Name: Test bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) dla interakcji białko-białko w komórkach cebuli przy użyciu pistoletu genowego Helios (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-12T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Poznaj metodę BiFC do badania interakcji białko-białko w komórkach epidermy cebuli przy użyciu pistoletu genowego Helios. Technika ta umożliwia wizualizację interakcji czynników transkrypcyjnych Arabidopsis in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr. Steve'owi Mountowi oraz dr Xiaoning Zhang za konstrukt 35S::GFP pGlowbug, a także za stypendium doktorskie Hokensen przyznane C. H. Badania w laboratorium Z. L. są wspierane przez amerykańską Narodową Fundację Naukową (National Science Foundation, IOB0616096 i MCB0744752). Z. L. otrzymuje częściowe wsparcie z Uniwersyteckiej Stacji Doświadczalnej Rolniczej Uniwersytetu Maryland.

I. Przygotowanie plazmidu
Plazmidowe DNA używane do bombardowania musi charakteryzować się wysoką czystością i stężeniem wynoszącym 50ng/μl lub wyższym. W przypadku BiFC z wykorzystaniem dwóch konstruktów plazmidowych wymagane jest 25 μg każdego z plazmidów. Innymi słowy, należy zmieszać dwa plazmidy w stosunku molowym 1:1, aby uzyskać łącznie 50 μg plazmidowego DNA do przygotowania wkładów. Należy pamiętać, że dodanie więcej niż 50 μg DNA może spowodować aglomerację cząsteczek złota, czego należy unikać. Do izolacji plazmidowego DNA zaleca się stosowanie dostępnych komercyjnie zestawów do ekstrakcji DNA plazmidowego.
Wektory plazmidowe powinny być stosunkowo małe, np. pUC19. Sklonowano cDNA SEU oraz LUH odpowiednio do pUC19-SPYNE i pUC19-SPYCE3. Wektory binarne do transformacji za pośrednictwem Agrobacterium są zbyt duże i nieodpowiednie do bombardowania.
II. Przygotowanie kartridża
Przygotowanie wkładów polega na powleczeniu cząsteczek złota plazmidowym DNA i umieszczeniu ich w plastikowej rurce, która następnie jest cięta na kawałki o długości pół cala, możliwe do umieszczenia w uchwytach wkładów do armaty genowej. Przygotowanie wkładów zostało szczegółowo opisane w osobnym artykule Jove4, dlatego nie opisuje się go tutaj. W przypadku bombardowania komórek cebuli zalecamy zmieszanie 50 μg plazmidowego DNA z 12,5 mg cząsteczek złota na jedną partię preparatu, co pozwala uzyskać do 50 wkładów przy stężeniu 1 μg DNA/0,25 mg złota na wkład. Każdy wkład służy do jednego strzału. Cząsteczki złota mogą mieć średnicę 0,6 μm lub 1,0 μm (Cat #165262 lub Cat #165263; Biorad). Do przygotowania wkładów zalecamy również stosowanie roztworu PVP o stężeniu 0,5 mg/ml. W przypadku BiFC należy połączyć dwa plazmidowe DNA każdego z domniemanych partnerów oddziałujących w obrębie jednej partii preparatu wkładów.
Po przygotowaniu wkładów należy je przetestować, wystrzeliwując nowo wykonane wkłady pod ciśnieniem helu od 150 do 20 psi w kwadratowy fragment Parafilmu owinięty wokół szalki Petriego. Pozwoli to sprawdzić, czy cząstki złota są efektywnie wyrzucane z wkładów; na Parafilmie powinny pojawić się słabo widoczne cząstki złota. Pozwala to ocenić obszar, który zostanie pokryty przez pojedynczy strzał. Można zauważyć różną ilość cząstek złota wyrzuconych na Parafilm przy różnych ciśnieniach helu (w zakresie 150-20 psi). Jeśli nie występuje istotna różnica, do bombardowania należy wybrać niższe ciśnienie.
III. Przygotowanie tkanek cebuli
