Name: Przewlekły model myszy zakażony salmonellą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-31T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Poznaj metodę tworzenia przewlekłego modelu zakażenia Salmonella typhimurium u myszy. Procedura obejmuje podawanie streptomycyny, inokulację bakterii oraz monitorowanie kolonizacji jelit przez 27 tygodni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana grantem NIDDK KO1 DK075386 oraz grantem American Cancer Society RSG-09-075-01-MBC przyznanym Jun Sun.

Ten protokół obejmuje trzy części: hodowlę bakterii, gawagę u myszy oraz wykrywanie Salmonella.
1. Warunki wzrostu Salmonella.
<ol>
	<li>Przygotuj szalkę z bulionem Luria-Bertani (LB) dla Salmonella i inkubuj nocą w 37°C.</li>
	<li>Wybierz klon ze szalki LB i przenieś go do 7 ml bulionu LB w probówce 12 ml, następnie inkubuj z wstrząsaniem w 37°C przez około 5 godzin.</li>
	<li>Zainokuluj 50 ml bulionu LB za pomocą 0,05 ml hodowli w fazie stacjonarnej i inkubuj w 37°C bez wstrząsania przez około 18 godzin.</li>
	<li>Odrodź hodowlę bakteryjną nocną przez 10 minut w temperaturze pokojowej z prędkością 6000 rpm, a następnie zawieś bakterie w HBSS w stosunku 100:3 (LB: HBSS). Na przykład: Każde 50 ml hodowli LB zostanie zawieszone w 1,5 ml HBSS.</li>
	<li>W celu podania do zwierząt przez żołądek, dodatkowo rozcieńcz hodowlę bakteryjną w stosunku 1:10. Na przykład: Każde 1,5 ml hodowli LB zostanie zawieszone w 15 ml HBSS.</li>
</ol>
2. Model zakażenia Salmonella*
<ol>
	<li>Przygotuj roztwór streptomycyny. Każdemu myszowi podaje się 7,5 mg streptomycyny w 100 μl HBSS. Na przykład, przygotuj łącznie 90 mg streptomycyny w 1,2 ml HBSS dla 10 myszy. Zawsze przygotuj nieco większą objętość roztworu streptomycyny.</li>
	<li>Odebrać wodę i pokarm 4 godziny przed podaniem doustnym przez sondę.</li>
	<li>Podaj myszom streptomycynę za pomocą sondy doustnej w dawce 7,5 mg streptomycyny (100 μl HBSS dla myszy kontrolnych). Chwyć mocno skórę nad barkiem myszy kciukiem i palcem środkowym, a palcem wskazującym wyprostuj głowę i szyję, aby przełyk był prosty. Wprowadź kulkowy koniec igły do karmienia wzdłuż podniebienia, skieruj ją ku prawej stronie gardła, a następnie ostrożnie przesuń w dół przez przełyk i wstrzyknij 100 μl roztworu. Nie powinno być odczuwalnego oporu.</li>
	<li>20 godzin po podaniu streptomycyny ponownie odebrać wodę i pokarm przed zakażeniem myszy bakteriami.</li>
	<li>Podaj każdej myszy 100 μl zawiesiny w HBSS lub roztwór sterylnego HBSS (grupa kontrolna) za pomocą sondy doustnej. Procedura podawania jest taka sama jak w punkcie 2.3) podawanie streptomycyny.</li>
</ol>
*Eksperymenty na zwierzętach przeprowadzono z wykorzystaniem samiczych myszy C57BL/6 pozbawionych określonych patogenów (Taconic, Hudson, NY), w wieku 6–7 tygodni, zgodnie z wcześniejszym opisem1. Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Zasobów Zwierzęcych Uniwersytetu w Rochester (UCAR).
3. Wykrywanie Salmonella w jelitach.
<ol>
	<li>Zbierz mysie odchody (około 100 mg).</li>
	<li>Przenieś próbkę odchodów do rurki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1 ml roztworu PBS i intensywnie wortexuj.</li>
	<li>Wirowanie przez 10 minut przy 800 rpm. Przenieś supernatant do czystej rurki mikrowirówki.</li>
	<li>Wirowanie przy 6000 rpm przez 5 minut. Odrzuć supernatant i dodaj 200 μL roztworu PBS do osadu, następnie wortexuj.</li>
	<li>Przenieś 200 μl roztworu PBS na płytę BBL CHROMagar za pomocą jednorazowego rozsmarowacza komórek w celu wykrycia Salmonella. Gatunki Salmonella wyglądają na malinowo-fioletowe (od odcienia różowego do fioletowego, patrz ryc. 1). Jeśli 200 μl daje zbyt wiele kolonii na płycie, użyj 100 μl lub 50 μl do rozsmarowania.</li>
</ol>
4. Przykładowe wyniki.
Gdy protokół zostanie wykonany poprawnie, kolonizację przez Salmonella typhimurium można wykryć w jelitach myszy przez ponad 6 miesięcy. Salmonella może być wykrywana metodą posiewu kału przez ponad 6 miesięcy (Fig.1). Typowym przebiegiem tego modelu są utrata masy ciała i śmierć w ciągu 4 tygodni po zakażeniu. W zależności od szczepów Salmonella użytych do zakażenia, niektóre myszy mogą nie przeżyć ponad 6 miesięcy.
<img src="/files/ftp_upload/1947/1947fig1.jpg" alt="Morfologia komórek bakteryjnych, barwienie Grama, obraz mikroskopowy, pokazujący fioletowe i różowe bakterie." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Prątki Salmonella w jelicie z gatunku Salmonella mają kolor szarofioletowy (od różowego do fioletowego) z powodu różnic metabolicznych w obecności wybranych chromogenów. Inne bakterie są albo hamowane, albo tworzą kolonie niebiesko-zielone lub bezbarwne.
<img src="/files/ftp_upload/1947/1947fig2.jpg" alt="Wykres analizy przeżycia; procent przeżycia w porównaniu z dniem; grupa kontrolna a grupa PhoPc; wyniki eksperymentalne." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Proporcje przeżycia myszy zainfekowanych mutantycznym szczepem Salmonella PhoPc, PhoPc AvrA-, PhoPc AvrA-/AvrA+ oraz PhoPc AvrA przez 4 tygodnie (28 dni).
Tabela 1. Masa ciała myszy zakażonych Salmonella przez 4 tygodnie.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td> </td>
			<td>0</td>
			<td>1 tydzień</td>
			<td>2 tygodnie</td>
			<td>3 tygodnie</td>
			<td>4 tydzień</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>kontrola</td>
			<td>16,78 ± 1,05</td>
			<td>16,91 ± 1,28</td>
			<td>18,26 ± 1,23</td>
			<td>19,31 ± 1,26</td>
			<td>20,26 ± 1,15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhoPc</td>
			<td>16,89 ± 1,03</td>
			<td>17,14 ± 1,19</td>
			<td>17,43 ± 1,63*</td>
			<td>18,68 ± 1,78</td>
			<td>20,05 ± 1,11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhoPcAvrA-</td>
			<td>16,91 ± 1,12</td>
			<td>16,96 ± 1,39</td>
			<td>17,06 ± 2,14**</td>
			<td>18,71 ± 2,18</td>
			<td>20,15 ± 1,56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhoPc AvrA-/AvrA+</td>
			<td>16,94 ± 0,96</td>
			<td>17,17 ± 1,02</td>
			<td>17,63 ± 1,42*</td>
			<td>18,44 ± 2,03</td>
			<td>20,09 ± 1,17</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
*w porównaniu do grupy kontrolnej, p&lt;0,05 
** w porównaniu do grupy kontrolnej, p&lt;0,01
Tabela 2. Salmonella wykorzystane w tym badaniu.
<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Nazwa</td>
			<td>Opis</td>
			<td>Źródło lub referencja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Salmonella 14028s</td>
			<td>Dziki typ S. typhimurium</td>
			<td>ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhoPc</td>
			<td>Mutant regulatora złożonego niemalujący</td>
			<td>Miller et al., 1990</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhoPc AvrA-</td>
			<td>Mutacja AvrA-</td>
			<td>Collier-Hyams et al., 2002</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PhoPcAvrA-/AvrA+</td>
			<td>PhoPcAvrA- z uzupełniającym plazmidem kodującym AvrA</td>
			<td>Collier-Hyams et al., 2002</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

