Analiza immunocytochemiczna ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu samodzielnie wykonanego aparatu cytospinowego

Cześć, nazywam się Rick Pasqua i jestem studentem Laboratorium Inżynierii Komórek Macierzystych na Wydziale Nauk Chemicznych i Przyrodniczych Uniwersytetu Virginia Commonwealth. W tym filmie pokażę, w jaki sposób nasze laboratorium wykorzystuje niedrogi i samodzielnie wykonany aparat spinowy STO do stworzenia obserwowalnej monowarstwy ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do ilościowego oznaczania markerów powierzchni komórek. Biorąc pod uwagę, że wiele protokołów IMMUNOCHEMICZNYCH jest dostosowanych do h PSC hodowanych w szkiełkach komorowych jako kolonii, mogą pojawić się problemy z charakteryzacją ekspresji biomarkerów na poziomie poszczególnych komórek.

Umieszczenie komórek w jednej warstwie pomaga nie tylko w ich wizualnej analizie, ale być może także w ilościowym określeniu ich ekspresji, aparat do spinu zatokowego, którego używają nasze laboratoria, może być zbudowany przy użyciu materiałów znalezionych w większości laboratoriów, wymaga tylko małej próbki komórek i nie potrzebuje żadnego rodzaju specjalnego odczynnika. A co ważniejsze, jest w stanie niezawodnie odtworzyć rozprzestrzenianie się pojedynczych komórek w celu obserwacji. Oto kilka rzeczy, których będziesz potrzebować do skonstruowania aparatu cytozyny.

Zjeżdżalnie plastikowe, ponieważ niekoniecznie muszą być czyste, możesz użyć starych zjeżdżalni komorowych, jeśli chcesz. Wstępnie oczyszczone szkiełka podstawowe. Należy je wyczyścić, ponieważ w tym miejscu zostanie utworzona monowarstwa komórki.

Bibuła filtracyjna, każdy rodzaj powinien zrobić i końcówki do mikropipet. Końcówki o pojemności od jednego do 10 mikrolitrów są tym, czego używa nasze laboratorium przed rozpoczęciem budowy. Najpierw należy wykonać otwory w plastikowych prowadnicach.

Można to zrobić za pomocą wiertarki. Średnica otworów zależy od rozmiaru końcówki mikropipety i powinna być mniej więcej równa szerokości najszerszej części końcówki używanej w przypadku standardowej końcówki do mikropipet od jednej do 10. Powinno to wynosić około siedmiu milimetrów.

Ilość otworów, które utworzysz w plastikowych prowadnicach, całkowicie zależy od ich przeznaczenia. Na przykład do barwienia immunochemicznego w naszym laboratorium zwykle używamy dwóch otworów, jednego do barwienia dodatniego, a drugiego do kontroli negatywnego tła. Te slajdy mogą być ponownie używane przez nieokreśloną liczbę razy.

W przypadku bibuły filtracyjnej wystarczy wyciąć jej kawałek zgodnie z parametrami plastikowej prowadnicy. Użyj otworów szkiełka jako odniesienia do wykonywania otworów w bibule filtracyjnej. Rozmiar otworu w bibule filtracyjnej powinien być na tyle duży, aby końcówka mikropipety mogła dobrze pasować, jak pokazano tutaj.

Następnie musimy wyciąć odpowiednią liczbę końcówek mikropipet, po jednej na każdy otwór w przybliżeniu połowie jego długości. Będzie to służyć jako podstawa szkiełka podstawowego, w którym zostanie utworzona komórkowa warstwa mono. Następnie na to zostanie nałożona bibuła filtracyjna.

Bibuła filtracyjna posłuży do wchłonięcia nadmiaru pożywki z barwienia zawiesiny. Zostanie to następnie zwieńczone plastikową prowadnicą, która posłuży jako solidne podparcie aparatu. Można go następnie uszczelnić ze wszystkich czterech stron zwykłą taśmą domową.

Na koniec całe końcówki mikropipet są następnie wkładane do naciętych końcówek aparatu. Będzie to miejsce, w którym zostaną umieszczone próbki komórkowe po barwieniu zawiesiny. Pomocne może być również początkowe zaznaczenie, w którym miejscu na szkiełku znajdują się wycięte końcówki, aby ułatwić rozpoznanie.

Protokół barwienia zawiesiny immunochemicznej, który stosuje nasze laboratorium, polega na pierwszym pobraniu komórek macierzystych do zawiesiny pojedynczej komórki, zwykle odbywa się za pomocą enzymatyki, przy użyciu trypsyny lub nieenzymatycznych dysocjacji komórek na bazie EDTA. Komórki są następnie przenoszone na jeden ml dwóch mikroprobówek wirówkowych i ich standardowej pożywki wzrostowej. Są one następnie odwirowywane w temperaturze 200 G przez cztery minuty.