W dniu przeprowadzania zdjęć obierz zewnętrzną warstwę skórki z dużej żółtej cebuli. Używając czystego i ostrego ostrza żyletki, wytnij obszar prostokątny o wymiarach około 2 X 8 cm na głębokość 4-5 warstw. Wyjmij prostokątną tkankę cebuli, odrzuć dwie zewnętrzne warstwy, a pozostałe warstwy cebuli potnij na kawałki o rozmiarach około 2X1,5 cm. Umieść kawałki cebuli w szalce Petriego zawierającej papier filtracyjny (wycięte w krążki papier Whatman 3MM) zwilżony sterylną wodą. Przykryj szalkę Petriego; próbki są gotowe do użycia.
IV. Bombardowanie
<ol>
 <li> Załaduj wkłady do białych, okrągłych uchwytów na wkłady. Wkłady zawierające różne konstrukty plazmidowe należy załadować do osobnych uchwytów. Każdy uchwyt może pomieścić do 12 wkładów na 12 strzałów.</li>
 <li> Włóż baterię i nową wkładkę lufy do pistoletu genowego Helios. Upewnij się, że zarówno wkładka lufy, jak i pistolet mają zamontowane odpowiednie uszczelki typu o-ring.</li>
 <li> Najpierw włóż do pistoletu genowego pusty uchwyt na wkłady, tak aby oznaczenie #12 na uchwycie było skierowane ku górze pistoletu. Przesuń uchwyt raz lub dwa razy, aby upewnić się, że został poprawnie zainstalowany. </li>
 <li> Podłącz pistolet do butli z helem i ustaw ciśnienie w zakresie od 150 do 20 psi.</li>
 <li> Załóż ochronniki słuchu i oddaj kilka strzałów z pustym uchwytem, aby oczyścić komorę pistoletu i upewnić się, że ciśnienie jest stabilne. </li>
 <li> Wyjmij pusty uchwyt i włóż załadowany uchwyt na wkłady. Przesuń uchwyt tak, aby wkład, z którego chcesz wystrzelić, znajdował się na dole (godzina 6) uchwytu. Wystrzelenie w kawałek cebuli na tym etapie stanowi formę kontroli negatywnej dla fluorescencji tła.</li>
 <li> Umieść kawałki cebuli na środku pustej szalki Petriego, tak aby wewnętrzna warstwa cebuli była skierowana do góry. Oprzyj wkładkę lufy pistoletu genowego o szalkę Petriego i oddaj strzał, przytrzymując boczny przycisk i naciskając spust. Przenieś bombardowaną cebulę do szalki Petriego zawierającej zwilżony papier filtrujący 3MM. </li>
 <li> Przejdź do następnego wkładu i wystrzel w inny kawałek cebuli. Powtarzaj ten krok, aż zostanie wystrzelonych od czterech do pięciu kawałków cebuli. Każdy kawałek cebuli jest ostrzeliwany raz.</li>
 <li> Zmień uchwyt na inny, załadowany wkładami zawierającymi inny plazmid lub inną kombinację plazmidów. Pamiętaj o wymianie wkładki lufy, aby zapobiec kontaminacji. Wystrzel w cztery do pięciu kawałków cebuli. </li>
 <li> Po bombardowaniu przenieś wszystkie kawałki cebuli z powrotem do szalek Petriego. Przykryj szalki pokrywkami. Owiń je Parafilmem, aby zapobiec wysychaniu. Inkubuj kawałki cebuli w temperaturze pokojowej w ciemności przez 16-48 godzin.</li>
 <li> Wyłącz dopływ gazu i zwolnij ciśnienie przed odłączeniem pistoletu genowego od butli z helem. Wykręć wkładkę lufy, a następnie wyjmij uchwyt na wkłady oraz zużyte (lub niezużyte) wkłady.</li>
 <li> Wyczyść uchwyty na wkłady i wkładki lufy, zanurzając je w zlewce z wodą z mydłem. Umieść zlewkę w myjce ultradźwiękowej i poddaj działaniu ultradźwięków przez 20 minut. Następnie opłucz je wodą, aby usunąć wszystkie pozostałości mydła. Namocz je w 70% etanolu przez godzinę, a następnie osusz na ręcznikach papierowych.</li>
</ol>
V. Obserwacja
<ol>
 <li> Po inkubowaniu bombardowanych fragmentów cebuli przez 16-20 godzin w temperaturze pokojowej, można obserwować fluorescencję GFP lub YFP przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego, takiego jak Zeiss Axio Observer.z1 wykorzystany w niniejszym badaniu.</li>
