Name: Eksperymentalny test przerzutów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-24T17:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Poznaj eksperymentalny test przerzutów w onkologii, oceniający potencjał przerzutowy ludzkich linii komórkowych raka poprzez wstrzyknięcia do żyły ogonowej u myszy immunodeficyjnych. Metoda umożliwia ilościową analizę przerzutów płucnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejszy protokół został początkowo przetestowany i zoptymalizowany w laboratorium dr. Richarda Hynesa (MIT). Finansowanie zapewniono z grantu NYSTEM IDEA AWARD (dla L.X.) oraz Ruth L. Kirschstein National Research Service Award (dla L.X.).

1. Przygotowanie próbek
<ol>
 <li>Hodować komórki do osiągnięcia ok. 70% konfluencji w dedykowanym medium z czynnikami wzrostu lub FBS (np. DMEM z 10% FBS dla komórek MC-1). Odessać medium z płytki i delikatnie przemyć kilkukrotnie 1 x PBS (8 g/L NaCl, 0,2 g/L KCl, 1,15 g/L Na2HPO4.7H2O, 0,2 g/L KH2PO4, pH 7,3).</li>
 <li>Odessać PBS i dodać 2 mL 0,05% trypsyny w versenie (0,014 g/L czerwieni fenolowej i 0,2 g/L EDTA-Na w 1 x PBS, pH 7,2). Delikatnie kołysać płytką, aby ułatwić odrywanie się komórek od podłoża. Obserwować komórki pod mikroskopem. Odrywanie się komórek trwa zazwyczaj od 2 do 5 minut.</li>
 <li>Dodać odpowiednią objętość medium zawierającego FBS (lub inhibitor trypsyny z soi), aby zahamować aktywność trypsyny, a następnie zebrać komórki do probówki Falcon 50 mL. Policzyć komórki za pomocą hemacytometru. Nanieść 10 μL zawiesiny komórkowej na czysty hemacytometr. Liczba komórek na mL jest równa średniej liczbie komórek w każdym z pięciu pól pomnożonej przez 104.</li>
 <li>Wirować komórki z prędkością 1000 RPM (lub ok. 200 xg) w wirówce laboratoryjnej przez 3 minuty.</li>
 <li>Ostrożnie usunąć medium, nie naruszając osadu komórkowego. Resuspender komórki w odpowiedniej objętości zrównoważonego roztworu soli Hanksa (HBSS), aby uzyskać końcowe stężenie ok. 5 x 106 komórek/mL.</li>
 <li>Przefiltrować komórki przez sitko komórkowe Falcon 70 μm w celu usunięcia dużych agregatów komórkowych. Umieścić końcówkę pipety bezpośrednio na filtrze nad oznakowaną probówką hodowlaną Falcon 5 mL. Szybko wypchnąć zawiesinę przez filtr do probówki hodowlanej.</li>
 <li>Ponownie policzyć komórki za pomocą hemacytometru i rozcieńczyć je do końcowego stężenia 2,5 x 106/mL. Przechowywać komórki w lodzie.</li>
 <li>Określić żywotność komórek. Wymieszać część komórek z błękitem trypanu i za pomocą hemacytometru zmierzyć procent martwych (niebieskich) komórek w stosunku do całkowitej liczby komórek. Żywotność komórek przed iniekcją powinna wynosić ≥ 90%.</li>
</ol>
2. Iniekcja dożylna
<ol>
 <li>Zmień rękawiczki. Delikatnie chwyć ogon myszy z niedoborem odporności (nude, NOD-SCID lub NSG, Jackson's Laboratory) i wsuń ją do restrainera dla myszy, tak aby grzbiet przylegał do szczeliny, a ogon wystawał przez mały otwór z tyłu urządzenia.</li>
 <li>Powoli przesuń pierścień do wewnątrz wzdłuż szczeliny i zablokuj go w miejscu, gdy pierścień obejmie pysk myszy. Mysz nie powinna móc poruszać się swobodnie, ale powinna mieć prawidłową częstotliwość oddechów.</li>
 <li>Zlokalizuj główne żyły ogonowe. W ogonie myszy znajdują się cztery główne naczynia krwionośne. Naczynia na stronie grzbietowej i brzusznej ogona to tętnice. Żyły znajdują się po bokach ogona.</li>
 <li>Naciągnij do strzykawki 1 mL ponad 200 μL przygotowanych komórek. Przymocuj igłę 30 G 1/2 cala i wypchnij wszelkie pęcherzyki powietrza. Końcowa objętość komórek w strzykawce powinna wynosić 200 μL (tj. łącznie 5 x 105 komórek).</li>
 <li>Wstrzyknij komórki do żyły ogonowej.
 <ol class="lalpha">
 <li>Zacznij od dystalnego końca ogona, aby w przypadku niepowodzenia pierwszej próby móc wykorzystać bardziej proksymalny region ogona do drugiej próby.</li>
 <li>Przetrzyj ogon 70% etanolem. Naciągnij ogon prosto. Przytrzymaj koniec ogona kciukiem, a miejsce wstrzyknięcia podeprzyj palcem wskazującym.</li>
 <li>Wprowadź igłę do żyły i wstrzyknij komórki. Upewnij się, że igła i strzykawka są równolegle do żyły podczas iniekcji, w przeciwnym razie igła przebije ścianę naczynia i wstrzyknie komórki do sąsiednich tkanek ogona.</li>
