Eksperymentalny test przerzutów
24 sierpnia 2010
Ten artykuł opisuje procedury eksperymentalnego testu przerzutowego, który jest używany do określenia potencjału przerzutowego ludzkich linii komórek rakowych.
Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest przetestowanie zdolności przerzutowych ludzkich komórek nowotworowych poprzez iniekcje do żyły ogonowej. U myszy z niedoborem odporności komórki są przygotowywane do wstrzyknięcia. Komórki są następnie wstrzykiwane myszom z niedoborem odporności, które po jednym do dwóch miesięcy generują przerzuty do płuc.
Myszy są poddawane sekcji, a przerzuty do płuc są oznaczane ilościowo i hodowane. Wyniki tego typu testów wskazują na zakres przerzutów określonego typu komórki nowotworowej. Cześć, nazywam się Sonali Mohanty i pracuję w laboratorium Dr.LE na Wydziale Genetyki Biomedycznej Uniwersytetu w Rochester.
Dziś pokażemy Ci procedurę wykonywania eksperymentalnego testu przerzutowego. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania przerzutów raka. Więc zacznijmy.
Zacznij od komórek wyhodowanych do około 70% płynności Co, odessaj pożywkę z płytki i delikatnie umyj raz jednym XPBS. Następnie dodaj dwa mililitry 0,05% odwrócenia trypsyny. Delikatnie kołysz płytką, aby ułatwić odłączenie komórek.
Obserwuj komórki pod mikroskopem, gdy się odłączają. Dodaj dużą ilość nośnika zawierającego FBS, aby wygasić podróże w aktywności. Następnie przenieś do 50-mililitrowej tuby.
Policz komórki za pomocą hemocytometru. Po ustaleniu stężenia odwirować pod ciśnieniem około 200-krotności grawitacji przez trzy minuty, nie naruszając osadu komórkowego. Ostrożnie usuń pożywkę Resus, zawieszając odpowiednią objętość roztworu buforowego wagi Hanka lub HBSS, aby osiągnąć końcowe stężenie około pięć razy 10 do sześciu komórek na mililitr.
Następnie przefiltruj przez sitko Falcona o średnicy 70 mikrometrów. Aby wykluczyć agregaty dużych komórek, umieść końcówkę pipety bezpośrednio na filtrze, umieszczonym nad pięciomililitrową probówką hodowlaną. Szybko wyrzuć zawiesinę przez filtr do rurki.
Policz komórki ponownie, używając błękitu trianowego, aby określić żywotność. Żywotność powinna być większa niż 90% przed wstrzyknięciem. Następnie rozcieńczyć do końcowego stężenia 2,5 razy 10 do sześciu komórek na mililitr.
Trzymaj na lodzie. Delikatnie chwyć ogon myszy z niedoborem odporności i wciągnij ją do ogranicznika myszy plecami do szczeliny i ogonem wystającym z małego otworu z tyłu. Powoli wsuń pierścień do środka wzdłuż szczeliny.
Gdy pierścień złapie usta myszy, zablokuj go na miejscu. Mysz nie powinna być w stanie poruszać się swobodnie, ale powinna mieć normalne tempo oddychania. Znajdź główne żyły ogonowe.
W ogonie myszy znajdują się cztery główne naczynia krwionośne. Tętnice znajdują się po grzbietowej i brzusznej stronie ogona. Żyły znajdują się po bocznych stronach.
Pobrać co najmniej 200 mikrolitrów przygotowanych komórek do jednomililitrowej strzykawki. Zamocuj połówkę igły o rozmiarze 30 i wypchnij wszelkie pęcherzyki powietrza. Ostateczna objętość w strzykawce powinna wynosić 200 mikrolitrów.
Przygotować się do wstrzyknięcia w dystalny koniec ogona. Jeśli więc pierwsza próba się nie powiedzie, do drugiej próby można użyć bardziej proksymalnego obszaru ogona. Po przetarciu miejsca wstrzyknięcia 70% etanolem, pociągnij ogon prosto.
Trzymać końcówkę kciukiem i podeprzeć punkt wstrzyknięcia palcem wskazującym. Wbić igłę do żyły i wstrzyknąć komórki. Podczas wstrzykiwania należy upewnić się, że igła i strzykawka są ustawione równolegle do żyły.
W przeciwnym razie igła przebije się przez ścianę naczynia, a komórki zostaną wstrzyknięte do sąsiednich tkanek ogona. Wycofaj igłę, jeśli procedura przebiegła pomyślnie. Krew powinna uchodzić z miejsca wstrzyknięcia.