<ol><li>Duan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Catenin+activity+negatively+regulates+bacteria-induced+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">beta-Catenin activity negatively regulates bacteria-induced inflammation.</a> Lab Invest. 87 (6), 613-624 (2007).</li>
<li>Barthel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pretreatment+of+mice+with+streptomycin+provides+a+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+colitis+model+that+allows+analysis+of+both+pathogen+and+host%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Pretreatment of mice with streptomycin provides a Salmonella enterica serovar Typhimurium colitis model that allows analysis of both pathogen and host.</a> Infection and immunity. 71 (5), 2839-2858 (2003).</li>
<li>Miller, S. I., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constitutive+expression+of+the+phoP+regulon+attenuates+Salmonella+virulence+and+survival+within+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bacteriology%22%5BJournal%5D)">Constitutive expression of the phoP regulon attenuates Salmonella virulence and survival within macrophages.</a> Journal of bacteriology. 172 (5), 2485-2490 (1990).</li>
<li>Valdez, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nramp1+expression+by+dendritic+cells+modulates+inflammatory+responses+during+Salmonella+Typhimurium+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Nramp1 expression by dendritic cells modulates inflammatory responses during Salmonella Typhimurium infection.</a> Cell Microbiol. 10 (8), 1646-1661 (2008).</li>
<li>Woo, H., Okamoto, S., Guiney, D., Gunn, J. S., Fierer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+Salmonella+colitis+with+features+of+diarrhea+in+SLC11A1+wild-type+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A model of Salmonella colitis with features of diarrhea in SLC11A1 wild-type mice.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1603-e1603 (2008).</li>
<li>Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+call-and-response%3A+how+Salmonella+learns+the+gospel+from+its+host%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Molecular call-and-response: how Salmonella learns the gospel from its host.</a> Trends Microbiol. 11 (6), 245-246 (2003).</li>
<li>Zaharik, M. L., Vallance, B. A., Puente, J. L., Gros, P., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-pathogen+interactions%3A+Host+resistance+factor+Nramp1+up-regulates+the+expression+of+Salmonella+pathogenicity+island-2+virulence+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Host-pathogen interactions: Host resistance factor Nramp1 up-regulates the expression of Salmonella pathogenicity island-2 virulence genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 15705-15710 (2002).</li>
<li>Townsend, P., Morton, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory+Animal+Care+Policies+and+Regulations%3A+United+Kingdom%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Laboratory Animal Care Policies and Regulations: United Kingdom.</a> ILAR J. 37 (2), 68-74 (1995).</li>
<li>Olfert, E. D., Godson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humane+endpoints+for+infectious+disease+animal+models%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+J%22%5BJournal%5D)">Humane endpoints for infectious disease animal models.</a> ILAR J. 41 (2), 99-104 (2000).</li>
<li>Ye, Z., Petrof, E. O., Boone, D., Claud, E. C., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella+effector+AvrA+regulation+of+colonic+epithelial+cell+inflammation+by+deubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Salmonella effector AvrA regulation of colonic epithelial cell inflammation by deubiquitination.</a> Am J Pathol. 171 (3), 882-892 (2007).</li>
<li>Grassl, G. A., Valdez, Y., Bergstrom, K. S., Vallance, B. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+enteric+salmonella+infection+in+mice+leads+to+severe+and+persiste+nt+intestinal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Chronic enteric salmonella infection in mice leads to severe and persiste nt intestinal fibrosis.</a> Gastroenterology. 134 (3), 768-780 (2008).</li>
<li>Sukupolvi, S., Edelstein, A., Rhen, M., Normark, S. J., Pfeifer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+murine+model+of+chronic+Salmonella+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+immunity%22%5BJournal%5D)">Development of a murine model of chronic Salmonella infection.</a> Infection and immunity. 65 (2), 838-842 (1997).</li>
<li>Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL). , Fifth Edition, US Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health. (2007).</li>
<li>Wu, S., Lu, R., Zhang, Y., Sun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+effects+of+a+Salmonella+type+III+secretion+effector+protein+AvrA+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Chronic effects of a Salmonella type III secretion effector protein AvrA in vivo.</a> PLoS ONE. , Forthcoming (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Aby korzystać z tego systemu, badacz musi nauczyć się techniki gavage u zwierząt. Szczegółowo opisujemy metodologię przygotowania hodowli bakteryjnej oraz podawania jej myszom drogą gavage. Pokazujemy również, jak monitorować obecność Salmonella w przewodzie pokarmowym (GI). Krytyczne kroki w tym protokole obejmują: <ol> <li>Obróbka wstępna streptomycyną: Obróbka wstępna streptomycyną pozwala na usunięcie części komensalnej flory jelitowej i zwiększenie podatności myszy na zakażenie Salmonella <sup...