 <li> Za pomocą pęsety o płaskich końcach powoli oddzielić pojedynczą warstwę komórek z wewnętrznej epidermy cebuli (warstwy bezpośrednio skierowanej w stronę urządzenia do bombardowania). Umieścić preparat na kropli wody na szkiełku przedmiotowym. Nałożyć szkiełko nakrywkę, dbając o zminimalizowanie ilości pęcherzyków powietrza.</li>
 <li> W świetle przeświecanym mikroskopu sprawdzić najpierw obecność cyklozy, aby upewnić się, że komórki są żywe. W tym celu naświetlać preparat światłem pola jasnego przez kilka minut w celu ogrzania tkanki cebuli, a następnie szukać ruchomych plastydów. Cykloza nie zawsze jest łatwa do zaobserwowania, dlatego nie należy się zrażać w przypadku jej braku.</li>
 <li> Do detekcji fluorescencji należy użyć odpowiednich filtrów wzbudzenia i emisji dla GFP lub YFP. Ważne jest uwzględnienie kontroli negatywnych, takich jak fragmenty cebuli bombardowane niefluorescencyjnym plazmidem. Słabe żółte sygnały mogą pojawiać się w komórkach uszkodzonych, pęcherzykach powietrza lub resztkach tkankowych. Równie ważne jest uwzględnienie kontroli pozytywnych. Plazmid zawierający konstytutywnie ekspresowany reporter fluorescencyjny, taki jak 35S::GFP, stanowi doskonałą kontrolę pozytywną. Widoczne sygnały GFP w komórkach epidermy cebuli (Rysunek 1A, D) wskazują, że wkłady, tkanki cebuli oraz proces strzelania z genu-pistoletu zostały prawidłowo przygotowane i przeprowadzone. Następnie zaobserwowano interakcje między SEU-pSPYNE a LUH-pSPYCE w fragmentach cebuli bombardowanych wkładami zawierającymi mieszaninę DNA 35S::SEU-pSPYNE i 35S::LUH-pSPYCE. Słaba fluorescencja YFP została zaobserwowana wyłącznie w jądrze komórkowym (Rysunek 1 B, E), co wskazuje na bezpośrednią fizyczną interakcję między SEU a LUH, która doprowadziła do połączenia fragmentów rozszczepionego YFP w jądrze. Należy zauważyć, że sygnał YFP z BiFC jest znacznie słabszy niż sygnał GFP z 35S::GFP.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
W opisanym tutaj badaniu plazmid kontrolny 35S::GFP wykazuje silną fluorescencję, która wypełnia całą komórkę, w tym zarówno jądro, jak i cytoplazmę (Rycina 1A, D). Białko GFP jest na tyle małe, że dyfunduje do jądra bez sygnału lokalizacji jądrowej. W przeciwieństwie do niego, SEU i LUH to dwa czynniki transkrypcyjne Arabidopsis, o których wcześniej wykazano, że oddziałują ze sobą w teście drożdżowego systemu dwuhybrydowego2. SEU-pSPYNE (SEU połączone z fragmentem N-końcowym YFP) oraz LUH-pSPYCE (LUH połączone z fragmentem C-końcowym YFP), oba zbyt duże, aby dyfundować do jądra, zawierają sygnały lokalizacji jądrowej2,5. Sygnał fluorescencji YFP wykryty w jądrze komórkowym cebuli (Rycina 1 B, E) wskazuje, że SEU-pSPYNE i LUH-pSPYCE mogą oddziaływać w jądrach cebuli. Nie wykryto sygnału fluorescencji w cebulach bombardowanych mieszaniną plazmidów składającą się z plazmidu wektora pSPYNE zawierającego fragment N-końcowy YFP oraz LUH-pSPYCE (Rycina 1C, F).
Fluorescencja YFP indukowana przez BiFC jest znacznie słabsza niż fluorescencja GFP pochodząca z plazmidu 35S::GFP. W naszym badaniu białka te wykazały również różną lokalizację subkomórkową (porównać rysunek 1A z B). Dodatkowo, liczba komórek fluorescencyjnych jest znacznie mniejsza w przypadku BiFC, ponieważ metoda ta działa tylko wtedy, gdy oba plazmidy partnerskie skutecznie wnikną i zostaną wykazane w tych samych komórkach cebuli.

