Name: Mikroiniekcja zarodków Medaka do wykorzystania jako modelowy organizm genetyczny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-22T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 25 s
Description: Poznaj technikę mikroiniekcji zarodków medaka w celu analizy funkcji genów w modelu kręgowca. Metoda ta umożliwia badanie ekspresji białek na poziomie pojedynczej komórki in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta była wspierana przez grant z MRC.

1. Kojarzenie i zbieranie jaj
<ol>
 <li>Samicie i samce medaka można łatwo rozróżnić po rozmiarze i kształcie płetw odbytniczych oraz grzbietowych. Płetwy odbytnicze u samców są większe i mają kształt równoległoboku w porównaniu do płetw u samic. Płetwa odbytnicza samicy jest mniejsza i ma kształt trójkąta. Płetwa grzbietowa samca posiada wyraźnie widoczną głęboką wcięcie między dwoma ostatnimi promieniami.</li>
 <li>Medaka składają do 40 jaj każdego dnia; samice noszą jaja zgrupowane przy brzuchu za pomocą nici przylepnych przez kilka godzin, zanim zostaną one przyczepione do roślin w zbiorniku.</li>
 <li>Samicą można złapać w siatkę i delikatnie przytrzymać z obu stron jedną ręką. Następnie, palcem wskazującym drugiej ręki, można delikatnie oddzielić jaja od brzucha. Samicę można wówczas zwrócić do zbiornika. Jaja należy przenieść do szalki Petriego o średnicy 6 cm wypełnionej pożywką dla embrionów za pomocą pęsety tępej lub palca.</li>
 <li>Pary medaka rzadko walczą, gdy są trzymane w małym pojemniku do rozrodu. Dzięki temu mogą przebywać w jednym małym zbiorniku z przepływem wody, co umożliwia ich karmienie oraz codzienne zbieranie jaj od tej samej pary przez kilka miesięcy.</li>
 <li>Ważne jest, aby nie trzymać samic bez samców, ponieważ u samic medaka owulacja zachodzi codziennie. W przeciwnym razie samice nie mogą złożyć jaj i zapadają na choroby.</li>
</ol>
2. Oczyszczanie embrionów
<ol>
 <li>Przenieś niezgrupowane jaja za pomocą szklanej pipety na papier ścierny (gradacja p2000, wodoodporny) umieszczony w pokrywce płytki Petriego o średnicy 9 cm. Usuń nadmiar medium, upewniając się jednocześnie, że pozostała wystarczająca objętość, aby zapobiec wysuszeniu embrionów.</li>
 <li>Delikatnie tocz embriony po papierze ściernym za pomocą palca wskazującego, wywierając minimalny nacisk i trzymając palec równolegle do powierzchni papieru ściernego przez około 45-60 sekund, aby usunąć część włosków z zewnętrznej powierzchni chorionu. Nie tocz więcej niż 5-7 embrionów jednocześnie — ta ostrożność zminimalizuje ryzyko zmiażdżenia embrionów pod sobą.</li>
 <li>Przenieś oczyszczone embriony do nowej płytki z medium do embrionów.</li>
</ol>
3. Przygotowanie płytek agarozowych do unieruchomienia embrionów podczas mikroinkiekcji
Zarodki podczas iniekcji są utrzymywane w rynienkach wykonanych z formy z pleksiglasu w 1,5% agarozie (Rysunek 1). Stężenie agarozy jest kluczowe dla właściwego unieruchomienia zarodków.
<ol>
 <li>Najpierw należy przygotować ramkę z agarozy do utrzymania formy z pleksiglasu. Wlej 1,5% agarozę w wodzie do głębokości 0,5 cm do szalki Petriego o średnicy 9 cm i poczekaj, aż całkowicie stężeje. Wytnij w agarozie obszar nieco większy niż rozmiar formy.</li>
 <li>Wlej 1,5% agarozę, aby wypełnić wycięty obszar, a następnie umieść w niej formę w taki sposób, aby nie uwięziono pęcherzyków powietrza, i poczekaj, aż agaroza stężeje. Taka płytka agarozowa może być przechowywana w lodówce w celu przyspieszenia procesu stygnięcia.</li>
 <li>Usuń formę, aby stworzyć wgłębienia do utrzymania jaj. Dodaj wystarczającą ilość medium dla embrionów, aby zanurzyć formę, przykryj i przechowuj w temperaturze 4°C do momentu użycia. 
 <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig1.jpg" alt="Równowaga statyczna; wzór kratowy na podłożu; schemat z wymiarami; układ naukowy." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
 