<table><tbody><tr><td>HBSS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ABCD1234</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Luria-Bertani</td><td>BD Biosciences</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Igła do podawania pokarmu</td><td>Popper &amp;amp; Sons, Inc.</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycyna</td><td>MP Biomedicals</td><td>100556</td><td></td></tr><tr><td>BBL CHROMagar &lt;em&gt;Salmonella&lt;/em&gt;</td><td>BD Biosciences</td><td>214983</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe rozprowadzacze do komórek</td><td>Biologix Research Company</td><td>65-1010</td><td></td></tr></tbody></table>

model myszy z przewlekłą infekcją salmonella

Chronic Salmonella Infected Mouse Model

Model myszy z infekcją bakteryjną jest potężnym systemem modelowym do badania takich obszarów jak infekcje, stany zapalne, immunologia, transdukcja sygnału oraz tumorigeneza. Wielu badaczy wykorzystało zapalenie jelita grubego wywołane przezSalmonellatyphimurium do badań nad wczesną fazą stanu zapalnego i infekcji. Jednakże, niewiele jest doniesień na temat infekcji przewlekłejin vivoMyszy zSalmonellatrwała obecność w przewodzie pokarmowym pozwala nam badać długoterminowe interakcje między gospodarzem a bakteriami, transdukcję sygnałów oraz procesy nowotworzenia. Opracowaliśmy model myszy z przewlekłą infekcją bakteryjną za pomocąSalmonellakolonizacja *T. typhimurium* w jelitach myszy w ciągu 6 miesięcy. Aby korzystać z tego systemu, badacz musi nauczyć się, jak przygotować kulturę bakteryjną oraz jak podawać ją zwierzętom przez zgłębnik. Szczegółowo opisujemy metodologię przygotowania kultury bakteryjnej i podawania jej myszom drogą zgłębnika. Pokazujemy również, jak wykryćSalmonellatrwałość w przewodzie pokarmowym. Ogólnie rzecz biorąc, niniejszy protokół pomoże badaczom wykorzystującym model myszy zakażonych bakteriami w odpowiedzi na fundamentalnie ważne pytania biologiczne i mikrobiologiczne.

Utworzenie chronicznego modelu mysiego z infekcją bakteryjną z trwałą kolonizacją jelit przez Salmonella typhimurium przez 27 tygodni.