<img src="/files/ftp_upload/1963/1963fig1.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna komórek roślinnych, ukazująca chlorofil i strukturę komórkową, analiza eksperymentu." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Obrazy fluorescencyjne (A, B, C) i w polu jasnym (D, E, F) komórek cebuli poddanych bombardowaniu różnymi konstruktami plazmidowymi. (A) i (D), komórki cebuli poddane bombardowaniu 35S::GFP. GFP dyfunduje przez cytoplazmę i jądro komórkowe. (B) i (E), komórki cebuli poddane bombardowaniu równomolarnymi mieszaninami DNA plazmidowego 35S::SEU-pSPYNE (SEU połączone z fragmentem N-końcowym YFP) oraz 35S::LUH-pSPYCE (LUH połączony z fragmentem C-końcowym). Interakcja między SEU-pSPYNE a LUH-pSPYCE jest widoczna jako fluorescencyjne jądro komórkowe. (C) i (F), kontrola negatywna przedstawiająca komórki cebuli poddane bombardowaniu mieszaninami plazmidów wektora pUC19-SPYNE i LUH-pSPYCE. Nie wykryto sygnału fluorescencyjnego.

<ol><li>Hu, C. D., Chinenov, Y., Kerppola, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+interactions+among+bZIP+and+Rel+family+proteins+in+living+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Visualization of interactions among bZIP and Rel family proteins in living cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Mol Cell. 9 (4), 789-789 (2002).</li>
<li>Sitaraman, J., Bui, M., Liu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LEUNIG_HOMOLOG+and+LEUNIG+perform+partially+redundant+functions+during+Arabidopsis+embryo+and+floral+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">LEUNIG_HOMOLOG and LEUNIG perform partially redundant functions during Arabidopsis embryo and floral development.</a> Plant Physiol. 147 (2), 672-672 (2008).</li>
<li>Walter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+protein+interactions+in+living+plant+cells+using+bimolecular+fluorescence+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Visualization of protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.</a> Plant J. 40 (3), 428-428 (2004).</li>
<li>Woods, G., Zito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+gene+gun+bullets+and+biolistic+transfection+of+neurons+in+slice+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Azhakanandam, S., Nole-Wilson, S., Bao, F., Franks, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SEUSS+and+AINTEGUMENTA+mediate+patterning+and+ovule+initiation+during+gynoecium+medial+domain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">SEUSS and AINTEGUMENTA mediate patterning and ovule initiation during gynoecium medial domain development.</a> Plant Physiol. 146 (3), 1165-1165 (2008).</li>
<li>Zhang, X. N., Mount, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+alternatively+spliced+isoforms+of+the+Arabidopsis+SR45+protein+have+distinct+roles+during+normal+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Two alternatively spliced isoforms of the Arabidopsis SR45 protein have distinct roles during normal plant development.</a> Plant Physiol. 150 (3), 1450-1450 (2009).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

<ol>
<li>	Osobom korzystającym z urządzenia po raz pierwszy zalecamy przećwiczenie całej procedury, od przygotowania wkładu po obserwację, z użyciem pojedynczego konstytutywnego reportera plazmidowego, takiego jak 35S::GFP lub 35S::GUS. W naszej pracy wykorzystaliśmy plazmid 35S::GFP uzyskany od dr Steve’a Mounta i dr Xiaoning Zhang6 (Rycina 1A, D). Wkłady kontrolne do transfekcji genowej sprzedawane przez RioRad (Kat 165-2244) nie nadają się do stosowania u roślin.</li>
<li>	W przypadku BiFC konieczne jest zastosowanie drugiej kontr...

<table><tbody><tr><td>Żółta cebula</td><td>Dowolny dostawca</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Działo genowe Helios</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny z odpowiednimi filtrami dla GFP lub YFP</td><td>Zeiss, Nikon, Olympus</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analiza bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej (bifc) w celu badania oddziaływań białko-białko w komórkach cebuli z wykorzystaniem armatki genowej helios

Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene Gun

Badanie funkcji genów w różnych organizmach opiera się na wiedzy o tym, w jaki sposób produkty genów oddziałują ze sobą w ich naturalnym środowisku komórkowym. Test bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC)1pozwala badaczom na wizualizację oddziaływań białko-białko w żywych komórkach i stało się niezbędnym narzędziem badawczym. Analiza ta opiera się na ułatwionym łączeniu się dwóch fragmentów białka fluorescencyjnego (GFP), z których każdy jest połączony z potencjalnym białkiem partnerskim. Oddziaływanie dwóch partnerów białkowych ułatwia asocjację fragmentu N-końcowego i C-końcowego GFP, co prowadzi do powstania fluorescencji. Dla badaczy roślin komórki epidermy cebuli stanowią idealny system eksperymentalny do przeprowadzania analizy BiFC ze względu na łatwość pozyskiwania i przygotowania tkanek cebuli oraz możliwość bezpośredniej wizualizacji fluorescencji przy minimalnej fluorescencji tła. Do bombardowania komórek cebuli DNA plazmidowym powszechnie wykorzystuje się Helios Gene Gun (BioRad). Prezentujemy zastosowanie Helios Gene Gun do wprowadzania konstruktów plazmidowych dla dwóch oddziałującychArabidopsis thalianaczynniki transkrypcyjne, SEUSS (SEU) oraz LEUNIG HOMOLOG (LUH)2oraz wizualizacja ich oddziaływań pośredniczonych przez BiFC w komórkach epidermy cebuli.