Naciśnij czysty wacik, aby ułatwić nitkowanie zębów i obmacuj ogon do góry, aby wepchnąć pozostałą próbkę do krążenia. Uwolnij mysz z ogranicznika i włóż ją z powrotem do klatki. Zapisz liczbę prób iniekcji i liczbę wstrzykniętych komórek w notatniku laboratoryjnym.
Określ żywotność komórek po wstrzyknięciu. Podobnie jak poprzednio, ten krok daje pewność, że komórki pozostają przy życiu przez cały proces wstrzykiwania. Pod koniec eksperymentu z wstrzykiwaniem żywotność komórek spadnie, ale powinna pozostać powyżej 80%Jako opcjonalny krok, odwiruj pozostałe komórki i przepłucz granulki PBS raz.
Następnie zamroź granulki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do przyszłych analiz, takich jak western blotting. Aby potwierdzić ekspresję genów po knockdownach Po jednym do dwóch miesięcy przeprowadź sekcję myszy, aby określić lokalizacje przerzutów. Zacznij od umieszczenia uśpionej myszy na stacji preparcyjnej.
Spryskaj mysz obficie etanolem. Rozetnij klatkę piersiową, aby odsłonić płuca i serce. Następnie ostrożnie je wyciąć i umieścić w PBS.
Płuco jest głównym miejscem przerzutów, ponieważ zawiera pierwsze łożysko naczyń włosowatych, z którymi stykają się komórki. Po wprowadzeniu się do krążenia należy usunąć serce i przepłukać płuca w PBS, a następnie obserwować każdy płat płuca pod mikroskopem preparacyjnym. Policz liczbę wykrywalnych przerzutów po obu stronach płuc, a następnie liczbę przerzutów do płuc we wszystkich czterech płatach razem, aby określić całkowitą liczbę przerzutów do płuc.
Następnie wyizoluj poszczególne przerzuty do płuc przez wycięcie za pomocą nożyczek. Przenieś każdy przerzut do sitka do komórek o wielkości 70 mikrometrów i zmiel je za pomocą końcówki sterylnej nasadki na igłę. Przepłucz sitko komórkowe kilkoma mililitrami pożywki i zbierz komórki, które przechodzą przez filtr.
W naczyniu hodowlanym każde naczynie zawiera komórki z jednego przerzutu. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez co najmniej cztery dni bez zakłóceń. Początkowo na płytkach będą rosły zarówno komórki rakowe, jak i komórki fibroblastów, ale stopniowo komórki fibroblastów wymrą i zostaną zastąpione komórkami rakowymi.
Jeśli komórki rakowe zawierają jakiekolwiek geny oporności na leki, wybierz komórki z odpowiednimi antybiotykami Po trzech dniach zmyj wszelkie resztki krwi lub tkanek, zanieczyszczenia na naczyniu za pomocą PBS i dodaj świeżą pożywkę. Oceń czystość pobranych komórek poprzez barwienie immunologiczne przeciwciałami przeciwko ludzkim specyficznym białkom, a przeciwciało antyludzkie jest stosowane nawet przy braku selekcji leków. Ponad 99% komórek powinno należeć do ludzi.
Nowo uzyskane komórki można teraz ponownie wstrzyknąć myszom z niedoborem odporności, aby przetestować ich zdolności przerzutowe pod koniec tego testu. Wysoce przerzutowa linia komórek rakowych zazwyczaj powoduje wiele przerzutów do płuc, podczas gdy bardzo niewiele przerzutów do płuc będzie pochodzić ze słabo przerzutowej linii komórek rakowych. Obrazy te pokazują przerzuty do płuc dwa miesiące po wstrzyknięciu ludzkiej linii komórkowej czerniaka.
A 3 7 5 cm. Komórki uzyskane przy użyciu tej metody zwykle powodują więcej przerzutów niż linia rodzicielska, gdy są testowane. Ponownie korzystając z tego testu, właśnie pokazaliśmy Ci procedurę wykonywania eksperymentalnego testu przerzutów.
Podczas wykonywania tej procedury bardzo ważne jest, aby pamiętać o tym, aby komórki zostały wstrzyknięte do żyły ogonowej, ale nie do jej i tkanki ogonowej. Więc to wszystko. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Ten artykuł opisuje eksperymentalne badanie metastaz używane do oceny potencjału metastatycznego ludzkich linii komórek nowotworowych poprzez wstrzyknięcia do żyły ogonowej u myszy z niedoborem odporności.
Kluczowe elementy badania
Obszar nauki
- Onkologia
- Badania nad metastazami
- Biologia eksperymentalna
Tło
- Rozumienie metastaz nowotworowych jest kluczowe dla opracowania skutecznych terapii.