Model myszy z przewlekłą infekcją Salmonella

Model myszy zakażonej bakteriami jest potężnym systemem modelowym do badania takich obszarów jak zakażenia, stany zapalne, immunologia, transdukcja sygnału i ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie modelu myszy z chroniczną infekcją salmonellą. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie roztworu salmonelli. Drugim krokiem procedury jest podanie myszom przez zgłębnik streptomyciny, a następnie salmonelli, lub podanie samej streptomyciny.Trzecim krokiem procedury jest wyizolowanie salmonelli z odchodów myszy oraz wykrycie zakażenia salmonellą w jelicie myszy przy użyciu płytek BL chroma. Końcowym etapem procedury jest obserwacja i zapisanie masy ciała myszy oraz odnotowanie zmian w witalności po zakażeniu salmonellą. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące, że zakażenie salmonellą może zostać ustanowione w jelitach myszy, którym podano salmonellę drogą zgłębnika.Cześć, jestem Michelle P z laboratorium dr. Johnsona w Katedrze Medycyny na Uniwersytecie w Rochester. Jestem również z laboratorium Sun, a ja jestem Y z laboratorium Sun. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę tworzenia modelu masy zakażonej Alytic Lennar.Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania transdukcji sygnałów w interakcjach między gospodarzem a bakteriami oraz procesów tumorogenezy. Zacznijmy zatem. Przed przystąpieniem do eksperymentu należy przygotować odpowiednią liczbę płytek z pożywką Luria-Bertani lub bulionem LB dla każdego szczepu Salmonella, które będą wykorzystywane w trakcie całego badania.Płytki można przechowywać w lodówce przez kilka miesięcy. Następnie należy przygotować kulturę salmonelli. Wyjmij fiolkę ze stokiem salmonelli mrożoną w temperaturze -80 °C i pozostaw ją do rozmrożenia na blacie, aby wysiać salmonellę.Wypal pętlę szczepiącą w palniku i zanurz ją w rozmrożonym materiale bakteryjnym. Wykonaj ruchy zygzakowate pętlą na górnej jednej trzeciej płytki LB. Ponownie wypal pętlę i obróć płytkę.Wykonaj zygzakową smugę, przecinając poprzednie linie, aby rozprowadzić bakterie na drugiej jednej trzeciej płytki. Powtórz tę czynność jeszcze raz. Ponownie wysterylizuj pętlę w płomieniu.Należy uważać, aby pętla nie przebiła agaru. Kolonie należy inkubować przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Jeśli procedura zostanie przeprowadzona prawidłowo, na płytce z salmonellą w co najmniej jednej sekcji powinny pojawić się pojedyncze kolonie.Następnego dnia. Wybierz klon z płytki LB, używając sterylnego wykałaczką lub pętlą bakteriologiczną, i przenieś go do 7 ml LB w probówce o pojemności 12 ml. Inkubuj probówkę w wytrząsarce w temperaturze 37 °C przez około pięć godzin.Użyj 0,05 ml tej kultury do inokulacji 50 ml LB w probówce typu Falcon. Inkubuj w temperaturze 37°C bez wytrząsania przez około 18 godzin.Wirować 50 ml nocnej kultury bakterii w temperaturze pokojowej przy 5 000 RPM przez 10 minut, a następnie odlać nadsącz. Następnie do probówki dodać 1,5 ml soli buforowej Hanksa (HBSS) w celu resuspensji bakterii, co odpowiada stosunkowi 100 części LB do 3 części HBSS. Następnie uzupełnić całkowitą objętość do 15 ml za pomocą HBSS, zachowując stosunek LB do HBSS wynoszący 1:10.Każda mysz wymaga 100 µL rozcieńczonej kultury salmonelli, lub od 1×10⁶ do 1×10⁸ jednostek tworzących kolonie (CFU) przed rozpoczęciem gavage; na cztery godziny przed eksperymentem należy odstawić myszom wodę i pokarm. Następnie, bezpośrednio przed gavage, należy przygotować roztwór streptomycyny, rozcieńczając 7,5 mg sproszkowanej streptomycyny w 100 µL HBSS. W przypadku każdej wstrzykiwanej myszy należy przygotować dodatkową objętość roztworu, aby uwzględnić straty przed gavage myszy.Najpierw przygotować igłę do podawania z 100 µL roztworu streptomycyny. Wyjąć z klatki pierwszą mysz w celu wykonania zgłębnika i trzymać ją przodem do blatu laboratoryjnego. Mocno chwycić kciukiem i palcem środkowym skórę nad barkiem myszy, rozciągając głowę i szyję palcem wskazującym, aby przełyk był prosty.Kieruj kulistą końcówką igły podawczej wzdłuż podniebienia w stronę prawej strony tylnej części gardła. Następnie