 Rysunek 1. Schemat wykonanej na zamówienie formy używanej do przygotowania wgłębień w płytkach agarozowych do mikroiniekcji.</li>
</ol>
4. Mikroiniekcja embrionów medaka
W przypadku medaki DNA, RNA, oligonukleotydy morfolinowe oraz barwniki śledzące są wstrzykiwane za pomocą mikroiniekcji przez chorion do cytoplazmy zarodka w stadium od 1 do 64 komórek, a nie do żółtka, jak ma to miejsce u danio pręgowanego. Ponieważ cytoplazma u medaki jest mniejsza i mniej widoczna, w celu opanowania tej techniki zaleca się ćwiczenia poprzez wstrzykiwanie barwników, takich jak rodamanina-dekstran. Zaleca się również dodanie czerwieni fenolowej jako znacznika, aby umożliwić potwierdzenie wykonania iniekcji.
Ponieważ chorion otaczający embriony medaki jest twardy, wymagana jest krótka, mocna i szeroka igła do iniekcji (Rysunek 2). Należy przygotować taką mocną i szeroką igłę do iniekcji z kapilary szklanej zawierającej włókno.
<ol>
 <li>Przygotować roztwór do iniekcji z czerwienią fenolową jako znacznikiem i załadować go do igły od tyłu za pomocą mikroładarki Eppendorf. Podłączyć igłę do wstrzykiwacza z pompką powietrzną.</li>
 <li>Jaja należy zebrać i rozdzielić jak najszybciej po zapłodnieniu, aby przeprowadzić iniekcję w stadium jednej komórki. Można zainiekować więcej embrionów, przechowując je na lodzie (nie dłużej niż 30 minut), aby zatrzymać podziały komórkowe. 
 <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig2.jpg" alt="Porównanie zwężeń w mikrofluidyce, obraz mikroskopowy, hydrodynamika, analiza mikrokapilarna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
 
 Rysunek 2. Porównanie igieł do medaki i danio pręgowanego. Należy zauważyć, że końcówka igły MF (na górze) jest krótsza i szersza, a zatem mocniejsza, co ułatwia przebicie twardego chorionu otaczającego embriony medaki.</li>
 <li>Przenieść jaja na płytkę z agarozą i ułożyć je w rowkach za pomocą pęsety. Tuż przed iniekcją pięć jaj należy obrócić tak, aby igła mogła uderzyć prostopadle w błonę komórkową cytoplazmy jednej komórki. Cytoplazmę jednej komórki można zidentyfikować, szukając obszaru pozbawionego małych kropelek tłuszczu, który znajduje się po przeciwnej stronie jaja niż miejsce z największym zagęszczeniem kropelek tłuszczu. Zidentyfikowany obszar można potwierdzić jako cytoplazmę, oglądając go z boku.</li>
 <li>Umieścić igłę blisko jaj. Otworzyć końcówkę igły, delikatnie dotykając jej chorionu lub używając mikropęsety (Rysunek 3). Powinien być widoczny wypływ niewielkiej ilości substancji do iniekcji.</li>
 <li>Przebić chorion, aby umieścić końcówkę igły w jego wnętrzu. Ustawić ciśnienie podtrzymujące wstrzykiwacza na stosunkowo wysoką wartość, aby zapobiec refluksowi wynikającemu z wysokiego ciśnienia podczas przebijania twardego chorionu (ustawienia 80-100hPA dla ciśnienia podtrzymującego i 500-700hPA dla ciśnienia iniekcji).</li>
 <li>Wprowadzić końcówkę igły do cytoplazmy, gwałtownie przebijając jej błonę. 
 
