Przewlekły model myszy zakażony salmonellą

Ogólnym celem tej procedury jest ustalenie modelu myszy zakażonego przewlekłą salmonellą. Osiąga się to poprzez uprzednie przygotowanie roztworu salmonelli. Drugim etapem procedury jest podanie myszom streptomycyny, a następnie salmonelli lub samej streptomycyny.

Trzecim etapem procedury jest wyizolowanie salmonelli z kału myszy i wykrycie zakażenia salmonellą w jelicie myszy za pomocą płytek BL chroma. Ostatnim etapem zabiegu jest obserwacja i rejestracja masy ciała myszy oraz odnotowanie zmian w witalności po zakażeniu salmonellą. Ostatecznie można uzyskać wyniki, które wskazują, że zakażenie salmonellą można ustalić w jelicie myszy zarażonych salmonellą.

Cześć, nazywam się Michelle P i pracuję w laboratorium dr Johnsona na Wydziale Medycyny Uniwersytetu w Rochester. Ja też jestem z Sun Lab i jestem Y z Sun Lab. Dzisiaj pokażemy Państwu procedurę tworzenia modelu masy zakażonej Alytic Lennar.

Używamy tej procedury w naszej pracy do badania interakcji bakterii gospodarza, transdukcji sygnału i genezy guza. Więc zacznijmy. Przed eksperymentem przygotuj wystarczającą ilość talerzy bulionu luria, berti lub LB dla każdego szczepu salmonelli i do wykorzystania przez cały eksperyment.

Talerze można przechowywać w lodówce i przechowywać przez kilka miesięcy. Następnie przygotuj kulturę salmonelli. Wyjmij fiolkę z bulionem z salmonellą zamrożoną w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza i pozwól jej rozmrozić się na blacie, aby pokryć płomień salmonelli.

Pętlę zaszczepiającą w bułkach i palniku i zanurz w rozmrożonym bulionie bakteryjnym. Zygzak pętli w przód iw tył w górnej jednej trzeciej płyty LB. Ponownie zapal pętlę i obróć płytkę.

Zygzakiem przesuń pętlę, aby przeciąć poprzednie smugi i rozprowadzić bakterie po drugiej jednej trzeciej płytki. Powtórz jeszcze raz. Znowu płonąca pętla.

Nie pozwól, aby pętla wniknęła do agaru. Pozwól koloniom rosnąć, przechowując przez noc płytki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Jeśli zostanie to wykonane prawidłowo, płytka salmonelli powinna dać pojedyncze kolonie w co najmniej jednej sekcji.

Następnego dnia. Wybierz klon z płytki LB za pomocą sterylnej wykałaczki lub pętli bakteryjnej i włóż do siedmiu mililitrów LB w 12-mililitrowej probówce. Potrząsaj probówką w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez około pięć godzin.

Użyj 0,05 mililitra tej kultury do zaszczepienia. 50 mililitrów LB w probówce Falcon. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wstrząsania przez około 18 godzin.

Wirować 50-mililitrową kulturę bakteryjną przez noc w temperaturze pokojowej przy 5 000 obr./min przez 10 minut i wyrzucić supernatant. Następnie dodaj 1,5 mililitra buforowanego roztworu soli Hanka lub HBSS do probówki, aby ponownie zawiesić bakterie lub 100 części funta na trzy części HBSS. Następnie zwiększ całkowitą objętość do 15 mililitrów za pomocą HBSS lub stosunek LB do HBSS jeden do 10.

Każda mysz wymaga 100 mikrolitrów rozcieńczonej kultury salmonelli lub od jednego razy 10 do sześciu do 10 do ośmiu jednostek tworzących kolonie przed rozpoczęciem pobierania wody i pokarmu od myszy na cztery godziny przed eksperymentem. Następnie przygotuj roztwór streptomycyny bezpośrednio przed zgłębnikiem, rozcieńczając 7,5 miligrama sproszkowanej streptomycyny w 100 mikrolitrach HBSS. Dla każdej wstrzykniętej myszy upewnij się, że przygotowałeś dodatkową objętość, aby uwzględnić straty przed zgłębkiem myszy.

Najpierw przygotuj igłę do karmienia ze 100 mikrolitrami roztworu streptomycyny. Wyjmij pierwszą mysz z klatki, aby otrzymać zgłębnik i przytrzymaj mysz skierowaną w stronę blatu. Chwyć mocno skórę nad ramieniem myszy kciukiem i środkowym palcem, rozciągając głowę i szyję palcem wskazującym, aby wyprostować przełyk.

Skieruj końcówkę kulkową igły do karmienia wzdłuż podniebienia i w kierunku prawej strony tylnej części gardła. Następnie delikatnie przełóż go do przełyku i wstrzyknij 100 mikrolitrów roztworu streptomycyny. Nie powinno być odczuwalnego żadnego oporu.

