Test bimolekularnej komplementacji fluorescencji (BiFC) dla interakcji białko-białko w komórkach cebuli przy użyciu pistoletu genowego Helios

Procedura ta testuje in vivo interakcję białek białkowych między dwoma regulatorami transkrypcji Arabidopsis, seus pisanymi SEU, w skrócie i lu holog lub LUH. Wykorzystując biomolekularną komplementację fluorescencyjną, seus jest łączony z końcowym fragmentem żółtego białka fluorescencyjnego lub YFP, a LUH jest łączony z końcowym fragmentem Y-F-P-D-N-A dwóch konstruktów plazmidowych. Seuss, NYFP i L-U-H-C-Y-F-P są bombardowane komórkami naskórka cebuli w celu zbadania ich interakcji.

Interakcja między Seussem i LUH prowadzi do asocjacji końcowych i C końcowych fragmentów YFP w jądrach, co prowadzi do fluorescencji YFP w jądrach. Po inkubacji przez 16 do 20 godzin w ciemności skórki naskórka cebuli obserwuje się pod mikroskopem fluorescencyjnym w celu uwidocznienia fluorescencji. Cześć, nazywam się Courtney Hollander i pracuję w laboratorium dr Zhi Lu na Wydziale Biologii Komórki i Genetyki Molekularnej Uniwersytetu Maryland.

Dzisiaj pokażemy Wam procedurę badania interakcji białko-białko w komórkach cebuli za pomocą pistoletu genowego BioRad Helios. Używamy tej procedury w naszym laboratorium do testowania interakcji białko-białko i lokalizacji białek w komórkach roślinnych. Więc zacznijmy.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować wkłady do pistoletu genowego Helios zgodnie z Protokołem Joe Video Protocol autorstwa Woodsa i Zeto 2008, który szczegółowo pokazuje procedurę przygotowania wkładu dla każdego przygotowania wkładów. 50 mikrogramów całkowitego DNA osocza miesza się z 12,5 miligramami cząstek złota i 0,5 miligrama na mililitr roztworu PVP dla BIFC. Łącząc ten sam preparat kartridża, dwa plazmowe DNA przypuszczalnie oddziałujących białek Seuss połączyły się z końcową połową N YFP, w skrócie seus, NYFP i LU Homolog połączyły się z końcową połową C YFP, w skrócie L-U-H-C-Y-F-P.

Łączna ilość wynosi 50 mikrogramów na preparat, co daje do 50 wkładów przy jednym mikrogramie DNA na 0,25 miligrama złota na wkład. Każdy nabój jest przeznaczony do jednego strzału. Po przygotowaniu naboju przetestuj naboje, aby dowiedzieć się, czy cząsteczki złota są skutecznie napędzane.

Owiń kwadratowy kawałek paraformy wokół szalki Petriego. Następnie ustaw ciśnienie helu na od 150 do 200 PSI i wystrzel nowo wyprodukowane naboje w kwadrat parametru. Obserwuj słabe cząsteczki złota na perfumach.

Różne ilości cząsteczek złota mogą być wypychane na perfumy pod różnym ciśnieniem helu. Jeśli jednak nie ma znaczącej różnicy, wybierz niższe ciśnienie do bombardowania. Test ten wskazuje również obszar objęty każdym przebiegiem strzału.

Aby przygotować tkanki cebuli, oderwij zewnętrzną skórkę od dużej żółtej cebuli za pomocą czystej i ostrej żyletki. Wytnij prostokątny obszar o wymiarach dwa na osiem centymetrów o głębokości od czterech do pięciu warstw. Wyjmij prostokątną tkankę cebuli i wyrzuć dwie zewnętrzne warstwy.

Pozostałe warstwy cebuli pokrój na około 1,5 centymetra kwadratowego kawałki. Umieść kawałki cebuli na szalce Petriego zawierającej kółka z bibuły filtracyjnej o średnicy trzech mm. Zwilżoną sterylną wodą przykryj szalkę Petriego.