 Unikać wprowadzania końcówki igły do żółtka. W przeciwieństwie do danio pręgowanego, materiał wstrzyknięty do żółtka nie zostanie przeniesiony do cytoplazmy. Płyny wstrzyknięte do żółtka mają wyraźną granicę, natomiast w cytoplazmie granica ta jest rozmyta (Rysunek 4). 
 
 Sporadycznie igła może zostać zablokowana przez agarozę lub zanieczyszczenia. Można użyć pęsety, aby dotknąć/ponownie rozbić koniec igły i usunąć blokadę. Jeśli igła pęknie w dowolnym momencie podczas iniekcji, w medium dla embrionów pojawią się pęcherzyki powietrza, a wstrzykiwana substancja zostanie utracona. Iniekcje należy przeprowadzać systematycznie od góry do dołu wzdłuż kanałów agarozy oraz od lewej do prawej strony formy.</li>
 <li>Zainiekowane embriony należy przenieść do czystej szalki zawierającej medium dla embrionów i inkubować w odpowiedniej temperaturze. 
 <img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig3.jpg" alt="Schemat procesu mikroiniekcji; metoda krok po kroku wprowadzania do komórek za pomocą pipety." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
 
 Rysunek 3. Rozbijanie końcówki igły przed iniekcją. 1: Przesunięcie końcówki igły blisko chorionu embrionu; 2: Dotknięcie chorionu i delikatne poruszanie igłą w przód i w tył w celu rozbicia końcówki; 3: Wypływ niewielkiej ilości substancji do iniekcji z końca igły potwierdza rozbicie końcówki.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/1937/1937fig4.jpg" alt="Porównanie mikroiniekcji zarodka; prawidłowa i nieprawidłowa, stadia rozwojowe, obrazy mikroskopowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Reprezentatywne obrazy iniekcji zarodków medaki. Panel A przedstawia reprezentatywny obraz prawidłowej iniekcji rhodamine-dextranu do cytoplazmy zarodka medaki w stadium jednego komórki. Panel B przedstawia reprezentatywny obraz nieprawidłowej iniekcji rhodamine-dextranu do pęcherzyka żółtkowego zarodka medaki w stadium jednej komórki. Panele C i D przedstawiają zarodki z paneli A i B odpowiednio około 30 godzin po iniekcji. EM: zarodek; w panelach C i D góra to część przednia, widok od strony grzbietowej. Należy zauważyć, że ciało zarodka w panelu D nie jest czerwone, ponieważ barwnik został nieprawidłowo wstrzyknięty do pęcherzyka żółtkowego. Strzałki w panelach B i D wskazują rhodamine-dextran wstrzyknięty nieprawidłowo do pęcherzyka żółtkowego – zwróć uwagę na wyraźną kolistą granicę. Linie przerywane w panelach A i B wskazują obrys cytoplazmy w stadium jednej komórki, widok z boku.

<ol><li>Furutani-Seiki, M., Sasado, T., Morinaga, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+genome-wide+screen+for+mutations+affecting+organogenesis+in+Medaka%2C+Oryzias+latipes%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">A systematic genome-wide screen for mutations affecting organogenesis in Medaka, Oryzias latipes.</a> Mech Dev. 121, 647-658 (2004).</li>
<li>Furutani-Seiki, M., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medaka+and+zebrafish%2C+an+evolutionary+twin+study%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Medaka and zebrafish, an evolutionary twin study.</a> Mech. Dev. 121, 629-6237 (2004).</li>
</ol>

W tym filmie prezentujemy metodę wstrzykiwania markerów komórkowych, mRNA, DNA lub oligonukleotydów antysensownych do embrionów medaki w stadium jednego komórki. Technika ta pozwoliła nam badać różne procesy rozwojowe in-vivo w czasie rzeczywistym. Proces ten oraz umożliwiana przez niego szczegółowa analiza mają potencjał do znaczącego pogłębienia naszej wiedzy na temat organogenezy kręgowców i leżącej u jej podstaw biologii komórki. Wiedza ta może być istotna i przynieść zastosowania terapeutyczne w medycynie regeneracyjnej.