delikatnie wprowadź ją w dół do przełyku i wstrzyknij 100 µL roztworu streptomycyny. Nie powinno być odczuwalnego oporu.Powtórz ten proces u wszystkich myszy eksperymentalnych i kontrolnych poddawanych badaniom. Około 20 godzin po podaniu strp de m i gavage oraz na cztery godziny przed podaniem salmonelli drogą gavage, odstaw wodę i pokarm myszom, które otrzymają salmonellę doustnie. Podaj każdej myszy roztwór salmonelli w HBSS w ilości 100 µL w ten sam sposób, co poprzednio.Po podaniu doustnym przez zgłębnik przenieś każdą mysz do nowej klatki, aby rozpocząć zbieranie kału. Zaczynając około ośmiu godzin po gavage, usuwaj kał z klatki natychmiast po jego wydaleniu. Zbierz 100 mg kału mysiego jako próbkę eksperymentalną.Pobierać próbki codziennie lub co tydzień, w zależności od czasu trwania badania, w celu analizy kału pod kątem obecności salmonelli. Przenieść próbkę kału do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml z 1 ml PBS, wymieszać intensywnie w wirówce typu vortex, a następnie wirować przez 10 minut przy 800 RPM. Przenieść nadsącz do czystej probówki 1,5 ml i wirować przy 6 000 RPM przez pięć minut.Odlej supernatant i dodaj 200 µL PBS do osadów, a następnie wymieszaj w wstrząsarze wirowym (vortex), aby je resuspenderować. Następnie wykryj salmonellę za pomocą płytki BB l roag. Na każdą płytkę nanieś od 10 do 100 µL roztworu z kałem, rozprowadzając go na powierzchni płytki zgodnie z opisem w sekcji drugiej.Gatunki salmonelli wykazują bordowy kolor ze względu na różnice metaboliczne w obecności wybranych chromogenów. Należy policzyć kolonie salmonelli na płytce, aby porównać stopień zakażenia u poszczególnych myszy. W tej procedurze eksperymentalnej wykorzystano samice myszy C 57 black six w wieku od sześciu do siedmiu tygodni, wolne od specyficznych patogenów.Myszy zainfekowano bakteriami salmonella oraz streptomycyną w roztworze HBSS. Grupę kontrolną myszy poddano gavage z samą streptomycyną. Wykorzystane szczepy salmonella obejmowały szczep dziki salmonella typhimurium, A TCC 1 4 0 2 8 S FP C, niepatogenny szczep mutant salmonella oraz trzy szczepy FPC z laboratorium dr. Jamesa Maderą, niosące związany z wirulencją gen AAV R age w niskokopiowym plazmidzie PSKW 29. Zastosowanie tego protokołu pozwala na wykrycie kolonizacji salmonella tyrian w jelitach myszy.Przewlekłą infekcję Salmonella mierzono poprzez analizę kału, a próbki masy ciała oraz tkanki jelitowej pobrano w celu przeprowadzenia barwienia immunofluorescencyjnego. Zazwyczaj utrata masy ciała i śmierć następują w ciągu czterech tygodni po infekcji. Przedstawione są tutaj proporcje przeżywalności cztery tygodnie po infekcji.Po przeżyciu czterech tygodni od zakażenia, myszy przybierają na wadze, a liczba zgonów maleje w ciągu pozostałych 23 tygodni. Ogólnie ponad 65% myszy zakażonych szczepami salmonelli FSY fsy, A VRA null lub fsy. A VRA heterozygote jest w stanie przeżyć ponad sześć miesięcy z trwałą infekcją salmonellą w jelitach.Po ostrej infekcji osobniki, które przeżyły, nadal były nosicielami salmonelli, co można było wykryć sześć miesięcy po zakażeniu, stosując metodę opisaną w niniejszym protokole. Analiza immunofluorescencyjna próbek tkanek z jelita myszy wykazuje inwazję salmonelli w błonie śluzowej jelita 27 tygodni po zakażeniu. Na tym obrazie jądra komórkowe są zabarwione na niebiesko, a zainfekowana salmonella jest widoczna w kolorze zielonym.Jak pokazano w grupie kontrolnej, nie występuje jasnopomarańczowego barwienia, co wskazuje na brak kolonizacji przez salmonellę. Natomiast u myszy zainfekowanych salmonellą w 27. tygodniu po infekcji, w błonie śluzowej jelit widoczne jest jasnopomarańczowe barwienie. Wykazuje to trwałość infekcji salmonellą u myszy poddanych wstępnemu leczeniu streptomycyną.Właśnie pokazaliśmy, jak indukować przewlekłą infekcję w modelu mysim. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o świeżym przygotowaniu hodowli do pasażowania, zastosowaniu prawidłowej techniki pasażowania oraz wykryciu obecności ANA, aby upewnić się, że model eksperymentalny działa poprawnie. To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przewlekły Salmonella Model infekcji myszy