 <li>Wyjmij igłę po wstrzyknięciu. Jeśli iniekcja przebiegła pomyślnie, z miejsca wkłucia powinna wypłynąć krew. Przyciśnij czysty kawałek ręcznika papierowego lub patyczek bawełniany do miejsca wstrzyknięcia, aby ułatwić krzepnięcie, a następnie masuj ogon w górę, aby wprowadzić resztki próbki z żyły do krwiobiegu.</li>
 <li>Zwolnij mysz z restrainera i przenieś ją z powrotem do klatki. Zapisz proces iniekcji (np. ile prób zajęło wstrzyknięcie komórek i jaka ilość komórek została podana) w zeszycie laboratoryjnym.</li>
 <li>Określ żywotność komórek po iniekcji, zgodnie z opisem w sekcji Przygotowanie próbek, krok 9. Krok ten daje pewność, że komórki pozostają żywe podczas całego procesu wstrzykiwania. Pod koniec eksperymentu iniekcyjnego żywotność komórek spadnie, ale powinna wynosić powyżej 80%.</li>
 <li>(opcjonalnie) Odwiruj pozostałe komórki i jednorazowo wypłucz osad w PBS. Zamroź osady w temperaturze -80 °C do przyszłych analiz (np. western blot w celu potwierdzenia ekspresji genów lub knockdownu).</li>
 </ol>
 </li>
 <li>Zazwyczaj po jednym lub dwóch miesiącach myszy są sekcjowane, a lokalizacje przerzutów określane makroskopowo. Płuca są głównym miejscem przerzutów, ponieważ zawierają pierwsze łożysko kapilarne, z którym stykają się komórki po wejściu do krwiobiegu.</li>
 <li>Po wypłukaniu w PBS każdy płat płuca (lub inne tkanki zawierające przerzuty) jest oglądany pod mikroskopem sekcyjnym (Rycina 1). Liczba wykrywalnych przerzutów po obu stronach płuca jest zliczana, a liczby przerzutów we wszystkich czterech płatach są sumowane jako całkowita liczba przerzutów w płucach.1 Przerzuty w płucach są łatwiejsze do wykrycia, jeśli płuca zostaną utrwalone w formalinie przez noc, ponieważ przerzuty będą widoczne jako białawe plamki w kontraście do sąsiednich ciemnobrązowych tkanek płucnych.</li>
</ol>
3. Hodowla komórek z przerzutów do płuc
<ol>
 <li> Przerzuty do płuc izoluje się z wstrzykniętych myszy. Każdy z nich należy hodować oddzielnie.</li>
 <li> Każdy przerzut rozdrabnia się za pomocą końcówki nakrętki igły (sterylnej) na sitku komórkowym o oczkach 70 μm.</li>
 <li> Sitko komórkowe płucze się kilkoma mL pożywki, a komórki, które przeszły przez filtr, zbiera się do naczynia hodowlanego. </li>
 <li> Komórki inkubuje się w temperaturze 37 °C przez co najmniej cztery dni, nie zakłócając ich wzrostu.</li>
 <li> Krew lub szczątki tkankowe z naczynia wypłukuje się za pomocą PBS. </li>
 <li> Dodaje się świeżą pożywkę. Na początku na płytkach rosną zarówno komórki nowotworowe, jak i fibroblasty, jednak z czasem fibroblasty obumierają i zostają zastąpione przez komórki nowotworowe. Jeśli komórki nowotworowe posiadają geny oporności na leki, dokonuje się selekcji komórek przy użyciu odpowiednich antybiotyków.</li>
 <li> Czystość uzyskanych komórek ocenia się za pomocą immunobarwienia z wykorzystaniem przeciwciał przeciwko białkom specyficznym dla ludzi. Stosujemy przeciwciało anty-ludzka wimentyna (NCL-VIM-V9, Novocastra). Uzyskane przez nas komórki zawierają zazwyczaj ponad 99% komórek ludzkich, nawet w przypadku braku selekcji lekowej. Nowo wyizolowane komórki można ponownie wstrzyknąć myszom z niedoborem odporności, aby przetestować ich zdolności przerzutowe, zgodnie z powyższym opisem.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
<ol>
 <li> Pod koniec tego testu wysoce metastatyczna linia komórek nowotworowych zazwyczaj daje początek wielu przerzutom do płuc (Rycina 1),1 podczas gdy linia komórek nowotworowych o niskim potencjale metastatycznym wygeneruje bardzo mało przerzutów do płuc.</li>
 <li> Komórki otrzymane za pomocą tej metody zazwyczaj dają początek większej liczbie przerzutów niż linia rodzicielska, gdy są ponownie badane przy użyciu tego testu.1-3</li>
</ol>
 <img src="/files/ftp_upload/1942/1942fig1.jpg" alt="Próbka tkanki pod mikroskopem, badanie morfologii komórek w eksperymencie histologicznym, analiza biologiczna." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rysunek 1. Reprezentatywne obrazy płuc myszy po wstrzyknięciach do żyły ogonowej komórek nowotworowych. 5 x 105 komórek przerzutowej ludzkiej linii komórkowej czerniaka, komórki SM,4 wstrzyknięto do żyły ogonowej myszy z niedoborem odporności. Po dwóch miesiącach wyizolowano płuca, w których stwierdzono obecność przerzutów rozproszonych w prawidłowej tkance płucnej.