Niniejszy artykuł ilustruje, jak prawidłowo używać gene gun BioRad Helios do wprowadzania plazmidowego DNA do komórek epidermy cebuli oraz jak badać oddziaływania białko-białko w komórkach cebuli w oparciu o zasadę bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC)

Analiza bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej (BiFC) w celu badania oddziaływań białko-białko w komórkach cebuli z wykorzystaniem armatki genowej Helios

Badanie funkcji genów u różnych organizmów opiera się na wiedzy o tym, w jaki sposób produkty genów oddziałują ze sobą w ich naturalnym środowisku komórkowym ...

Niniejsza procedura bada in vivo oddziaływania białko-białko pomiędzy dwoma regulatorami transkrypcji Arabidopsis, SEU (skrót od SEUS) oraz LUH (skrót od LUHOLOG). Wykorzystując biomolekularną komplementację fluorescencji, SEU jest fuzją z fragmentem N-końcowym żółtego białka fluorescencyjnego (YFP), a LUH jest fuzją z fragmentem C-końcowym YFP w obrębie DNA obu konstruktów plazmidowych. Konstrukty SEU-NYFP oraz LUH-CYFP są wprowadzane metodą bombardowania do komórek epidermy cebuli w celu przetestowania ich oddziaływania.Interakcja między Seuss a LUH powoduje asocjację fragmentów terminalnych końcowych i C-terminalnych białka YFP w jądrach komórkowych, co prowadzi do fluorescencji YFP w jądrach. Po inkubacji przez 16 do 20 godzin w ciemności, łuski epidermy cebuli są obserwowane pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu wizualizacji fluorescencji. Cześć, jestem Courtney Hollander z laboratorium dr. Zhi Lu z Katedry Biologii Komórki i Genetyki Molekularnej na University of Maryland.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę testowania interakcji białko-białko w komórkach cebuli przy użyciu mikrowstrzykiwacza genów BioRad Helios. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania interakcji białko-białko oraz lokalizacji białek w komórkach roślinnych. Zapraszamy do rozpoczęcia.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować wkłady do armatki genowej Helios zgodnie z protokołem JoVE opracowanym przez Woodsa i Zeto w 2008 roku, który szczegółowo demonstruje procedurę przygotowania wkładów dla każdej serii. 50 µg całkowitego plazmidowego DNA miesza się z 12,5 mg cząsteczek złota oraz roztworem PVP o stężeniu 0,5 mg/mL dla BIFC. Stosując tę samą metodę przygotowania wkładów, łączy się dwa plazmidowe DNA domniemanych oddziałujących białek: Seuss połączone z N-końcową połową YFP (w skrócie seus-NYFP) oraz LU Homolog połączony z C-końcową połową YFP (w skrócie L-U-H-C-Y-F-P).Łączna ilość wynosi 50 µg na jedną partię, co pozwala na przygotowanie do 50 wkładów przy stężeniu 1 µg DNA na 0,25 mg złota w każdym wkładzie. Każdy wkład służy do jednego strzału. Po przygotowaniu wkładów należy je przetestować, aby sprawdzić, czy cząstki złota są efektywnie wyrzucane.Owiń kwadratowy kawałek parafilmu wokół szalki Petriego. Następnie ustaw ciśnienie helu w zakresie od 150 do 200 PSI i wystrzel nowo wykonane wkłady w kwadrat parafilmu. Zaobserwuj słabo widoczne złote cząsteczki na parafilmie.Różne ilości cząstek złota mogą zostać wstrzyknięte na próbkę przy różnych ciśnieniach helu. Jeśli jednak nie stwierdzono istotnych różnic, do bombardowania należy wybrać niższe ciśnienie. Test ten wskazuje również obszar pokryty przez każdy pojedynczy strzał.Aby przygotować tkanki cebuli, należy zdjąć zewnętrzną skórkę z dużej żółtej cebuli, używając czystej i ostrej żyletki. Wyciąć prostokątny obszar o wymiarach 2×8 cm, obejmujący od czterech do pięciu warstw. Wyjąć prostokątny fragment tkanki cebuli i odrzucić dwie zewnętrzne