<table><tbody><tr><td>Siatka o gęstym splotcie 4&quot;</td><td>Narzędzia</td><td>J K Aquatics Ltd.</td><td>MD001</td><td>Używana do odłowu ryb podczas pozyskiwania ikry.</td></tr><tr><td>Pożywka dla embrionów</td><td>Odczynnik</td><td>Własny wyrób</td><td></td><td>200ml 50X roztwór zapasowy, 1ml 1% błękitu metylenowego w H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O/10 litrów wody RO (roztwór zapasowy 50X: NaCl 14.7g, KCl 0.6g, CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 2.4g, MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O 4.0g/1 litr wody RO).</td></tr><tr><td>Drobnoziarnisty wodoodporny papier ścierny - gradacja p2000</td><td>Narzędzia</td><td>Hermes Abrasives Ltd.</td><td></td><td>Bardzo drobna gradacja do rolowania/czyszczenia embrionów z chorionami.</td></tr><tr><td>Kapilary z borokrzemianowego szkła</td><td>Narzędzie</td><td>Harvard Apparatus</td><td>GC100-10F</td><td>Do wytwarzania igieł do mikroiniekcji.</td></tr><tr><td>Wytwornica mikropipet (puller)</td><td>Urządzenie</td><td>Narishige International</td><td>Model PP-830</td><td>Do wytwarzania igieł do mikroiniekcji.</td></tr><tr><td>Mikronapełniacz Eppendorf</td><td>Narzędzie</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Do napełniania igieł do mikroiniekcji.</td></tr><tr><td>Aparat do mikroiniekcji</td><td>Urządzenie</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Model 5242.</td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Urządzenie</td><td>Narishige International</td><td></td><td>Model MN151.</td></tr><tr><td>Agarozowa płytka do iniekcji</td><td>Narzędzia</td><td>Własny wyrób</td><td></td><td>Do unieruchamiania embrionów podczas iniekcji.</td></tr></tbody></table>

mikroiniekcja embrionów ryby medaka w celu zastosowania jako modelowego organizmu genetycznego

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

W tym filmie prezentujemy technikę mikroiniekcji do embrionów medaki w stadium jednokomórkowym. Medaka to mała, słodkowodna ryba składająca jaja, która umożliwia prowadzenie analiz genetycznych i embriologicznych i jest jednym z organizmów modelowych kręgowców, w których przeprowadzono badania przesiewowe mutantów w skali całego genomu w oparciu o fenotyp 1, podobnie jak u danio pręgowanego oraz myszy. Różnice w nakładaniu się funkcji pokrewnych genów u medaki i danio pręgowanego pozwalają na identyfikację nowych fenotypów, których nie można wykryć u jednego gatunku 2, dzięki czemu medaka i danio pręgowany są komplementarne w badaniach genetycznych funkcji genomu kręgowców.
Aby wykorzystać fakt, że embriony ryb medaka są przezroczyste i rozwijają się zewnętrznie, mikroiniekcja stanowi niezbędną technikę do wprowadzania znaczników komórkowych w celu etykietowania komórek, mRNA lub oligonukleotydów antysensownych w celu nadekspresji i wyciszania interesujących genów, a także DNA w celu tworzenia linii transgenicznych.

Medaka i zebrafish są komplementarne w kontekście genetycznej analizy funkcji genomu kręgowców. Niniejszy protokół podkreśla kluczowe punkty niezbędne do skutecznego mikroiniekcji do embrionów medaka, co stanowi istotną technikę w analizach embriologicznych i genetycznych z wykorzystaniem medaka i zebrafish w warunkach laboratoryjnych.

