Analiza immunocytochemiczna ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem własnoręcznie wykonanego urządzenia do cytocentryfugacji

Witam, nazywam się Rick Pasqua i jestem studentem w Laboratorium Inżynierii Komórek Macierzystych na Wydziale Nauk Chemicznych i Biologicznych na Virginia Commonwealth University. W tym filmie zaprezentuję, w jaki sposób w naszym laboratorium wykorzystujemy niedrogi, własnoręcznie wykonany aparat do wirowania STO, aby stworzyć obserwowalną monowarstwę ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do ilościowego oznaczenia markerów powierzchniowych komórek. Biorąc pod uwagę, że wiele protokołów immunochemicznych jest dostosowanych do hPSC hodowanych w szkiełkach z komorą w formie kolonii, mogą pojawić się problemy z charakterystyką ekspresji biomarkerów na poziomie pojedynczej komórki.

Umieszczenie komórek w monowarstwie ułatwia nie tylko ich analizę wizualną, ale prawdopodobnie także kwantyfikację ich ekspresji. Aparat sinus spin stosowany w naszych laboratoriach można zbudować z materiałów dostępnych w większości laboratoriów; wymaga on jedynie niewielkiej próbki komórek i nie potrzebuje żadnych specyficznych odczynników. Co ważniejsze, pozwala on na niezawodne uzyskanie rozkładu pojedynczych komórek do obserwacji. Oto niektóre elementy niezbędne do zbudowania aparatu cytozynowego.

Szkiełka plastikowe – ponieważ nie muszą być one koniecznie czyste, w razie potrzeby można użyć starych szkiełek z komorką. Wstępnie oczyszczone szkiełka szklane. Te muszą zostać wyczyszczone, ponieważ to na nich powstanie monowarstwa komórek.

Papier filtracyjny (dowolny rodzaj) oraz końcówki do mikropipety. W naszym laboratorium przed rozpoczęciem prac wykorzystuje się końcówki od 1 do 10 µL. W pierwszej kolejności należy wykonać otwory w plastikowych szkiełkach.

Można to wykonać za pomocą wiertarki stołowej. Średnica otworów zależy od rozmiaru końcówki mikropipety i powinna odpowiadać szerokości najszerszej części końcówki stosowanej w standardowej mikropipecie o zakresie 1–10 µL. Powinno to wynosić około siedmiu milimetrów.

Liczba otworów wykonanych w plastikowych szkiełkach zależy całkowicie od zamierzonego zastosowania. W przypadku barwień immunochemicznych przeprowadzanych w naszym laboratorium zazwyczaj stosujemy dwa otwory: jeden dla barwienia pozytywnego, a drugi dla negatywnej kontroli tła. Szkiełka te można wykorzystywać wielokrotnie.

W przypadku papieru filtracyjnego wystarczy wyciąć fragment o wymiarach odpowiadających plastikowej szkiełku. Jako punkt odniesienia przy wykonywaniu otworów w papierze filtracyjnym należy wykorzystać otwory w szkiełku. Otwór w papierze filtracyjnym powinien być na tyle duży, aby końcówka mikropipety mogła w nim ściśle osiąść, tak jak pokazano tutaj.

Następnie należy odciąć odpowiednią liczbę końcówek do mikropipety, jedną dla każdego otworu, odcinając je mniej więcej w połowie długości. Będą one służyć jako podstawa szkiełka przedmiotowego, w miejscu, gdzie zostanie utworzona monowarstwa komórkowa. Następnie na wierzch należy położyć papier filtracyjny.

Papier filtracyjny będzie służył do wchłaniania nadmiaru medium z barwienia w zawiesinie. Następnie zostanie on przykryty szklaną płytką, która będzie pełnić rolę sztywnej podpory aparatury. Całość można następnie uszczelnić z czterech stron za pomocą zwykłej taśmy klejącej.

Na koniec do odciętych końcówek aparatury wprowadza się całe końcówki do mikropipet. W tym miejscu zostaną umieszczone próbki komórkowe po barwieniu w zawiesinie. Pomocne może być również wstępne zaznaczenie miejsca położenia odciętych końcówek na szkiełku przedmiotowym, aby ułatwić ich rozpoznawanie.

Protokół immunochemicznego barwienia w zawiesinie stosowany w naszym laboratorium obejmuje w pierwszej kolejności pozyskanie komórek macierzystych w formie zawiesiny pojedynczych komórek, co zazwyczaj odbywa się poprzez trawienie enzymatyczne z użyciem trypsyny lub za pomocą nieenzymatycznych buforów do dysocjacji komórek opartych na EDTA. Następnie komórki przenosi się do probówek do mikrocentryfugi o pojemności 1 ml lub 2 ml wraz ze standardową pożywką wzrostową. Następnie próbki są wirowane przy 200 G przez cztery minuty.

Ta sama prędkość wirowania będzie stosowana we wszystkich kolejnych etapach przemywania i wirowania. Następnie medium jest manualnie aspirowane; należy zachować szczególną ostrożność podczas aspiracji, aby nie naruszyć osadu komórkowego. Następnie osad jest przemywany 1 ml PBS dwukrotnie, z wirowaniem i aspiracją po każdym razie.