warstwy.Pozostałe warstwy cebuli pokrój na kawałki o boku około 1,5 cm. Kawałki cebuli umieść w szalce Petriego zawierającej krążki z papieru filtrowanego o średnicy 3 mm. Zwilż szalkę Petriego sterylną wodą i przykryj ją.Kawałki cebuli są gotowe do bombardowania. Najpierw należy umieścić wkłady w białych, okrągłych uchwytach; do poszczególnych uchwytów należy włożyć wkłady zawierające różne konstrukty plazmidowe. Każdy uchwyt może pomieścić do 12 wkładów, co pozwala na wykonanie 12 strzałów.W tym miejscu ładowane są trzy różne uchwyty. Pierwszy uchwyt zawiera wkłady z 35 S-G-F-P-A, silnym i konstytutywnym promotorem pochodzącym z wirusa mozaiki kapusty. Plazmid ten służy jako kontrola dodatnia.Drugi uchwyt wypełnia się wkładami eksperymentalnymi zawierającymi równą ilość S-E-U-N-Y-F-P oraz L-U-H-C-Y-F-P. Trzeci uchwyt wypełnia się wkładami zawierającymi równomolową mieszaninę wektora puck spine oraz LUH puck spice. Służy to również jako kontrola negatywna.Włóż baterię oraz nową wkładkę lufy do armatki genowej Helios. Upewnij się, że zarówno wkładka lufy, jak i armatka mają zamontowane odpowiednie pierścienie O-ring. Następnie włóż do armatki genowej pusty uchwyt kasety w taki sposób, aby oznaczenie numer 12 na uchwycie było skierowane ku górze armatki.Przesuń uchwyt wkładu raz lub dwa razy, aby upewnić się, że został prawidłowo włożony. Następnie podłącz pistolet do butli z helem i ustaw ciśnienie w zakresie od 150 do 200 PS. Zakładam ochronniki słuchu i oddaję kilka strzałów, przytrzymując boczny przycisk podczas naciskania spustu. Strzelanie z pustym uchwytem wkładu oczyszcza komorę pistoletu i zapewnia stabilne ciśnienie.Przed wystrzeleniem DNA, wystrzelenie fragmentu cebuli może służyć jako kontrola negatywna dla fluorescencji tła. Aby wystrzelić nanocząsteczki złota pokryte DNA, wyjmij pusty uchwyt kaset i włóż pierwszy załadowany uchwyt kaset zawierający kontrolę pozytywną. Przesuń uchwyt kaset tak, aby kaseta przeznaczona do wystrzału znajdowała się na dole uchwytu kaset.Teraz należy umieścić kawałki cebuli na środku pustej szalki Petriego, tak aby wewnętrzna warstwa cebuli była skierowana do góry. Oprzyj osłonę lufy armatki genowej o szalkę Petriego i oddaj strzał. Przejdź do następowego wkładu i ostrzelaj inny kawałek cebuli.Powtarzaj ten krok, aż zostanie wystrzelonych od czterech do pięciu fragmentów cebuli. Każdy fragment cebuli należy wystrzelić tylko raz. Przenieś ostrzelony fragment cebuli do szalki Petriego zawierającej wilgotny papier filtracyjny o grubości 3 mm w celu inkubacji wystrzelonych kartridży eksperymentalnych.Zmień kartridż na Holden. Po drugie, pamiętaj o wymianie wkładki lufy, aby zapobiec kontaminacji. Wystrzel cztery do pięciu kawałków cebuli, tak jak pokazano przed chwilą, dla kontroli pozytywnej.Następnie zmień kasetę na Holden. Numer trzy, zawierającą ujemną kontrolę DNA. I ponownie wprowadź cztery do pięciu fragmentów cebuli.Wymień wkładkę lufy, aby zapobiec kontaminacji. Po bombardowaniu przykryj pokrywkami szalki Petriego zawierające kawałki cebuli.Owiń je parafilmem, aby zapobiec wysychaniu. Inkubuj kawałki cebuli w temperaturze pokojowej w ciemności przez 16 do 48 godzin. Po zakończeniu bombardowania wyłącz gaz i zwolnij ciśnienie przed odłączeniem armatki genowej od butli z helem, odkręć wkładkę lufy, a następnie wyjmij uchwyt kaset oraz zużyte kasety.Na koniec należy wyczyścić uchwyty kolumnek oraz wkładki tłoka, zanurzając je w zlewce z wodą z mydłem i poddając sonikacji przez 20 minut. Następnie należy opłukać je wodą, aby usunąć wszystkie pozostałości mydła.Namoczyć w 70% etanolu przez godzinę, a następnie