<ol><li>Xu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+in+an+animal+melanoma+model+correlate+with+aggressiveness+of+human+melanoma+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes in an animal melanoma model correlate with aggressiveness of human melanoma metastases.</a> Mol Cancer Res. 6 (5), 760-760 (2008).</li>
<li>Clark, E. A., Golub, T. R., Lander, E. S., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analysis+of+metastasis+reveals+an+essential+role+for+RhoC%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genomic analysis of metastasis reveals an essential role for RhoC.</a> Nature. 406 (6795), 532-532 (2000).</li>
<li>Xu, L., Begum, S., Hearn, J. D., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GPR56%2C+an+atypical+G+protein-coupled+receptor%2C+binds+tissue+transglutaminase%2C+TG2%2C+and+inhibits+melanoma+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">GPR56, an atypical G protein-coupled receptor, binds tissue transglutaminase, TG2, and inhibits melanoma tumor growth and metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (24), 9023-9023 (2006).</li>
<li>Kozlowski, J. M., Hart, I. R., Fidler, I. J., Hanna, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+melanoma+line+heterogeneous+with+respect+to+metastatic+capacity+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">A human melanoma line heterogeneous with respect to metastatic capacity in athymic nude mice.</a> J Natl Cancer Inst. 72 (4), 913-913 (1984).</li>
<li>Kang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-537 (2003).</li>
</ol>

Przerzuty są główną przyczyną zgonów u pacjentów z nowotworami. Proces ten obejmuje cztery główne etapy: odłączenie się komórek nowotworowych od ich pierwotnego miejsca występowania, ich przedostanie się do krwiobiegu (intrawazacja), opuszczenie krwiobiegu (ekstrawazacja) oraz przetrwanie i wzrost w odległym narządzie. Przerzutowanie u ludzi jest uważane za proces powolny i często objawia się po latach latencji. Aby badać jego progresję w odpowiednim czasie, u myszy z niedoborem odporności opracowano powyższy, stosunkowo...