Źródło: Lo, B. C. i in. Przewlekła infekcja salmonellą wywołana włóknieniem jelit. J. Vis. Exp. (2019)Film demonstruje ilościowe określenie obciążenia bakteryjnego w mysiim modelu przewlekłej infekcji streptomycynowooporną Salmonella typhimurium. Po eutanazji i sterylnej sekcji pobierane są tkanki cekalne i śledzionowe, ujednolicane stalowymi kulkami w celu uwalniania bakterii i seryjne rozcieńczane. Rozcieńczenia nakładane są na selektywnym agarze, a widoczne kolonie są liczone w celu...

Ilościowa ilościowa ilość obciążenia bakteryjnego tkanki w modelu myszy przewlekłej infekcji jelit

Źródło: Lenhard, A. i inni. Model myszy przedstawiający przejście Streptococcus pneumoniae z kolonizatora do patogena po współinfekcji wirusowej powtarza chorobę zaostrzoną przez wiek. J. Vis. Exp. (2022)Ten film pokazuje przetwarzanie płuc przez mysz współzakażoną patogenną bakterią i wirusem. Rozdrobnienie, homogenizacja i poszycie tkanki płucnej pozwala na ilościowe określenie obciążenia bakteryjnego, co wskazuje na rozprzestrzenianie się bakterii do płuc i nasilenie choroby.