Kolejny krok polega na utrwaleniu komórek przy użyciu 4% formaldehydu lub odczynników PFA; składniki niezbędne do ich przygotowania wymieniono w towarzyszącym temu filmowi opisie. Komórki inkubuje się w 4% roztworze formaldehydu w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Zaleca się przeprowadzenie tego etapu przed przygotowaniem zawiesiny zewnątrzkomórkowej oraz barwieniem z wykorzystaniem cyto-wirówki.

Następnie komórki przemywa się dwukrotnie PBS, aby usunąć pozostałości PFA. Komórki należy następnie poddać blokowaniu, aby zapobiec nieswoistemu barwieniu. Po przemyciach PBS w poprzednim kroku, odessać płuczkę i dodać 1 ml roztworu blokującego.

Następnie należy pozostawić próbkę w temperaturze pokojowej przez około 45 minut. W czasie oczekiwania na zakończenie procesu blokowania można przygotować przeciwciało pierwszorzędowe, rozcieńczając je w roztworze blokującym zgodnie z zalecanym stężeniem. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

Po inkubacji komórek w roztworze blokującym przez około 45 minut, należy je odwirować, odessać nadsącz i ponownie zawiesić w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego. W celu wykrycia nieswoistego wiązania i kontroli tła najlepiej zachować przynajmniej jedną próbkę jako kontrolę negatywną, w której nie zastosowano przeciwciała pierwszorzędowego, a komórki zawieszono jedynie w PBS.

Wszystkie próbki pozostawia się w temperaturze pokojowej przez około jedną godzinę. W razie potrzeby utrwalone komórki można pozostawić w zawiesinie w roztworze przeciwciała pierwszorzędowego przez noc, a następnie przemyć dwukrotnie roztworem blokującym. Roztwór przeciwciała wtórnego można przygotować podczas procesu płukania.

Przeciwciała wtórne są zazwyczaj światłoczułe, dlatego jeśli to możliwe, należy przyciemnić światła w laboratorium i owinąć wszystkie używane pojemniki folią aluminiową, aby zapobiec blaknięciu fluorescencji. Odczynniki Antifa mogą zostać włączone do protokołu, jednak należy zachować ostrożność podczas ich stosowania, ponieważ mogą one powodować wyższe tło, podobnie jak przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone do zalecanego stężenia w roztworze blokującym. Po zakończeniu mycia należy nałożyć odpowiedni odczynnik na wszystkie próbki, niezależnie od tego, czy dodano do nich przeciwciało pierwszorzędowe.

Pozostaw próbkę w ciemnym miejscu, np. wewnątrz słoja, na około godzinę. Przemyj komórki dwukrotnie 1 ml roztworu blokującego. Komórki powinny być teraz gotowe do barwienia jąder barwnikiem DPI.

Przygotuj początkowo roztwór DPI w rozcieńczeniu 1:10 000 w PBS, przemyj komórki raz w 1 ml PBS, następnie resuspenduj je w DPI i pozostaw w temperaturze pokojowej przez około 5 do 10 minut. Podobnie jak przeciwciała wtórne, DAPI jest światłoczułe, dlatego należy wprowadzić odpowiednie środki zapobiegające blaknięciu fluorescencji. Przemyj raz 1 ml PBS i na koniec ponownie zresuspenduj.

Ponownie zawiesić w 1 ml PBS. Próbka powinna być teraz gotowa do użycia w urządzeniu do cyto-wirowania. Odmierzyć maksymalnie 100 µl roztworu pojedynczych komórek do górnej części końcówek mikropipety.

Zaleca się jednak użycie mniejszej ilości, aby zapobiec niepotrzebnemu przelewaniu się lub wyciekaniu cieczy. Następnie umieść aparat do cytocentryfugacji wraz z przeciwwagą w wirówce stołowej i wiruj przy 1000 RPM przez cztery minuty. Po zakończeniu ostrożnie rozmontuj aparat do cytocentryfugacji w sposób, który zminimalizuje ryzyko odklejenia się komórek od szkiełka przedmiotowego.

Przed montażem należy zweryfikować pod mikroskopem fluorescencyjnym, czy nastąpiło osadzenie. Przedstawione zdjęcia obrazują monowarstwę komórek BG one V barwionych za pomocą czterech markerów powierzchniowych SSCA, otrzymaną z cyto-wirówki. Zauważ, jak odizolowane są od siebie komórki, co umożliwia obserwację i rejestrację pojedynczych komórek.

Zaletą tego protokołu jest możliwość uzyskania warstwy monowarstwy komórek w sposób wykonalny, kosztowo efektywny i łatwo adaptowalny do każdej rutynowej analizy kultur komórek macierzystych. Mam nadzieję, że ten materiał wideo okaże się przydatny, a protokół znajdzie zastosowanie w Państwa własnych badaniach.