- Eksperymentalne badania pomagają w ilościowym określeniu potencjału metastatycznego komórek nowotworowych.
- Myszy z niedoborem odporności zapewniają odpowiedni model do badania zachowania ludzkich komórek nowotworowych.
- Wstrzyknięcia do żyły ogonowej są powszechną metodą oceny przerzutów do płuc.
Cel badania
- Aby przetestować zdolności metastatyczne ludzkich komórek nowotworowych.
- Aby ilościowo określić i hoować przerzuty do płuc wygenerowane z wstrzykniętych komórek.
- Aby uzyskać wgląd w potencjał metastatyczny różnych linii komórek nowotworowych.
Zastosowane metody
- Przygotowanie ludzkich komórek nowotworowych do wstrzyknięcia.
- Wstrzyknięcie komórek do żyły ogonowej myszy z niedoborem odporności.
- Monitorowanie rozwoju przerzutów do płuc przez jeden do dwóch miesięcy.
- Sekcja myszy w celu ilościowego określenia i hodowli przerzutów do płuc.
Główne wyniki
- Sukcesywne generowanie przerzutów do płuc z wstrzykniętych komórek nowotworowych.
- Ilościowe określenie przerzutów dostarcza danych na temat potencjału metastatycznego.
- Hodowane przerzuty mogą być wykorzystane do dalszej analizy.
- Wyniki wskazują na różnorodność zdolności metastatycznych wśród różnych linii komórek nowotworowych.
Wnioski
- Eksperymentalne badanie metastaz jest skuteczne w ocenie zachowania komórek nowotworowych.
- Uzyskane wglądy mogą pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych przeciwko przerzutom nowotworowym.
- Dalsze badania mogą opierać się na tych znaleziskach, aby zbadać leżące u ich podstaw mechanizmy.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The experimental metastasis assay provides a quantitative in vivo model to assess the metastatic potential of human cancer cell lines, supporting target validation and mechanistic de-risking in oncology drug discovery. By enabling the isolation and propagation of highly metastatic derivatives, the assay facilitates the identification of genes and pathways regulating metastatic progression, thereby informing lead identification and preclinical prioritization. This approach enhances predictive confidence in downstream therapeutic development by linking in vitro findings to functional metastatic outcomes in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by quantifying metastatic ability of cancer cells following genetic or pharmacological perturbation.
- Operational Value: Provides a reproducible in vivo readout for functional target validation in metastasis-relevant pathways.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by linking molecular alterations to metastatic phenotypes in immunocompromised mice.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative metastasis counts that serve as dependent variables for screening modulators of metastatic dissemination.
- Operational Value: Standardizes cell preparation, injection, and tissue harvesting procedures to ensure reproducibility across experiments.
- Scientific Value: Enables derivation of metastatic cell lines with enhanced invasive properties for use in secondary screening and target deconvolution.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Uses a disease-relevant system where lung metastasis formation mirrors clinical patterns of hematogenous spread.
- Operational Value: Supports longitudinal studies by allowing re-injection of cultured metastases to assess stability of the metastatic phenotype.
- Scientific Value: Facilitates biomarker discovery by enabling molecular profiling of isolated metastases compared to parental lines.
Pipeline & Workflow Integration
The assay functions as a discovery-stage tool that bridges target hypothesis testing with phenotypic validation, informing decisions on compound progression and mechanistic follow-up in oncology pipelines.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of metastasis regulators through quantitative lung colonization assays.
- Screening: Delivers standardized, quantifiable outputs (metastasis number per lung) enabling comparison across genetic or chemical conditions.
- Analytics: Generates count-based data suitable for statistical analysis to determine significant differences in metastatic potential.
- Translational Research: Connects early discovery to preclinical validation by providing a model that reflects organ-specific metastatic tropism.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating metastatic capacity across multiple cancer types and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target selection by demonstrating causal links between gene modulation and metastatic suppression or enhancement.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized cell viability thresholds (>90% pre-injection, >80% post-injection) and standardized injection volumes.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing functional metastasis data that complements in vitro invasion and proliferation assays.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on their demonstrated effect on metastatic burden in vivo.
Implementation Considerations
- Requires expertise in animal handling, intravenous injection techniques, and aseptic tissue dissection.
- Dependent on access to immunodeficient mouse models and facilities for long-term animal housing (one to two months).
- Necessitates standardized protocols for cell preparation, viability assessment, and metastasis quantification to minimize variability.
- Involves technical considerations for metastasis isolation, including enzymatic or mechanical dissociation and filtration to obtain single-cell cultures.
- Limited to modeling early dissemination and lung colonization; does not capture later stages of metastasis such as extravasation or distant organ growth beyond the lung.