Przetwarzanie zakażonych tkanek do enumeracji bakterii w modelu współinfekcji myszy

Zakażenie gryzoniami Citrobacter stanowi cenny model do badania infekcji bakteryjnych jelit, jak również odpowiedzi immunologicznych gospodarza i zapalenia jelita grubego u myszy. Protokół ten określa pomiar integralności bariery, obciążenia patogenem i uszkodzeń histologicznych, co pozwala na dokładne scharakteryzowanie udziału patogenu i gospodarza w zakaźnym zapaleniu jelita grubego u myszy.

Mysi model Citrobacter rodentium: badanie udziału patogenów i gospodarza w zakaźnym zapaleniu jelita grubego

Ten artykuł opisuje nowatorską metodę doustnego zakażenia myszy za pomocą żywności skażonej Listeria monocytogenes. Protokół można łatwo dostosować do stosowania z innymi patogenami bakteryjnymi przenoszonymi przez żywność.

Przenoszenie Listeria monocytogenes drogą pokarmową drogą pokarmową u myszy

Modele zwierzęce okazały się nieocenionymi narzędziami w definiowaniu mechanizmów specyficznych dla gospodarza i patogenu, które przyczyniają się do rozwoju przewlekłego stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy mysi model zakażenia jamy ustnej ludzkim patogenem Porphyromonas gingivalis i szczegółowo opisujemy metodologie oceny postępu stanu zapalnego w miejscach miejscowych i ogólnoustrojowych.

Mysi model przewlekłego stanu zapalnego wywołanego przez patogeny w miejscach lokalnych i ogólnoustrojowych

Ten protokół przedstawia mysi model zakażenia Clostridium difficile (CDI) cefoperazonu przy użyciu klinicznie istotnego i genetycznie podatnego szczepu, R20291. Nacisk na kliniczne monitorowanie choroby, liczenie bakterii C. difficile, cytotoksyczność toksyn i zmiany histopatologiczne w całym CDI w modelu mysim są szczegółowo opisane w protokole.

Mysi model szczepu Clostridium difficile R20291 leczony cefoperazonem

Ten protokół dostarcza niezbędnych kroków do ustalenia i oceny sepsy noworodków u 7-dniowych myszy.

Kontrolowany mysi model posocznicy wielodrobnoustrojowej u noworodków

Ten protokół opisuje mysi model zwłóknienia jelit wywołanego przez Salmonellę, który przypomina kluczowe patologiczne cechy choroby Leśniowskiego-Crohna, w tym przezścienne zapalenie i zwłóknienie. Metoda ta może być stosowana do oceny czynników gospodarza, które zmieniają wyniki zwłóknienia przy użyciu zmutowanych myszy utrzymywanych na tle genetycznym C57Bl/6.

Przewlekłe zwłóknienie jelit wywołane zakażeniem Salmonellą

Ten protokół opisuje indukcję monobakteryjnej sepsy Gram-ujemnej w systemie mysim. Model jest przydatny w badaniu zapalnych i śmiertelnych reakcji gospodarza podczas sepsy.

Charakterystyka septycznego zapalenia otrzewnej wywołanego przez Salmonellę Typhimurium u myszy

Ten artykuł opisuje nowy model myszy do przejścia pneumokoków z bezobjawowego kolonizatora w patogen chorobotwórczy podczas infekcji wirusowej. Model ten można łatwo zaadaptować do badania interakcji wielodrobnoustrojowych i gospodarz-patogen w różnych fazach progresji choroby i u różnych gospodarzy.

Mysi model przejścia Streptococcus pneumoniae z kolonizatora w patogen po koinfekcji wirusowej podsumowuje chorobę zaostrzoną wiekiem

Poznaj metodę tworzenia przewlekłego modelu zakażenia Salmonella typhimurium u myszy. Procedura obejmuje podawanie streptomycyny, inokulację bakterii oraz monitorowanie kolonizacji jelit przez 27 tygodni.

Model myszy z przewlekłą infekcją Salmonella

Przeglądaj więcej filmów