Bezpośrednie wkraplanie substancji rozpuszczonych przez tchawicę do płuc myszy
August 29th, 2010
Wkraplanie dotchawicze dostarcza substancje rozpuszczone bezpośrednio do płuc. Procedura ta ma na celu dostarczenie wkroplonego materiału do dystalnych obszarów płuc i dlatego jest często uwzględniana w badaniach mających na celu badanie pęcherzyków płucnych. Zapewniamy szczegółowy protokół przeżycia do wykonywania wkropleń dotchawiczych u myszy.
W tej procedurze substancje rozpuszczone mogą być dostarczane bezpośrednio do płuc. Najpierw wystrzel tchawicę. Usuń futro z małego gryzonia i wykonaj małe nacięcie w pobliżu przedniej części szyi.
Odsłoń tchawicę. Użyj jednej mililitrowej igły podskórnej, aby wkroplić trzy mikrolitry roztworu na gram masy ciała przez tchawicę. Wyjąć strzykawkę i zszyć ranę.
Cześć, nazywam się Dr.Ma Helms i pracuję na Wydziale Fizjologii Uniwersytetu Emory. Cześć, nazywam się dr Mauricio Rojas z Wydziału Medycyny Uniwersytetu Emory. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę bezpośredniego wkraplania substancji rozpuszczonych do dystalnych części płuc.
Rutynowo stosujemy tę procedurę w moim laboratorium do badania klirensu płynu płucnego w odpowiedzi na kilka różnych zakroplonych związków, i używamy tej techniki w moim laboratorium do dostarczania bli. Tworzenie samca myszy z uszkodzeniem płuc. Bezpośrednia instalacja substancji rozpuszczonych w płucach małych gryzoni może być przydatna w twoich badaniach.
Więc zacznijmy. W ramach przygotowań do operacji mysz jest początkowo znieczulana izofluorem, a następnie uspokajana dootrzewnowym wstrzyknięciem mieszaniny ksylazyny i ketaminy. Wykonaj uszczypnięcie palca u nogi, aby potwierdzić, że zwierzę jest w pełni znieczulone.
Następnie użyj elektrycznej maszynki do golenia, aby zgolić sierść z obszaru operacyjnego. Aby usunąć pozostałe włosy, nałóż grubą warstwę kremu do depilacji na obszar operacyjny. Pozostaw krem do depilacji na trzy minuty, a następnie zetrzyj sierść i krem wilgotnym ręcznikiem.
Przetrzyj obszar operacyjny 70% alkoholem, a następnie użyj peelingu chirurgicznego Betadine. Aby aseptycznie przygotować zwierzę. Zwierzę jest teraz gotowe do operacji.
Aby rozpocząć procedurę instalacji dotchawiczej, umieść znieczulone zwierzę na pochyłej desce chirurgicznej. Wykonaj małe nacięcie w pobliżu przedniej części szyi lub gardła. Użyj kleszczy, aby odepchnąć platysmę, a następnie wykonaj nacięcie na przednich mięśniach tchawicy.
Umożliwi to wizualizację i dostęp do pierścieni tchawicy. Po odsłonięciu tchawicy należy podać odpowiednią ilość nawozu za pomocą jednomililitrowej igły podskórnej i strzykawki. Trzymać strzykawkę skośnie do góry i równolegle do tchawicy i wstrzyknąć całą objętość leku do tchawicy.
Typowa objętość wstrzyknięcia dotchawniczego wynosi trzy mikrolitry na gram masy ciała. Wyjąć strzykawkę z tchawicy. Zwierzę może zareagować sapaniem, po zainstalowaniu solu w płucach.
Wprowadzenie powietrza przez strzykawkę i obserwacja, czy płuca się rozszerzają, również potwierdzi, że intubacja się powiodła. Zamknij nacięcie czterema nylonowymi szwami. Chwycić igłę, zanurzyć najgrubszą część igły, w której materiał szewny jest przymocowany za pomocą uchwytu na igłę, wbić się w skórę końcówką igły pod kątem 90 stopni, w odległości około jednego do trzech milimetrów od krawędzi rany.
W zależności od grubości skóry, chwycić wychodzącą igłę po jednym przejściu przez tkankę. Proste szwy, indywidualnie kiwane, skutecznie zamkną ranę, pokazane oto kilka reprezentatywnych wyników instalacji dotchawiczych. To pierwsze zdjęcie pokazuje udaną instalację fluorescencyjnego związku science-fiction 0,5 sprzężonego z dekstryną w płucu sześciu czarnych myszy.
Jednoczesna rejestracja sygnału SCI 5,5 ze zdjęciem rentgenowskim potwierdza, że barwnik fluorescencyjny jest kierowany przede wszystkim do płuc i jest równomiernie rozprowadzany bezpośrednio po instalacji. W przeciwieństwie do tego, ten drugi obraz pokazuje wynik w słabo zaszczepionej myszy. Sygnał fluorescencyjny w przewodzie pokarmowym bezpośrednio po zabiegu wskazuje, że przełyk został przypadkowo zaintubowany podczas zabiegu.