osuszyć na ręcznikach papierowych. Przystąpić do obserwacji fragmentów cebuli od 16 do 20 godzin po bombardowaniu. Po inkubowaniu bombardowanych fragmentów cebuli przez 16 do 20 godzin w temperaturze pokojowej, użyć pęsety z płaskimi końcami, aby powoli oddzielić pojedynczą warstwę komórek z wewnętrznej epidermy cebuli.Jest to warstwa, która podczas bombardowania znajduje się bezpośrednio naprzeciw pistoletu. Umieść odwarstwioną warstwę w kropli wody na szkiełku podstawowym, a następnie przykryj ją szkiełkiem nakrywką. Należy przy tym zachować ostrożność, aby zminimalizować powstawanie pęcherzyków powietrza.Obserwuj fluorescencję GFP lub YFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, takiego jak przedstawiony tutaj Zeiss Axio Observer Z1, korzystając z pola jasnego mikroskopu. Najpierw sprawdź występowanie cyklozy w cytoplazmie, aby upewnić się, że komórki są żywe. Aby to zrobić.Naświetlaj preparat światłem w polu jasnym przez kilka minut, aby ogrzać tkankę cebuli, a następnie poszukaj ruchomych plastyd. Strumieniowanie cytoplazmatyczne nie zawsze jest łatwe do zaobserwowania, dlatego nie zrażaj się, jeśli nie będzie ono wyraźnie widoczne. Do detekcji fluorescencji użyj odpowiednich filtrów wzbudzenia i detekcji dla GFP lub YFP. Sprawdź również kontrole negatywne, którymi są fragmenty cebuli zaszczepione niefluorescencyjnym plazmidem.Słabe żółte sygnały mogą pochodzić z uszkodzonych komórek, debris oraz cebul. Należy również sprawdzić kontrole pozytywne. Plazmid zawierający konstytutywnie ekspresowany reporter fluorescencyjny.Fluorescencja GFP jest widoczna w niektórych, ale nie we wszystkich komórkach. Pęcherzyki powietrza mogą również generować fluorescencję tła. Widoczne sygnały GFP z komórek epidermy cebuli wskazują, że kasety, tkanki cebuli oraz strzelanie z armatki genowej zostały prawidłowo przygotowane i wykonane.Przedstawiono tutaj silną fluorescencję obserwowaną w plazmidzie pozytywnym 35 SGFP. Silna fluorescencja jest widoczna w całej komórce, obejmując zarówno jądro, jak i cytoplazmę. Obraz w świetle przechodzącym pozwala dostrzec odpowiadające im zarysy komórek i jąder.Nie każda komórka ulega transformacji. Sygnał fluorescencyjny YFP jest wykrywany w jądrze komórkowym cebuli, gdy kombinacja eksperymentalna Seuss, NYFP oraz L-U-H-C-Y-F-P zostanie wprowadzona do komórek cebuli metodą bombardowania, co wskazuje, że Seuss NYFP i L-U-H-C-Y-F-P oddziałują in vivo. Jednakże fluorescencja wynikająca z tej interakcji jest znacznie słabsza niż fluorescencja wywołana przez 35 SGFP w kontroli pozytywnej.Ponadto czynniki transkrypcyjne SEUS i LUH lokalizują się w jądrach komórkowych. W związku z tym fluorescencja YFP jest obserwowana wyłącznie w jądrze. Co więcej, liczba komórek fluorescencyjnych jest znacznie niższa niż w przypadku dodatniej kontroli 35 SGFP.Dzieje się tak, ponieważ B FFC działa tylko wtedy, gdy oba plazmidy partnerskie są ekspresowane w tych samych komórkach cebuli. W cebulach bombardowanych za pomocą uchwytu wkładu numer trzy, zawierającego mieszankę kolców, wektora i L-U-H-C-Y-F-P, nie wykryto sygnału fluorescencyjnego, co jest zgodne z oczekiwaniami dla kontroli negatywnej. Przedstawiliśmy właśnie sposób bombardowania komórek cebuli w celu badania oddziaływań białko-białko przy użyciu systemu gene gun BioRad Helios.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o zastosowaniu odpowiednich kontroli pozytywnych i negatywnych oraz świadomość, że fluorescencja BIFC może charakteryzować się słabszym sygnałem i mniejszą liczbą komórek fluorescencyjnych. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