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10313-021</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30088.03</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>6838-04</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7896-04</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Mallinckrodt Baker Inc.</td><td>7100-12</td><td></td></tr><tr><td>Czerwień fenolowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3532</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-Na</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td></td></tr><tr><td>Błękit trypanu</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 2,5%</td><td>Invitrogen</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Ultrapure</td><td>200-CSGP</td><td></td></tr><tr><td>Probetka Falcon 50 ml</td><td>VWR international</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrocentryfugi</td><td>Axygen Scientific</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>Sito do komórek Falcon 70&amp;mu;m</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Probówka hodowlana Falcon 5 ml</td><td>VWR international</td><td>60818-576</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometr</td><td>Hausser Scientific</td><td>15170-208</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>329650</td><td></td></tr><tr><td>Igła 30 &amp;frac12; G</td><td>BD Biosciences</td><td>305106</td><td></td></tr><tr><td>Restryktor dla myszy</td><td>Plas Labs Inc.</td><td>551-BSRR</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki chirurgiczne</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-940</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-902</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop sekcyjny</td><td>Nikon Instruments</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka naktławowa</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>75003491</td><td></td></tr></tbody></table>

test eksperymentalny przerzutowania

Experimental Metastasis Assay

Przerzuty są główną przyczyną zgonów u pacjentów z nowotworami. Aby zrozumieć mechanizm przerzutowania, opracowano eksperymentalny test przerzutów z wykorzystaniem myszy z niedoborem odporności. Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje procedury stosowane w tym teście, w tym przygotowanie próbek, wstrzyknięcia dożylne oraz hodowlę komórek pochodzących z przerzutów do płuc. W skrócie, przygotowano wcześniej określoną liczbę ludzkich komórek nowotworowychin vitroa następnie wstrzyknięte bezpośrednio do krwiobiegu myszy z niedoborem odporności poprzez żyły ogonowe. Niewielka liczba komórek przeżywa turbulencje w krwiobiegu i rozwija się jako przerzuty w narządach wewnętrznych, takich jak płuca. Po określonym czasie myszy poddano sekcji. Rozmieszczenie przerzutów w tkankach określono pod mikroskopem stereoskopowym. Policzono liczbę przerzutów w konkretnej tkance, co bezpośrednio koreluje ze zdolnością do przerzutowania wstrzykniętych komórek nowotworowych. Powstałe przerzuty wyizolowano i poddano hodowliin vitrolinie komórkowe, które po ponownym wstrzyknięciu myszom z niedoborem odporności często wykazują większe zdolności metastatyczne niż linia rodzicielska. Te wysoce metastatyczne pochodne stają się użytecznymi narzędziami do identyfikacji genów lub szlaków molekularnych regulujących progresję przerzutowania.

Niniejszy artykuł opisuje procedury eksperymentalnego testu przerzutowania, który jest wykorzystywany do określania potencjału metastatycznego ludzkich linii komórkowych raka.

