Name: Analiza immunocytochemiczna ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu samodzielnie wykonanego aparatu cytospinowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Poznaj metodę immunocytochemiczną ludzkich komórek pluripotencjalnych przy użyciu samodzielnie wykonanego aparatu cytospinowego. Technika ta umożliwia tworzenie monowarstwy komórek do precyzyjnej analizy markerów powierzchniowych SSEA-3 i SSEA-4.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Częściowe finansowanie tej pracy zapewniły granty NSF-CAREER 0744556 (Rao) oraz stypendium w ramach programu VCU-HHMI Science Education and Research Program (Pascual).

Część 1: Immunocytochemiczne barwienie w zawiesinie
<ol>
 <li>Komórki zbiera się, tworząc zawiesinę pojedynczych komórek.</li>
 <li>Następnie komórki przenosi się do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1,5-2 mL i wiruje przy 200g przez 4 minuty.</li>
 <li>Komórki przemywa się poprzez odessanie supernatantu, ponowne zawieszenie w 1 mL PBS-- (bez Mg2+ i Ca2+) i ponowne wirowanie przy 200g przez 4 minuty. Czynność tę należy powtórzyć dwukrotnie.</li>
 <li>Po przemyciu komórki utrwala się, zawieszając je w 1 mL 4% paraformaldehydu (PFA) w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
 <li>Komórki przemywa się ponownie dwukrotnie 1 mL PBS--.</li>
 <li>Po przemyciu komórki blokuje się, zawieszając je w 1 mL roztworu blokującego (6% surowicy/94% PBS--). Próbki inkubuje się w temperaturze pokojowej przez 45 minut.</li>
 <li>Następnie probówki wiruje się przy 200g przez 4 minuty i odsysa roztwór blokujący. Komórki zawiesza się w 1 mL roztworu przeciwciała pierwszorzędowego (przygotowanego w roztworze blokującym przy zalecanym rozcieńczeniu). Komórki można inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w 4°C przez noc przed przejściem do następnego kroku.</li>
 <li>Następnie komórki przemywa się dwukrotnie 1 mL roztworu blokującego.</li>
 <li>Po tym czasie komórki zawiesza się w 1 mL roztworu przeciwciała drugorzędowego (przygotowanego w roztworze blokującym przy zalecanym rozcieńczeniu) i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
 <li>Po 1 godzinie komórki należy ponownie przemyć dwukrotnie 1 mL roztworu blokującego.</li>
 <li>Po przemyciu roztworem blokującym komórki przemywa się ponownie 1 mL PBS--.</li>
 <li>Po kolejnych przemyciach komórki zawiesza się w 1 mL barwnika jądrowego DAPI (rozcieńczenie DAPI w PBS-- 1:10 000) i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
 <li>Po 5 minutach probówki wiruje się przy 200g przez 4 minuty. Odsysa się roztwór barwnika jądrowego DAPI i zawiesza komórki w 1 mL PBS--.</li>
</ol>
Część 2: Osadzanie hPSC na preparatach wykonanych za pomocą cytocentryfugi
<ol>
 <li>Plastikowe szkiełka przygotowuje się, wykonując w nich odpowiednią liczbę otworów za pomocą wiertarki stołowej. Średnica otworu powinna być maksymalnie o 1mm większa od największej średnicy końcówek mikropipety, których należy użyć.</li>
 <li>Papier filtracyjny zostaje docięty nożyczkami do wymiarów plastikowego szkiełka.</li>
 <li>Następnie w papierze filtracyjnym wykonuje się otwory. Rozmiar otworu(ów) powinien być taki, aby końcówki mikropipety pasowały do nich ściśle.</li>
 <li>Następnie jedno z przygotowanych plastikowych szkiełek kładzie się na wierzchu, a szkiełko szklane umieszcza się pod dociętym papierem filtracyjnym (Rysunek 1). Warstwy zostają zabezpieczone taśmą.</li>
 <li>Następnie maksymalnie 100μL (w zależności od pożądanej gęstości monowarstwy) zabarwionej zawiesiny komórkowej z Części 1 wprowadza się do górnej części końcówki(ek) mikropipety.</li>
 <li>W razie potrzeby aparat z roztworem komórek można zważyć i przygotować przeciwwagę o podobnej masie.</li>
 <li>Aparat do cytocentryfugacji oraz przeciwwagę umieszcza się następnie w wirówce stołowej i wiruje przy 200g przez 4 minuty.</li>
 <li>Po wirowaniu aparat do cytocentryfugacji zostaje ostrożnie rozmontowany w taki sposób, aby nie usunąć komórek z szkiełka szklanego.</li>
 <li>W razie potrzeby odsysa się nadmiar otaczającego PBS z powierzchni szkiełka szklanego.</li>
 <li>Następnie komórki można oglądać pod mikroskopem fluorescencyjnym, aby sprawdzić, czy uzyskano pożądaną monowarstwę komórek.</li>
</ol>
Część 3: Montowanie preparatów
<ol>
 <li>Kropelkę wybranego medium montażowego nanosi się bezpośrednio na środek każdego obszaru zawierającego komórki.</li>
 <li>Następnie ostrożnie opuszcza się szkiełko nakrywkowe na preparaty, starając się w miarę możliwości uniknąć powstania pęcherzyków powietrza.</li>
 <li>Nadmiar medium montażowego usuwa się z preparatów.</li>
 <li>Krawędzie szkiełek nakrywkowych uszczelnia się lakierem do paznokci.</li>
 <li>Preparaty można przechowywać w ciemnym miejscu do momentu zaobserwowania i udokumentowania wyników.</li>
</ol>