Mikroiniekcja embrionów ryby medaka w celu zastosowania jako modelowego organizmu genetycznego

W niniejszym filmie prezentujemy technikę mikroiniekcji do embrionów medaki w stadium jednokomórkowym. Medaka to mała, słodkowodna ryba składająca jaja, która umożliwia ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest określenie funkcji białka genowego poprzez zakłócenie normalnych wzorców ekspresji badanego genu lub białka. Osiąga się to najpierw poprzez wykonanie formy agarozowej oraz igieł do wstrzykiwania. Drugim krokiem procedury jest pobranie embrionów w stadium jednej komórki.Trzecim krokiem procedury jest odpowiednie zorientowanie embrionów w stadium jednej komórki w celu przygotowania ich do iniekcji. Ostatnim etapem procedury jest wstrzyknięcie znaczników komórkowych, mRNA lub oligonukleotydów antysensownych do embrionów midar w stadium jednej komórki. Ostatecznie wyniki można uzyskać poprzez obserwacje mikroskopowe, które wykażą zmiany morfologiczne, fizjologiczne lub molekularne związane z białkiem poddanym wpływowi wstrzykniętej substancji.Witam, nazywam się Sean Brazinski i reprezentuję laboratorium dr Makoto Fuki w Katedrze Biologii i Biochemii na Uniwersytecie w Bath. Jestem członkiem zespołu dr Fuki. Dzisiaj przedstawimy procedurę mikroiniekcji zarodków Medaka z użyciem znaczników komórkowych, mRNA oraz oligonukleotydów antysensownych.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania funkcji genu zainteresowania in vivo na poziomie pojedynczej komórki. Zatem przejdźmy do pracy. W przeciwieństwie do danio pręgowanego, osobniki męskie i żeńskie maka można łatwo rozróżnić po ich dymorficznych płetwach.Płetwy samic mają okrągły kształt z gładką krawędzią. Zarówno płetwa odbytnicza, jak i grzbietowa samca są większe niż u samicy, a płetwa grzbietowa posiada głębokie wcięcie między dwiema ostatnimi promieniami. Parę rozrodczą meca należy utrzymywać w zbiorniku tarłowym z przepływem wody lub bez niego.Ryby te mogą być utrzymywane w zbiorniku z przepływem wody przez okres do dwóch miesięcy. W przypadku codziennej inkubacji, samica może składać do 40 jaj dziennie, które gromadzą się w okolicy brzucha, przytwierdzone za pomocą nitek przylepnych. Należy użyć siatki, aby wyłowić samicę ze zbiornika, a następnie przytrzymać rybę jedną ręką, aby zabezpieczyć ją wewnątrz siatki. Jaja należy delikatnie oddzielić, używając palca wskazującego.Przenieś samicę z powrotem do zbiornika. Za pomocą pęsety lub palca wskazującego przenieś jaja do szalki Petriego o średnicy 6 cm wypełnionej pożywką dla embrionów. Pod mikroskopem stereoskopowym, używając dwóch pęset, przetnij nitki mocujące i rozdziel skupiska jaj.Za pomocą pipety Pasteura pobrać embriony, aby oddzielić je od odchodów i glonów, a następnie przenieść maksymalnie 40 jaj do naczynia z nowym pożywką do embrionów. Jeśli mikroiniekcje mają być wykonane natychmiast, umieścić jaja na lodzie. Alternatywnie można regulować tempo rozwoju w późniejszych stadiach poprzez zmiany temperatury inkubacji.Do przygotowania płytek agarozowych służących do unieruchamiania embrionów podczas iniekcji wymagana jest forma z pleksiglasu. Szczegóły znajdują się w pisemnej części niniejszego protokołu. Wlej 0,5 cm 1,5% agarozy w wodzie do dziewięciocentymetrowej szalki Petriego.Po zestaleniu agarozy, wycinamy obszar nieco mniejszy niż forma, aby zapobiec jej zapadaniu się do dna. Wypełniamy wycięty obszar dodatkową 1,5% agarozą i umieszczamy nad nim formę z pleksiglasu. Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza podczas zestalania agarozy.Zazwyczaj zdejmuje się formę, aby utworzyć rowki. Przykrywa się Aris podłożem dla embrionów. Przykrywa się szalkę i przechowuje w temperaturze 4 °C do momentu użycia.Przygotować szeroką igłę iniekcyjną z kapilary szklanej zawartej w filamencie. Za pomocą mikroloadera napełnić igłę od tyłu roztworem do iniekcji, zawierającym czerwony fenol jako znacznik, a następnie podłączyć igłę do stojaka z wtryskiwaczem pompowanym pneumatycznie. Ustawić zestaw obok mikroskopu stereoskopowego.Przenieś jaja na odpowiednim etapie rozwoju na płytkę do iniekcji. Aby zatrzymać rozwój podczas przeprowadzania iniekcji pod mikroskopem stereoskopowym, embriony można przechowywać w lodzie do 30 minut. Za pomocą pęsety ułóż od siedmiu do 10 jaj w każdej rynience.Obrócić jaja tak, aby igła do iniekcji uderzała w nie prostopadle. Jedna komórka embrionu znajduje się naprzeciwko kropel oleju. Zatem kropla oleju powinna być zorientowana w lewo, tak aby komórka znajdowała się po prawej stronie w celu wykonania iniekcji.Kwas nukleinowy i barwniki śledzące są mikroiniekcyjne przez chorion do cytoplazmy zarodka, a nie do żółtka. W przypadku danio pręgowanego należy zbliżyć igłę do jaj. Dotknij końcówką igły chorionu lub użyj mikropincety, aby przebić końcówkę igły tak, by niewielka ilość roztworu wstrzykiwanego wypłynęła z jej końca.W przypadku zablokowania igłę należy ponownie złamać, przebić materiał Corian i przesunąć końcówkę igły wstrzykującej tuż za wewnętrzną warstwę, aby zmniejszyć prawdopodobieństwo refluksu do igły. Ciśnienie podtrzymujące wstrzykiwacza należy precyzyjnie ustawić w zakresie od około 80 do 100 hektopaskali. Przebić membranę i wprowadzić igłę do cytoplazmy.Wykonaj iniekcję zarodka. Obejrzyj zarodek z boku, aby potwierdzić równomierne rozprzestrzenienie wstrzykniętego materiału w cytoplazmie. Płyny prawidłowo wstrzyknięte do cytoplazmy mają rozmyte granice; materiał wstrzyknięty zbyt głęboko w żółtko ma wyraźną granicę i nie zostanie przeniesiony do cytoplazmy.Przenieś wstrzyknięte zarodki do czystego naczynia z podłożem dla zarodków i pozostaw je do rozwoju zgodnie z wymaganiami w inkubatorze o odpowiedniej temperaturze. Panel A przedstawia reprezentacyjne zdjęcie prawidłowego wstrzyknięcia rodaminy dekstranu do cytoplazmy zarodka Meca w stadium jednej komórki. Panel B przedstawia reprezentacyjne zdjęcie nieprawidłowego wstrzyknięcia rodaminy dekstranu do pęcherzyka żółtkowego zarodka Meca w stadium jednej komórki. Linie przerywane wskazują obrys cytoplazmy jednej komórki.Panele C i D przedstawiają odpowiednio embriony z paneli A i B w około 30 godzin po iniekcji. Należy zauważyć, że ciało embrionu na panelu D nie jest czerwone, ponieważ barwnik został błędnie wstrzyknięty do pęcherzyka żółtkowego. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób mikroiniekcji kwasów nukleinowych lub znaczników do embrionów o ciemniejszym zabarwieniu w stadium jednej komórki.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zarodek znajdował się w odpowiednim stadium rozwoju, co jest niezbędne do pomyślnego przeprowadzenia iniekcji. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