Test eksperymentalny przerzutowania

Przerzuty są główną przyczyną zgonów pacjentów onkologicznych. Aby zrozumieć mechanizm przerzutowania, opracowano eksperymentalny test przerzutowania...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest zbadanie zdolności do tworzenia przerzutów przez ludzkie komórki nowotworowe poprzez wstrzyknięcia do żyły ogonowej. W myszach z niedoborem odporności przygotowywane są komórki do wstrzyknięcia. Następnie komórki są wstrzykiwane do myszy z niedoborem odporności, co po jednym lub dwóch miesiącach doprowadzi do powstania przerzutów do płuc.Myszy są sekcjonowane, a przerzuty do płuc są kwantyfikowane i hodowane. Wyniki tego rodzaju analizy wskazują na stopień przerzutowania konkretnego typu komórek nowotworowych. Dzień dobry, nazywam się Sonali Mohanty i reprezentuję laboratorium dr LE w Katedrze Genetyki Biomedycznej na Uniwersytecie w Rochester.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę przeprowadzania eksperymentalnego testu przerzutowania. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania przerzutów nowotworowych. Zapraszamy do rozpoczęcia.Zacznij od komórek wyhodowanych do około 70% konfluencji; odessij pożywkę z płytki i delikatnie przemyj ją raz 1x PBS. Następnie dodaj 2 mL 0,05% trypsyny. Delikatnie potrząśnij płytką, aby ułatwić odrywanie się komórek.Obserwuj komórki pod mikroskopem podczas ich odrywania się. Dodaj odpowiednią objętość pożywki zawierającej FBS, aby zneutralizować działanie trypsyny. Następnie przenieś zawiesinę do probówki o pojemności 50 ml.Policz komórki, używając hematocytometru. Po wyznaczeniu stężenia odwiruj zawiesinę z prędkością około 200 ×g przez trzy minuty, uważając, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Ostrożnie usuń medium i resuspenderuj próbkę, dodając odpowiednią objętość zrównoważonego roztworu soli Hanksa lub HBSS, aby uzyskać końcowe stężenie około 5 × 10⁶ komórek na ml.Następnie przefiltruj zawiesinę przez sitko komórkowe Falcon o rozmiarze oczek 70 µm. Aby wyeliminować duże agregaty komórkowe, umieść końcówkę pipety bezpośrednio na filtrze umieszczonym nad probówką hodowlaną o pojemności 5 mL. Szybko wydmuchaj zawiesinę przez filtr do probówki.Ponownie policz komórki, używając błękitu trypanowego, aby określić ich żywotność. Przed iniekcją żywotność powinna wynosić powyżej 90%. Następnie rozcieńcz zawiesinę do końcowego stężenia 2,5 × 10⁶ komórek/ml.Przechowywać w lodzie. Delikatnie chwycić mysz z niedoborem odporności za ogon i wsunąć ją do restrainera w taki sposób, aby grzbiet przylegał do szczeliny, a ogon wystawał przez mały otwór z tyłu. Powoli przesunąć pierścień do wewnątrz wzdłuż szczeliny.Gdy pierścień uchwyci pysk myszy, zablokuj go w tej pozycji. Mysz nie powinna móc swobodnie poruszać się, ale musi zachować normalną częstotliwość oddechów. Zlokalizuj główne żyły ogonowe.W ogonie myszy znajdują się cztery główne naczynia krwionośne. Tętnice są rozmieszczone po stronie grzbietowej i brzusznej ogona. Żyły znajdują się po stronach bocznych.Naciągnij co najmniej 200 µL przygotowanych komórek do strzykawki o pojemności jednego mililitra. Przymocuj igłę o rozmiarze 30 G i usuń wszelkie pęcherzyki powietrza. Końcowa objętość w strzykawce powinna wynosić 200 µL.Przygotuj się do wstrzyknięcia w dystalny koniec ogona. Dzięki temu, jeśli pierwsza próba nie powiedzie się, do drugiej próby można będzie wykorzystać bardziej proksymalny odcinek ogona. Po przetarciu miejsca wstrzyknięcia 70% ethanol, wyprostuj ogon.Przytrzymaj końcówkę kciukiem, a miejsce wstrzyknięcia podeprzyj palcem wskazującym. Wprowadź igłę do żyły i wstrzyknij komórki. Upewnij się, że podczas wstrzykiwania igła i strzykawka są równoległe do żyły.W przeciwnym razie igła przebije ścianę naczynia, a komórki zostaną wstrzyknięte