<ol><li>Rao, R. R., Johnson, A. V., Stice, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+markers+in+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Mol.+Bio.+-+Stem+Cell+Assays%22%5BJournal%5D)">Cell surface markers in human embryonic stem cells.</a> Methods in Mol. Bio. - Stem Cell Assays. 407, 51-61 (2007).</li>
<li>Sisino, G., Bellavia, D., Corallo, M., Geraci, F., Barbieri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+homemade+cytospin+apparatus%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A homemade cytospin apparatus.</a> Anal. Biochem. 359, 283-284 (2006).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Na potrzeby naszego laboratorium do procedury barwienia immunocytochemicznego z wykorzystaniem aparatury do cytospinowania przeznacza się szalkę 35 mm z kulturami komórek macierzystych hodowanych na zarodkowych fibroblastach myszy (MEF). Następnie komórki są zbierane poprzez pasaż enzymatyczny, usuwając jak największą część warstwy MEF, w celu otrzymania zawiesiny pojedynczych komórek. Jeśli wymagana jest bardziej efektywna izolacja komórek macierzystych z warstwy MEF, kolonie można pobrać ręcznie, a następnie poddać tra...

<table><tbody><tr><td>Szkiełka przedmiotowe z komorą Lab Tek Permanox</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>117437</td><td>Materiał do wielokrotnego użytku szkiełek plastikowych</td></tr><tr><td>Wstępnie oczyszczone szkiełka mikroskopowe Superfrost/Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Napiwniki z filtrem 0,1-10&amp;mu;L</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1121-3810</td><td></td></tr><tr><td>Kryszka mikroskopowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>120542-B</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>Richard-Allan Scientific</td><td>8311-4</td><td>Medium montażowe</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>Normalne surowica kozia</td><td>Invitrogen</td><td>10000C</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało monoklonalne przeciwko SSEA-4</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4304</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe do barwienia SSEA-4</td></tr><tr><td>Szczurze przeciwciało monoklonalne przeciwko SSEA-3</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB4303</td><td>Przeciwciało pierwszorzędowe do barwienia SSEA-3</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 przeciwciało kozie anty-mysie IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>Przeciwciało wtórne do barwienia SSEA-4</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 znakowane przeciwciało kozie anty-szczurze IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>Przeciwciało wtórne do barwienia SSEA-3</td></tr><tr><td>DAPI, dichlorowodorek</td><td>Calbiochem</td><td>268298</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza immunocytochemiczna ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem własnoręcznie wykonanego urządzenia do cytocentryfugacji

Immunocytochemical Analysis of Human Pluripotent Stem Cells using a Self-Made Cytospin Apparatus