Właśnie pokazaliśmy, jak bezpośrednio wkraplać substancje rozpuszczone do dystalnych części płuc. Kiedy wykonujesz tę lub jakąkolwiek inną procedurę, ważne jest, aby postępować zgodnie z wytycznymi własnej instytucji dotyczącymi wykorzystywania zwierząt w badaniach. Więc to wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół do wykonywania insulacji dotchawiczych u myszy, umożliwiający bezpośrednie wprowadzanie substancji do płuc. Metoda ta jest szczególnie przydatna do kierowania na dalsze regiony płuc, w tym do pęcherzyków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Fizjologia oddychania
- Modele zwierzęce
Tło
- Insulacja dotchawicza to technika stosowana do wprowadzania substancji bezpośrednio do płuc.
- Metoda ta jest często wykorzystywana w badaniach koncentrujących się na funkcji i patologii płuc.
- Zrozumienie mechanizmów wprowadzania może poprawić badania nad chorobami układu oddechowego.
- Protokoły takich procedur są niezbędne do zapewnienia powtarzalności w badaniach.
Cel badania
- Aby zapewnić szczegółowy protokół przeżywalności dla insulacji dotchawiczych u myszy.
- Aby ułatwić badania nad funkcją pęcherzyków i dostarczaniem leków.
- Aby ulepszyć metodologię badań nad oddychaniem.
Stosowane metody
- Przygotowanie zwierzęcia poprzez usunięcie futra i wykonanie nacięcia.
- Odsłonięcie tchawicy dla bezpośredniego dostępu.
- Użycie strzykawki do wprowadzenia określonej objętości roztworu na podstawie masy ciała.
- Zszycie nacięcia po zabiegu, aby zapewnić dobrostan zwierzęcia.
Główne wyniki
- Protokół umożliwia efektywne wprowadzanie substancji do płuc.
- Bezpośrednia insulacja kieruje się na pęcherzyki, zwiększając możliwości badawcze.
- Demonstruje niezawodną metodę dla przyszłych badań nad fizjologią oddechową.
- Zapewnia ramy dla podobnych ustawień eksperymentalnych w innych badaniach.
Wnioski
- Insulacja dotchawicza jest cenną techniką w badaniach nad płucami.
- Właściwy protokół zapewnia bezpieczeństwo i skuteczność zabiegu.
- Ta metoda może znacząco przyczynić się do zrozumienia chorób układu oddechowego.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Direct tracheal instillation enables precise delivery of test compounds to the distal lung, supporting mechanistic studies of alveolar function and pulmonary drug disposition. This survival procedure allows repeated measurements in the same animal, improving data consistency and reducing animal use in early discovery. It provides a reproducible platform for evaluating lung-targeted therapeutics, surfactants, gene therapies, and infectious agents in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables functional interrogation of pulmonary targets by delivering agonists, antagonists, or silencing agents directly to alveolar compartments.
- Operational Value: Supports dose-response characterization with controlled instillate volumes (typically 30-75 μL) based on animal weight.
- Predictive Value: Facilitates target de-risking through direct observation of physiological responses such as lung fluid clearance or injury markers.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantifiable lung deposition and distribution data via co-localization with imaging modalities (e.g., fluorescent tracers and X-ray).
- Operational Value: Standardizes solute delivery across animals, minimizing variability from upper respiratory tract deposition or procedural error.
- Assay Readiness: Confirms successful instillation through real-time visualization of lung expansion or post-procedure signal distribution, enabling assay validation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Value: Models human lung exposure scenarios for inhaled therapeutics, particulates, or pathogens by bypassing upper airway filtration.
- Preclinical Continuity: Supports longitudinal studies due to animal survival, allowing serial bronchoalveolar lavage, imaging, or functional testing.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes on-target lung effects from systemic or gastrointestinal exposure, as demonstrated by signal mislocalization in misinstilled animals.
Pipeline & Workflow Integration
This method fits within the discovery continuum from target validation through lead optimization, particularly for pulmonary programs requiring alveolar-specific delivery.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about lung-specific pathways by isolating the lung as the primary site of solute action.
- Screening: Delivers compounds with precision to enable reliable comparison of test articles in dose-ranging or time-course studies.
- Analytics: Generates quantitative endpoints such as fluorescence intensity in lung tissue, clearance rates, or injury biomarkers for cross-condition comparison.
- Translational Research: Connects in vitro findings to whole-lung physiology in a disease-relevant system, supporting IND-enabling studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized surgical procedure that can be shared across departments studying respiratory pharmacology, toxicology, or infectious disease.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases confidence in target engagement by reducing off-target delivery artifacts.
- Operational Value: Enhances reproducibility through weight-based dosing and standardized incision, instillation, and suturing steps.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early lung-specific efficacy and safety signals.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted investment in lung-targeted modalities by validating delivery to the alveolar space.
Implementation Considerations
- Requires training in rodent surgical techniques, including tracheal exposure and suturing.
- Dependent on sterile field preparation, anesthesia monitoring, and post-operative analgesia.
- Necessitates calibration of instillate volume to avoid volutrauma or osmotic imbalance.
- Must account for animal strain and sex-based variations in lung anatomy and response.
- Limited to survival studies; not suitable for acute terminal endpoints unless recovery phase is irrelevant.