bimolecular-fluorescence-complementation-bifc-assay-for-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie dwucząsteczkowego dopełnienia fluorescencji (BiFC) w celu oceny oddziaływania białko-białko w komórkach cebuli z użyciem działa Helios Gene Gun

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Subkomórkowa lokalizacja białek jest kluczowa dla określenia czasowo-przestrzennej regulacji sygnalizacji komórkowej. W niniejszym opracowaniu opisujemy bimolekularną komplementację fluorescencji (BiFC) jako prostą metodę monitorowania przestrzennych oddziaływań białek w komórce.

Bimolekularna komplementacja fluorescencyjna

Opracowaliśmy technikę testowania oddziaływań białko-białko w roślinach. Żółte białko fluorescencyjne (YFP) zostaje rozdzielone na dwa niezachodzące na siebie fragmenty. Każdy fragment jest klonowany w jednej ramce odczytu z genem zainteresowania za pomocą systemu Gateway, co umożliwia ekspresję białek fuzyjnych. Rekonstytucja sygnału YFP następuje tylko wtedy, gdy badane białka oddziałują ze sobą.

Wykrywanie oddziaływań białkowych w roślinach z wykorzystaniem systemu bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) kompatybilnego z systemem Gateway

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji dostarcza wysokoprzepustową metodę ilościową do badania interakcji białko-białko. Metodologia ta może być stosowana do mapowania miejsc wiązania białek oraz do badań przesiewowych czynników regulujących interakcję białko-białko.

Analiza cytometryczna cytometrii dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji: wysokoprzepustowa metoda ilościowa do badania interakcji białko-białko

Tworzenie kompleksów białkowych in vivo można wizualizować za pomocą dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji. Partnerzy interakcji są łączeni z komplementarnymi częściami znaczników fluorescencyjnych i przejściowo ulegają ekspresji w liściach tytoniu, co skutkuje odtworzonym sygnałem fluorescencyjnym po bliskim zbliżeniu dwóch białek.

Interakcje białko-białko uwidocznione przez dwucząsteczkową komplementację fluorescencyjną w protoplastach i liściach tytoniu

Interakcje białko-białko są wizualizowane w komórkach z nanometrową rozdzielczością przestrzenną poprzez połączenie dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji (BiFC) z fotoaktywowaną mikroskopią lokalizacyjną (PALM). Opisano tutaj zastosowanie BiFC-PALM do obrazowania oddziaływań Ras-Raf w komórkach U2OS do wizualizacji klastrowania i dyfuzji w nanoskali poszczególnych kompleksów Ras-Raf.

Fotoaktywowana mikroskopia lokalizacyjna z dwucząsteczkową komplementacją fluorescencji (BiFC-PALM)

Ten manuskrypt opisuje łatwą i szybką procedurę eksperymentalną do określania interakcji białko-białko na podstawie pomiaru aktywności lucyferazy.

Test obrazowania komplementacji lucyferazy w liściach Nicotiana benthamiana do przejściowego określania dynamiki interakcji białko-białko

Opracowaliśmy nową metodę współekspresji wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach, aby przezwyciężyć trudności konwencjonalnych metod. Wykorzystuje wykorzystanie plazmidu o pojedynczej ekspresji, który zawiera wiele funkcjonalnie niezależnych kaset z ekspresją białek, aby osiągnąć koekspresję białka.

Efektywna koekspresja wielu chimerycznych fluorescencyjnych białek fuzyjnych w roślinach

Ten protokół demonstruje użycie testu ligacji zbliżeniowej do badania interakcji białko-białko in situ w linii zarodkowej C. elegans.

Wykrywanie in situ składania kompleksów rybonukleoproteinowych w linii zarodkowej C. elegans przy użyciu testu ligacji zbliżeniowej

Tutaj prezentujemy metodę wizualizacji tworzenia się kompleksu trójskładnikowego między trzema partnerami białkowymi za pomocą białek znakowanych fluorescencyjnie za pomocą testu FRET-FLIM opartego na BiFC. Metoda ta jest cenna w badaniu kompleksów interakcji białko-białko in vivo.

Oznaczanie trójstronnej interakcji między dwoma monomerami czynnika transkrypcyjnego MADS-box i białka czujnika wapnia za pomocą testu BiFC-FRET-FLIM

W protokole przedstawiono metodę kowalencyjnego przyłączania biotyny do białek in vivo w oparciu o ich bliskość do ligazy biotyny połączonej z białkiem będącym przedmiotem zainteresowania. Modyfikacja ta pozwala na selektywne wzbogacanie białek za pomocą kulek streptawidyny, zgodnie z potrzebami w badaniach interakcji białkowych.

In vivo (in vivo ) Biotynylacja zbliżeniowa w badaniach interakcji białkowych w Pantofelku czworobocznym

Poznaj metodę BiFC do badania interakcji białko-białko w komórkach epidermy cebuli przy użyciu pistoletu genowego Helios. Technika ta umożliwia wizualizację interakcji czynników transkrypcyjnych Arabidopsis in vivo.

Test bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) dla interakcji białko-białko w komórkach cebuli przy użyciu pistoletu genowego Helios (Wideo) | JoVE Journal

Analiza bimolekularnej komplementacji fluorescencyjnej (BiFC) w celu badania oddziaływań białko-białko w komórkach cebuli z wykorzystaniem armatki genowej Helios

Przeglądaj więcej filmów