Ludzkie pluripotencyjne komórki macierzyste (hPSCs), obejmujące ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESCs) oraz ludzkie indukowane pluripotencyjne komórki macierzyste (hiPSCs), stanowią obiecujące źródła komórkowe ze względu na ich nieograniczone zdolności do samoodnawiania oraz potencjał do różnicowania się w wiele typów komórek. Stan pluripotencji hPSCs jest zazwyczaj oceniany za pomocą takich technik jak qPCR, immunocytochemia oraz innychin vitroiin vivostrategie różnicowania na wiele typów komórek. Wśród nich opracowano techniki immunocytochemiczne do rutynowej charakterystyki stanu niedróżnicowanego hPSC w oparciu o analizę kandydatów na wewnątrzkomórkowe i powierzchniowe biomarkery komórkowe. Biorąc pod uwagę fakt, że hPSC rosną w postaci kolonii, pojawiają się problemy z rutynowym ilościowym określaniem ekspresji tych markerów na poziomie pojedynczych komórek. Analizy przepływowe służą do rozwiązania tego problemu, lecz wymagają liczby komórek i zastosowania odczynników, które zazwyczaj nie sprzyjają rutynowej ocenie kontroli jakości kultur hPSC. Zatem opracowanie praktycznych i powtarzalnych metod tworzenia monowarstw komórkowych z zachowaną integralnością do oceny markerów niesie ze sobą wiele korzyści w badaniach nad komórkami macierzystymi. Przynosi to znaczące korzyści w analizie immunocytochemicznej, ponieważ poszczególne komórki z monowarstwy można łatwo obserwować i ilościowo oceniać pod kątem ekspresji specyficznych markerów. W tym celu skonstruowano i zoptymalizowano własny aparat do cytospiningu z przeznaczeniem do barwień immunocytochemicznych. Na potrzeby niniejszego protokołu przeanalizowano ekspresję dwóch markerów powierzchniowych (SSEA3/SSEA4) w wariancie linii komórek macierzystych BG01.

Immunocytochemiczne barwienie w zawiesinie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSCs) pod kątem markerów powierzchniowych komórek (SSEA-3/SSEA-4) zostało przeprowadzone z wykorzystaniem własnego urządzenia do cytocentryfugacji w celu stworzenia monowarstwy komórek do obserwacji i kwantyfikacji.

Analiza immunocytochemiczna ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem własnoręcznie wykonanego urządzenia do cytocentryfugacji

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste (hPSC), do których należą ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) oraz ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), stanowią fascynującą linię komórkową ...

Witam, nazywam się Rick Pasqua i jestem studentem w Laboratorium Inżynierii Komórek Macierzystych na Wydziale Nauk Chemicznych i Biologicznych na Virginia Commonwealth University. W tym filmie zaprezentuję, w jaki sposób w naszym laboratorium wykorzystujemy niedrogi, własnoręcznie wykonany aparat do wirowania STO, aby stworzyć obserwowalną monowarstwę ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do ilościowego oznaczenia markerów powierzchniowych komórek. Biorąc pod uwagę, że wiele protokołów immunochemicznych jest dostosowanych do hPSC hodowanych w szkiełkach z komorą w formie kolonii, mogą pojawić się problemy z charakterystyką ekspresji biomarkerów na poziomie pojedynczej komórki.Umieszczenie komórek w monowarstwie ułatwia nie tylko ich analizę wizualną, ale prawdopodobnie także kwantyfikację ich ekspresji. Aparat sinus spin stosowany w naszych laboratoriach można zbudować z materiałów dostępnych w większości laboratoriów; wymaga on jedynie niewielkiej próbki komórek i nie potrzebuje żadnych specyficznych odczynników. Co ważniejsze, pozwala on na niezawodne uzyskanie rozkładu pojedynczych komórek do obserwacji. Oto niektóre elementy niezbędne do zbudowania aparatu cytozynow

immunocytochemical-analysis-human-pluripotent-stem-cells-using-self

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Immunocytochemiczna analiza ludzkich wielopotencjalnych komórek macierzystych za pomocą samodzielnie wykonanego aparatu Cytospin

Immunocytochemia jest potężną metodą pozwalającą określić obecność, lokalizację subkomórkową oraz względną obfitość interesującego antygenu w hodowlach komórkowych. Niniejszy protokół przedstawia łatwą do naśladowania serię kroków, które umożliwią oszczędność przeciwciał i zoptymalizują proces barwienia.