microinjection-of-medaka-embryos-for-use-as-a-model-genetic-organism

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikroiniekcja zarodków Medaka do stosowania jako modelowego organizmu genetycznego

Mikroiniekcja jest uznaną i skuteczną metodą wprowadzania obcych substancji do zapłodnionych embrionów danio pręgowanego. W niniejszej pracy prezentujemy niezawodną technikę mikroiniekcji służącą do przeprowadzania badań nad nadekspresją mRNA oraz wyciszaniem genów za pomocą morfolino oligonukleotydów u danio pręgowanego.

Mikroiniekcja mRNA i morfolinoowych oligonukleotydów antysensownych w embriony ryb danio pręgowanych.

W niniejszym filmie pokazano, w jaki sposób morpholino lub mRNA można wstrzyknąć do embrionów zebrafish w stadium jednej komórki, aby obniżyć lub zwiększyć poziom produktów konkretnych genów podczas dalszego rozwoju.

Mikroiniekcja embrionów ryb danio w celu analizy funkcji genów

Ze względu na twardy chorion i delikatne embriony, manipulacja zarodkami medaki jest bardziej skomplikowana niż w przypadku danio prążkowanego. W tym filmie zaprezentowano krok po kroku procedury manipulacji embrionami medaki, w tym usuwanie chorionu (dechorionację), unieruchamianie w agarozie do obrazowania oraz transplantację komórek w celu wytworzenia chimer. Procedury te są niezbędne do wykorzystania medaki i danio prążkowanego w laboratorium, aby w pełni skorzystać z ich komplementarnych...

Dechorionizacja zarodków ryby medaka i transplantacja komórek w celu generowania chimer

Ten film opisuje technikę mikroiniekcji zarodka w celu dostarczenia związków do woreczka z żółtkiem danio pręgowanego.

Mikroiniekcja zarodka: technika dostarczania związku do żółtka danio pręgowanego

Mikroiniekcja jest powszechną techniką używaną do dostarczania konstruktów DNA, mRNA, oligonukleotydów antysensownych morfolino lub innych zabiegów do jaj, embrionułów i komórek różnych gatunków.

Wysokoprzepustowe mikroiniekcje zygot jeżowców

Metody tworzenia morfujących zarodków są niezbędne do badania mechanizmów rozwojowych i sieci regulacji genów.  Gwiazda morska Patiria miniata jest wyłaniającym się systemem modelowym dla tych badań.  W tym miejscu przedstawiamy protokół pozyskiwania gamet, produkcji kultur zarodków oraz szybkiej mikroiniekcji zygot tego gatunku.

Metoda mikroiniekcji zygot Patiria minata

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

Małe ryby laboratoryjne stały się popularnymi modelami do badań nad mechanizmami leżącymi u podstaw zaburzeń kości u ludzi oraz do badań przesiewowych leków modulujących kości. W niniejszym raporcie opisano protokół oceny wpływu alendronianu na komórki kostne larw medaka ze zmianami osteoporotycznymi.

Leczenie farmakologiczne i obrazowanie in vivo interakcji osteoblast-osteoklast w modelu osteoporozy ryb Medaka

Przedstawiono prosty i skuteczny protokół mikroiniekcji do edycji genów w zarodkach sumów kanałowych za pomocą systemu CRISPR/Cas9. W tym protokole przewodnikowe RNA i białko Cas9 zostały mikrowstrzyknięte do żółtka jednokomórkowych zarodków. Protokół ten został zweryfikowany poprzez wyeliminowanie dwóch genów związanych z odpornością suma kanałowego.

Mikroiniekcja białka CRISPR/Cas9 do suma kanałowego, Ictalurus punctatus, zarodków do edycji genów

Ten artykuł opisuje dwie szybkie i skuteczne metody pobierania nasienia od małego modelu rybnego medaka (Oryzias latipes), a także protokół wiarygodnej oceny jakości nasienia za pomocą wspomaganej komputerowo analizy nasienia (CASA).

Pobieranie nasienia i komputerowa analiza nasienia w modelu teleost japońskiej Medaka (Oryzias latipes)

Poznaj technikę mikroiniekcji zarodków medaka w celu analizy funkcji genów w modelu kręgowca. Metoda ta umożliwia badanie ekspresji białek na poziomie pojedynczej komórki in vivo.

Mikroiniekcja embrionów ryby medaka w celu zastosowania jako modelowego organizmu genetycznego

Przeglądaj więcej filmów