć niewielką ilość kleju na osłonę progu pod kroplę HL three. Teraz szybko umieść tkankę na kleju, zachowując pożądaną orientację do obrazowania na żywo.Do obrazowania można teraz użyć obiektywu imersyjnego z wodą. Jeśli chcą Państwo dodać barwnik przenikający przez błony, można go dodać do kąpieli. Podczas obrazowania przez dłuższy czas lub w celu całkowitej bądź wielokrotnej wymiany roztworów, stosujemy komorę perfuzyjną podłączoną do pompy perystaltycznej, która powoli perfunduje roztwór hodowlany nad żywą tkanką.Użyj szkiełka nakrywkowe pokrytego kroplą sylgardu, który został zeszlifowany, aby był cienki i płaski. Nanieś 20 µL HL three na środek nakrywki. Przesuń i przyklej żywą tkankę do sylgardu.Przygotuj uszczelkę, która umożliwi przedostanie się pęcherzyków powietrza poza komorę, nie narażając żywej tkanki na kontakt z powietrzem. Uszczelka powinna być na tyle gruba, aby uniknąć zmiażdżenia tkanki, ale jednocześnie na tyle cienka, by tkanka znajdowała się blisko obiektywu mikroskopu konfokalnego. Zmontuj komorę perfuzyjną, dbając o to, aby tkanka była przez cały czas całkowicie zanurzona.Wymiany roztworów mogą być przeprowadzane z prędkością do 100 µL na minutę. W przypadku obrazowania trwającego wiele godzin może być konieczne dodanie 20 hydroxy Dyson oraz antybiotyku, ale nie leku przeciwgrzybiczego, a perfuzję należy przeprowadzać z znacznie mniejszą prędkością, wynoszącą około 10 µL na minutę. Ponadto napowietrzamy tlenem pożywkę hodowlaną, która zasila pompę perystaltyczną.Posiadają Państwo teraz wszystkie umiejętności niezbędne do pomyślnego przeprowadzenia sekcji mózgu i siatkówki drozozfila. Mogą również Państwo obrazować żywe, rozwijające się prążki oka lub fotoreceptory dorosłych osobników. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

preparation-developing-adult-drosophila-brains-retinae-for-live

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie rozwijających się i dorosłych mózgów i siatkówk Drosophila do obrazowania na żywo

W niniejszej pracy opisujemy protokół badania migracji komórek glejowych do rozwijającego się oka Drosophila za pomocą analizy mikroskopowej żywych tkanek z wykorzystaniem komórek glejowych znakowanych GFP.

Obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w tarczceImaginal oka Drosophila

Przedstawiono prostą, niedrogą i skuteczną metodę przygotowania embrionów Drosophila do analizy za pomocą obrazowania na żywo. Nasz protokół zapewnia wilgotność i wymianę gazową oraz nie powoduje kompresji embrionu Drosophila. Metoda ta jest odpowiednia do obrazowania na żywo embrionów Drosophila w oparciu o GFP z wykorzystaniem stereomikroskopu lub pionowego mikroskopu złożonego.

Przygotowanie zarodków Drosophila do obrazowania na żywo z wykorzystaniem protokołu wiszącej kropli

W niniejszym materiale przedstawiono standardowe podejście do przygotowania oczu dorosłych osobników Drosophila do wykonywania półcienkich przekrojów oraz analizy pod mikroskopem świetlnym. Protokół ten może być stosowany do ogólnej analizy morfologicznej wad oka lub, po wprowadzeniu wskazanych modyfikacji, do określania wymagań genetycznych genów w konkretnych typach komórek oka (np. analiza klonalna fotoreceptorów) bądź do analizy pod mikroskopem elektronowym.

Przygotowanie oczu dorosłych osobników Drosophila do cienkiego krojenia i analizy mikroskopowej

Komora jajowa Drosophila stanowi doskonały model do badania mechanizmów lokalizacji mRNA. Aby uchwycić dynamiczne zdarzenia leżące u podstaw procesów lokalizacji, wymagane jest szybkie obrazowanie tkanek żywych w wysokiej rozdzielczości. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół preparatyki i obrazowania żywych próbek przy minimalnej ingerencji w ich strukturę.

Przygotowanie pojedynczych komór jajeczkowych Drosophila do obrazowania na żywo

Ten film opisuje metodę montażu nienaruszonych mózgów dorosłych much pod zjeżdżalnią mostkową i pokazuje protokół wykonywany na immunologicznie barwionych mózgach do mikroskopii fluorescencyjnej.

Montowanie mózgów dorosłych Drosophila: metoda przygotowania szkiełek do obrazowania konfokalnego

Źródło: Hellerman, M. B., et al. Obrazowanie na żywo Drosophila Oko poczwarki. J. Vis. exp. (2015){{TAG_ 28}}Film demonstruje technikę obrazowania na żywo do badania wzorców oczu u poczwarki Drosophila melanogaster. Markery znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) umożliwiają wizualizację organizacji i różnicowania komórek podczas tworzenia rozwijającej się struktury oka.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Ten protokół opisuje trzy kroki przygotowania płatów wzrokowych larw i dorosłych Drosophila do obrazowania: 1) preparacje mózgu, 2) immunohistochemia i 3) montaż. Nacisk położono na krok 3, ponieważ do wizualizacji określonych struktur płatów optycznych wymagane są różne orientacje montażowe.

Rozwarstwienie, immunohistochemia i montaż mózgów larw i dorosłych osobników Drosophila w celu wizualizacji płata wzrokowego

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Prezentujemy metodę specjalnie dostosowaną do obrazowania całego mózgu dorosłego Drosophila podczas zachowania i w odpowiedzi na bodźce. Głowa jest ustawiona tak, aby umożliwić optyczny dostęp do całego mózgu, podczas gdy mucha może poruszać nogami i czułkami, czubkiem trąbki, a oczy mogą odbierać bodźce czuciowe.

Przygotowanie dorosłego osobnika Drosophila melanogaster do obrazowania całego mózgu podczas reakcji na zachowanie i bodźce

Naucz się przygotowywać mózgi i siatkówki Drosophila do obrazowania na żywo i immunohistochemii. Protokół obejmuje preparaty dorosłych tkanek oraz rozwijających się dysków oka z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Przeglądaj więcej filmów