Powtórz ten proces dla wszystkich myszy eksperymentalnych i kontrolnych poddawanych eksperymentom. Po około 20 godzinach od strp de m i zgłębnika oraz cztery godziny przed zgłębnikiem salmonelli, należy pobrać wodę i pokarm od myszy, które otrzymają zgłębnik salmonelli doustnie. Zgłębnik każdej myszy w taki sam sposób jak poprzednio, używając 100 mikrolitrów roztworu salmonelli w HBSS.

Po zgłębniku przenieś każdą mysz do nowej klatki, aby rozpocząć zbieranie kału. Zaczynając około ośmiu godzin po zgłębniku, usuń kał z klatki natychmiast po upuszczeniu. Zbierz 100 miligramów kału myszy jako próbkę eksperymentalną.

Pobieraj próbki codziennie lub co tydzień, w zależności od długości badania w celu analizy salmonelli w kale. Przenieś próbkę kału do 1,5 mililitra mikroprobówki wirówkowej z jednym mililitrem PBS i energicznie wiruj przez 10 minut przy 800 obr./min. Przenieść supernatant do czystej wirówki probówkowej o pojemności 1,5 mililitra przy 6 000 obr./min na pięć minut.

Odrzucić supernatant i dodać 200 mikrolitrów PBS do wiru granulek w celu ponownego zawieszenia. Następnie wykryj salmonellę za pomocą płytki BB l roag. Użyj od 10 do 100 mikrolitrów roztworu kału na płytkę, rozprowadzając na płytce, jak pokazano w sekcji drugiej.

Gatunek salmonelli wydaje się mieć zniekształcony kolor ze względu na różnice metaboliczne w obecności wybranych chromogenów. Policz kolonie salmonelli na talerzu, aby porównać poziom infekcji wśród poszczególnych myszy. W tej procedurze eksperymentalnej wykorzystaliśmy swoistą, wolną od patogenów samicę C 57 czarnych myszy w wieku od sześciu do siedmiu tygodni.

Myszy były zakażone salmonellą i streptomycyną oraz HBSS. Myszy kontrolowano zgłębnik za pomocą streptomycyny, zastosowano tylko szczepy salmonelli, w tym szczep typu dzikiego salmonella typhimurium, A TCC 1 4 0 2 8 S FP C, niepatogenny zmutowany szczep salmonelli i trzy szczepy FPC z laboratorium dr Jamesa Madery niosące gen wieku R związany z wirulencją AAV w PSKW 29, plazmid o niskiej kopii. Za pomocą tego protokołu można wykryć kolonizację salmonelli tyriańskiej w jelicie myszy.

Przewlekłe zakażenie salmonellą mierzono za pomocą analizy kału i pobrano próbki masy ciała i tkanki jelitowej do barwienia immunofluorescencyjnego. Zazwyczaj utrata masy ciała i śmierć następują w ciągu czterech tygodni po zakażeniu. Proporcje przeżycia cztery tygodnie po zakażeniu są pokazane tutaj.

Gdy myszy przeżyją cztery tygodnie po zakażeniu, myszy przybierają na wadze, a liczba zgonów zmniejsza się w ciągu pozostałych 23 tygodni. Ogólnie rzecz biorąc, ponad 65% myszy zakażonych szczepami salmonelli, FSY fsy, A VRA null lub fsy. Heterozygota VRA może przetrwać ponad sześć miesięcy z uporczywym zakażeniem salmonellą w jelicie.

Po ostrej infekcji osoby, które przeżyły, nadal były nosicielami salmonelli, którą można było wykryć sześć miesięcy po zakażeniu przy użyciu metody opisanej w tym protokole. Analiza immunofluorescencyjna próbek tkanek z jelita myszy wykazała inwazję salmonelli w błonie śluzowej jelit po 27 tygodniach od zakażenia. Na tym obrazie jądra są zabarwione na niebiesko, a zakażenie salmonellą jest pokazane na zielono.

Jak wykazano w grupie kontrolnej, nie ma jasnozielonego zabarwienia, co wskazuje na brak kolonizacji salmonelli. Natomiast u myszy zakażonych salmonellą po 27 tygodniach od zakażenia występuje jasnozielone zabarwienie błony śluzowej jelit. Pokazuje to utrzymywanie się zakażenia salmonellą u myszy poddanej wstępnej obróbce streptomycyny.

Właśnie pokazaliśmy, jak wywołać przewlekłą infekcję niektórych w modelu mysim. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać o przygotowaniu świeżo kultury do garażu, poprawieniu umiejętności warsztatowych i wykryciu istnienia ANA, aby upewnić się, że model eksperymentu działa. Więc to wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.