Ta sama prędkość wirowania będzie używana do wszystkich późniejszych etapów mycia i wirowania. Pożywka jest następnie ręcznie odsysana, należy zachować szczególną ostrożność podczas zasysania, aby upewnić się, że osad komórkowy pozostaje nienaruszony. Następnie przemuje się go dwukrotnie jednym ml PBS, za każdym razem wirując w dół i odsysając.

Następnym krokiem jest naprawienie komórek za pomocą 4% pary formaldehydu lub odczynników PFA potrzebnych do tego lub wymienionych w dołączonym opisie do tego filmu. Komórki inkubuje się w 4% roztworze formaldehydu i pozostawia w temperaturze pokojowej na 10 minut. Zaleca się, aby ten etap został przeprowadzony przed podaniem ex zawiesiny zewnątrzkomórkowej, barwienia do użycia aparatu cyto spinowego.

Następnie komórki są dwukrotnie myte PBS w celu usunięcia śladów PFA. Komórka powinna być następnie zablokowana, aby zapobiec niespecyficznemu barwieniu. Po przepłukaniu PBS na poprzednim etapie, odessać płukanie i dodać jeden ml roztworu blokującego.

Następnie należy go pozostawić w temperaturze pokojowej na około 45 minut. Czekając na roztwór blokujący, można przygotować przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczając je do zalecanego roztworu do rozcieńczenia i blokującego. Przechowuj to w czterech stopniach Celsjusza.

Po tym, jak komórki znajdują się w roztworze blokującym przez około 45 minut, odwiruj i odessaj go, a następnie zawiesij je w roztworze przeciwciała pierwotnego. Do celów wykrywania niespecyficznego wiązania i kontroli tła najlepiej jest zachować co najmniej jedną próbkę jako ujemną. Nie zastosowano przeciwciał pierwszorzędowych i jest to po prostu resus zawieszony w PBS.

Wszystkie próbki pozostawia się w temperaturze pokojowej na około godzinę. W razie potrzeby utrwalone komórki można pozostawić na noc w zawiesinie w roztworze przeciwciała pierwotnego i dwukrotnie przemyć roztworem blokującym. Wtórny roztwór przeciwciała można przygotować podczas mycia.

Przeciwciała drugorzędowe są zwykle wrażliwe na światło, więc jeśli to możliwe, przyciemnij światła laboratoryjne i przykryj wszelkie używane pojemniki folią aluminiową, ma to na celu zapobieżenie wybielaniu fluorescencyjnemu. Odczynniki Antify mogą być włączone do protokołu, ale należy zachować ostrożność przy ich stosowaniu, ponieważ może to skutkować wyższym tłem, takim jak pierwszorzędowe przeciwciało rozcieńczone do zalecanego stężenia w roztworze blokującym. Zastosować jedną vis do wszystkich próbek, niezależnie od tego, czy po zakończeniu mycia dodano do nich pierwotną, czy nie.

Pozostaw to w ciemnym miejscu, na przykład w słoiku, na około godzinę. Dwukrotnie przemyć komórki jednym ml roztworu blokującego. Komórka powinna być teraz gotowa do barwienia jądrowego barwnikiem DPI.

Przygotuj roztwór DPI w rozcieńczeniu od 1 do 10 000 w PBS, umyj komórki w jednym ml PBS raz, a następnie zreusuj, zawiesij w dpi i odstawmy w temperaturze pokojowej na około pięć do 10 minut. Podobnie jak przeciwciało wtórne, DAPI jest wrażliwe na światło, więc dokonaj niezbędnych zmian, aby zapobiec fluorescencji, wybielaniu. Umyj raz jednym ml PBS, a na koniec reus.

Zawiesić ponownie w jednym ml PBS. Powinien on być gotowy do użycia z aparatem do cyto spinowania. Umieść maksymalnie 100 mikrolitrów roztworu jednokomórkowego w górnej części końcówek mikropipet.

Zalecana jest jednak mniejsza ilość, aby zapobiec niepotrzebnemu przelewaniu się lub kapaniu. Potem. Umieść aparat do wirowania cyto i przeciwwagę w wirówce biurkowej i wiruj z prędkością 1000 obr./min przez cztery minuty. Następnie należy ostrożnie zdemontować aparat cyto spinowy w taki sposób, aby zminimalizować ryzyko wysunięcia się komórek ze szkiełka podstawowego.

Przed montażem sprawdź, czy w pozycji stojącej pod mikroskopem fluorescencyjnym odbyło się działanie. Są to zdjęcia wykonane monowarstwie komórki BG z jedną komórką V wybarwioną czterokomórkowymi markerami powierzchniowymi SSCA z aparatu cyto spinowego. Zwróć uwagę, jak bardzo komórki są od siebie odizolowane, co umożliwia obserwacje i rejestrowanie pojedynczych komórek.

Zaletą tego protokołu jest to, że jest on w stanie odtworzyć komórki jednowarstwowe, które są wykonalne, opłacalne i łatwo adaptowalne do każdej rutynowej analizy kultur komórek macierzystych. Mam nadzieję, że narysujesz ten film i znajdziesz protokół użycia we własnych badaniach.