do sąsiednich tkanek ogona. Wyjmij igłę, jeśli procedura przebiegła pomyślnie. Krew powinna wypływać z miejsca wstrzyknięcia.Przyciśnij czystą watkę bawełnianą, aby ułatwić oczyszczanie, i palcem przesunął w górę ogon, aby wprowadzić pozostałą próbkę do krwiobiegu. Zwolnij mysz z ograniczacza i umieść ją z powrotem w klatce. Zapisz liczbę prób wstrzyknięcia oraz liczbę wstrzykniętych komórek w dzienniku laboratoryjnym.Oceń żywotność komórek po iniekcji. Podobnie jak poprzednio, krok ten pozwala upewnić się, że komórki pozostają żywe podczas całego procesu iniekcji. Pod koniec eksperymentu z iniekcją żywotność komórek spadnie, ale powinna pozostać powyżej 80%. Jako krok opcjonalny, odwiruj pozostałe komórki i raz wypłucz osad za pomocą PBS.Następnie zamrozić osady w temperaturze -80 °C do późniejszych analiz, takich jak western blotting. Aby potwierdzić ekspresję genów w przypadku wyciszenia (knockdown), po jednym lub dwóch miesiącach przeprowadzić sekcję myszy w celu ustalenia lokalizacji przerzutów. Rozpocząć od umieszczenia uśpionej myszy na stanowisku do sekcji.Obficie spryskaj mysz etanolem. Rozetnij klatkę piersiową, aby odsłonić płuca i serce. Następnie ostrożnie je wyciąć i umieścić w PBS.Płuca są głównym miejscem przerzutów, ponieważ zawierają pierwsze łoże kapilarne, z którym napotykają komórki. Po ich przedostaniu się do krwiobiegu należy usunąć serce i wypłukać płuca w PBS, a następnie obejrzeć każdy płat płuc pod mikroskopem stereoskopowym. Należy policzyć liczbę wykrywalnych przerzutów po obu stronach płuc, a następnie zsumować liczbę przerzutów we wszystkich czterech płatach, aby określić całkowitą liczbę przerzutów do płuc.Następnie, wyizoluj poszczególne przerzuty do płuc poprzez wycięcie ich nożyczkami. Przenieś każdy przerzut na sito komórkowe o oczkach 70 µm i rozdrobnij go, używając końcówki sterylnej zatyczki od igły. Przepłucz sito komórkowe kilkoma mililitrami pożywki i zbierz komórki, które przeszły przez filtr.W naczyniu hodowlanym, w którym każde naczynie zawiera komórki z jednego przerzutu, inkubować komórki w temperaturze 37°C przez co najmniej cztery dni bez przerywania procesu. Początkowo na płytkach będą rosły zarówno komórki nowotworowe, jak i fibroblasty, lecz stopniowo fibroblasty obumrą i zostaną zastąpione przez komórki nowotworowe.Jeśli komórki nowotworowe posiadają geny oporności na leki, należy wyselekcjonować komórki przy użyciu odpowiadających im antybiotyków. Po trzech dniach należy wypłukać krew lub pozostałości tkankowe z naczynia za pomocą PBS i dodać świeżą pożywkę. Czystość uzyskanych komórek należy ocenić poprzez immunobarwienie przeciwciałami przeciwko białkom specyficznym dla człowieka; w tym przypadku, nawet w przypadku braku selekcji lekowej, stosuje się przeciwciała anty-ludzkie. Więcej niż 99% komórek powinno być pochodzenia ludzkiego.Nowo otrzymane komórki można ponownie wstrzyknąć myszom z niedoborem odporności, aby pod koniec tego badania przetestować ich zdolności do przerzutowania. Linia komórek nowotworowych o wysokim potencjale metastatycznym zazwyczaj daje wiele przerzutów do płuc, podczas gdy linia o niskim potencjale metastatycznym wywoła bardzo niewiele przerzutów do płuc. Przedstawione obrazy ukazują przerzuty do płuc dwa miesiące po wstrzyknięciu ludzkiej linii komórek czerniaka.A 3 7 5 sm. Komórki uzyskane tą metodą zazwyczaj wywołują więcej przerzutów niż linia rodzicielska podczas testów. Wykorzystując ponownie ten test, zaprezentowaliśmy procedurę przeprowadzenia eksperymentalnego badania przerzutowania.Podczas wykonywania tej procedury bardzo ważne jest dopilnowanie, aby komórki zostały wstrzyknięte do żyły ogonowej, a nie do tkanek ogona. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Eksperymentalne badanie nad przerzutami