Immunocytochemia: ludzkie neuralne komórki macierzyste

Pluripotencjalne komórki macierzyste hodowane w zawiesinie różnicują się w ciała embrionalne (EB). W niniejszym materiale demonstrujemy, jak uzyskać wysokiej jakości krioprzekroje EB, które są przydatne do badania komórkowych i molekularnych aspektów embriogenezy, przy jednoczesnym zachowaniu ich organizacji w formie agregatów.

Analiza pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem krioprzesieków ciałek zarodkowych

Ten film demonstruje test do generowania organoidów mózgowych z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC). Ludzkie komórki iPS są indukowane do tworzenia ciał embrionalnych (EB). EB są hodowane na rusztowaniu polimerowym przy użyciu pożywki indukcyjnej, co sprzyja różnicowaniu się w nerwowe komórki macierzyste, komórki progenitorowe i niedojrzałe neurony. Na koniec EB są osadzane w matrycy i przenoszone do pożywki podtrzymującej w celu tworzenia organoidów mózgowych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych organoidów mózgowych pochodzących z komórek macierzystych

Tutaj prezentujemy naszą sprawdzoną metodę przeprogramowania ludzkich komórek somatycznych na wolne od transgenów ludzkie iPSC z wirusem Sendai, która wykazuje spójne wyniki i zwiększoną efektywność.

Wydajna generacja ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z ludzkich komórek somatycznych z wirusem Sendai

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół zapewnia prosty i skuteczny sposób namnażania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC) przy użyciu wyłącznie kondycjonowanych pożywek pochodzących z ludzkiego łożyska w naczyniu pokrytym żelatyną, bez dodatkowej suplementacji egzogennej lub syntetycznych substratów specyficznych dla hPSC.

Nowy model hodowli do namnażania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych na żelatynie w pożywkach kondycjonowanych łożyskiem

Regularna charakterystyka indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), w celu zapewnienia utrzymania ich stanu pluripotencjalnego, jest ważnym krokiem przed wykorzystaniem tych komórek do innych zastosowań. W tym miejscu opisujemy metodę rozmnażania ludzkich iPSC na małą skalę, zaprojektowaną specjalnie w celu umożliwienia ich łatwej i rutynowej charakterystyki za pomocą immunocytochemii.

Rozmnażanie na małą skalę ludzkich iPSC w warunkach wolnych od surowicy w rutynowej charakterystyce immunocytochemicznej

Ten protokół wprowadza prostą dwuetapową metodę różnicowania komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w warunkach hodowli wolnej od kseno- i komórek karmiących. Przedstawione tu metody hodowli komórkowych umożliwiają opłacalną produkcję na dużą skalę komórek o jakości klinicznej, mających zastosowanie w terapii komórkami rogówki.

Wydajne i skalowalne ukierunkowane różnicowanie klinicznie kompatybilnych komórek macierzystych nabłonka rąbka rogówki od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Prezentujemy szczegółowe protokoły generowania i charakterystyki modeli rozwoju 2D i 3D ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) opartych na korze nowej, a także uzupełniające metodologie umożliwiające jakościową i ilościową analizę biogenezy i funkcji rzęsek pierwotnych (PC).

Modele 2D i 3D oparte na pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka do analizy pierwotnego zaangażowania rzęsek podczas rozwoju kory nowej

Tutaj prezentujemy protokół dla zautomatyzowanego systemu hodowli komórek. Ten zautomatyzowany system hodowli zmniejsza nakład pracy i przynosi korzyści użytkownikom, w tym naukowcom niezaznajomionym z obsługą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPS), od utrzymania komórek iPS po różnicowanie w różne typy komórek.

Zautomatyzowany system hodowli do utrzymywania i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych przez człowieka

Poznaj metodę immunocytochemiczną ludzkich komórek pluripotencjalnych przy użyciu samodzielnie wykonanego aparatu cytospinowego. Technika ta umożliwia tworzenie monowarstwy komórek do precyzyjnej analizy markerów powierzchniowych SSEA-3 i SSEA-4.

Analiza immunocytochemiczna ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu samodzielnie wykonanego aparatu cytospinowego (Wideo) | JoVE Journal

Analiza immunocytochemiczna ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem własnoręcznie wykonanego urządzenia do cytocentryfugacji

Przeglądaj więcej filmów