Eksperymentalny mysi model przerzutów do płuc i immunoterapii CTL do analizy oddziaływań komórek nowotworowych z limfocytami T in vivo.

Model mysi eksperymentalnej przerzutowości oraz immunoterapii z adoptywnym transferem limfocytów CTL

Wykorzystując ilościową PCR, demonstrujemy, w jaki sposób uznany model CAM kurczaka może być użyty do ilościowej analizy przerzutowania ludzkich komórek nowotworowych do odległych narządów.

Ilościowa analiza przerzutów nowotworowych z wykorzystaniem modelu zarodka ptaka

Ten film opisuje protokół tworzenia mysiego modelu spontanicznych przerzutów ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem jelita grubego lub PDX. Te modele ksenoprzeszczepów częściowo naśladują cechy ludzkich nowotworów i rozumieją krytyczne aspekty nowotworów złośliwych u ludzi, w tym inwazję i przerzuty.

Mysie modele spontanicznych przerzutów: platforma do badania potencjału przerzutowego komórek raka jelita grubego wstrzykiwanych ortotopowo

Ten ortotopowy model ludzkiego raka prostaty pozwala na ilościowe określenie wielkości guza, krążących komórek nowotworowych i tworzenie wyraźnych przerzutów do płuc. Ponieważ komórki muszą uciec z narządu pierwotnego, dostać się do krwiobiegu i zagnieździć się w miejscu wtórnym, model ten skutecznie podsumowuje scenariusz u ludzi.

Ortotopowy mysi model przerzutów ludzkiego raka prostaty

Ten manuskrypt opisuje metodę ilościowego określania akumulacji komórek nowotworowych w płucach w zwierzęcym modelu przerzutów nowotworowych.

Test rekrutacji komórek nowotworowych płuc

Protokół ten opisuje, jak używać ilościowego PCR W CZASIE RZECZYWISTYM (QRT-PCR) do wykrywania mRNA specyficznego dla komórek nowotworowych reprezentującego przerzuty w tkance płucnej myszy.

Ocena przerzutów do płuc w modelach guza sutka myszy za pomocą ilościowego PCR w czasie rzeczywistym

Przerzuty odgrywają ogromną rolę w zjadliwości raka, odpowiadając za około 90% zgonów.  Przedstawiamy protokół dla modelu czerniaka z przerzutami u myszy, który jest przydatny do określenia skuteczności środków terapeutycznych przeciwko temu zjawisku klinicznemu.

Wstrzyknięcie syngenicznych komórek czerniaka myszy w celu określenia ich potencjału przerzutowego do płuc

Celem tego artykułu jest dostarczenie szczegółowego opisu protokołu testu przerzutów do płuc (PuMA). Model ten pozwala naukowcom badać wzrost komórek kostniakomięsaka z przerzutami (OS) w tkance płucnej za pomocą szerokokątnego mikroskopu fluorescencyjnego lub konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego.

Praktyczne rozważania w badaniu przerzutowej kolonizacji płuc w kostniakomięsaku przy użyciu testu przerzutów do płuc

Opisane podejście łączy eksperymentalne testy przerzutów do żył ogonowych z obrazowaniem żywych zwierząt in vivo, aby umożliwić monitorowanie w czasie rzeczywistym powstawania i wzrostu przerzutów raka piersi, a także ilościowe określenie liczby i wielkości przerzutów w płucach.

Łączne wykorzystanie testów przerzutów do żył ogonowych i obrazowania in vivo w czasie rzeczywistym w celu ilościowego określenia kolonizacji przerzutowej raka piersi i obciążenia płuc

Ten artykuł opisuje przebieg techniki wykorzystywane do testowania nowych kandydatów na mediatory przerzutów czerniaka i ich mechanizm(y) działania.

Solidna platforma odkrywcza do identyfikacji nowych mediatorów przerzutów czerniaka

Manuskrypt opisuje metodologię ustalania oraz monitorowania wzrostu podłużnego spontanicznych przerzutów do płuc z ortotopowo wstrzykiwanych guzów piersi, które mogą być interwencyjne na wszystkich etapach kaskady przerzutowej.

In vivo (in vivo) Obrazowanie w celu pomiaru spontanicznych przerzutów do płuc komórek guza piersi wstrzykniętych ortotopowo

Poznaj eksperymentalny test przerzutów w onkologii, oceniający potencjał przerzutowy ludzkich linii komórkowych raka poprzez wstrzyknięcia do żyły ogonowej u myszy immunodeficyjnych. Metoda umożliwia ilościową analizę przerzutów płucnych.

Test eksperymentalny przerzutowania

Przeglądaj więcej filmów