Kawałki cebuli są gotowe do bombardowania. Najpierw załaduj naboje do białych okrągłych uchwytów na naboje, załaduj naboje zawierające różne konstrukcje plazmidowe do różnych uchwytów na naboje. Każdy uchwyt na naboje może pomieścić do 12 nabojów na 12 strzałów.

Ładowane są tutaj trzy różne uchwyty. W pierwszym zbiorniku znajdują się wkłady zawierające 35 S-G-F-P-A silnego i konstytutywnego promotora wirusa mozaiki kalafiora. Ten plazmid służy jako kontrola pozytywna.

Drugi uchwyt jest załadowany eksperymentalnymi nabojami zawierającymi równą ilość S-E-U-N-Y-F-P i L-U-H-C-Y-F-P. Trzeci uchwyt na kartridże jest załadowany nabojami zawierającymi równą molową mieszankę wektora grzbietu krążka i przyprawy krążka LUH. Służy to również jako kontrola negatywna.

Włóż baterię i świeżą wkładkę lufy do pistoletu genowego Helios. Upewnij się, że zarówno wkładka lufy, jak i pistolet mają zamocowane odpowiednie O-ringi. Następnie włóż pusty uchwyt na naboje do pistoletu genowego z oznaczeniem numer 12 na uchwycie naboju skierowanym w górną część pistoletu.

Przesuń uchwyt wkładu raz lub dwa razy, aby upewnić się, że jest prawidłowo włożony. Następnie przymocuj pistolet do zbiornika helu i dostosuj ciśnienie w zakresie od 150 do 200 KM. Noszę ochronniki słuchu i oddaję kilka strzałów z pistoletu, przytrzymując boczny przycisk podczas pociągania za spust. Strzelanie z pistoletu z załadowanym pustym uchwytem na nabój czyści komorę pistoletu i zapewnia stabilne ciśnienie.

Przed wystrzeleniem DNA, wystrzelenie kawałka cebuli w tym miejscu może być negatywną kontrolą fluorescencji tła. Aby wystrzelić cząstki złota pokryte DNA, wyjmij pusty uchwyt naboju i włóż pierwszy załadowany uchwyt naboju zawierający kontrolę pozytywną. Przesunąć uchwyt naboju tak, aby nabój przeznaczony do strzelania znajdował się na dnie uchwytu naboju.

Teraz umieść kawałki cebuli na środku pustej szalki Petriego najbardziej wewnętrzną warstwą cebuli skierowaną do góry. Oprzyj wkładkę lufy pistoletu genowego na szalce Petriego i odpal broń. Przejdź do następnego naboju i strzel w inny kawałek cebuli.

Powtarzaj ten krok, aż wystrzeliwuje się od czterech do pięciu kawałków cebuli. Każdy kawałek cebuli jest wystrzeliwany tylko raz po strzeleniu. Przenieś zbombardowany kawałek cebuli na szalkę Petriego zawierającą wilgotną bibułę filtracyjną o średnicy trzech mm, aby wystrzelić wkłady eksperymentalne.

Zmień na kartusz Holden. Po drugie, pamiętaj o wymianie wkładki lufy, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Strzel od czterech do pięciu kawałków cebuli, jak pokazano w celu kontroli pozytywnej.

Następnie zmień na kartusz Holden. Numer trzy, zawierający DNA kontroli negatywnej. I znowu strzel od czterech do pięciu kawałków cebuli.

Wymień wkładkę lufy, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Po bombardowaniu. Przykryj szalki Petriego zawierające kawałki cebuli pokrywkami.

Owiń je paraformem, aby zapobiec wysuszeniu. Inkubuj kawałki cebuli w temperaturze pokojowej w ciemności przez 16 do 48 godzin. Po zakończeniu bombardowania wyłącz gaz i zwolnij ciśnienie przed odłączeniem pistoletu genowego od zbiornika helu, odkręć wkładkę lufy i wyjmij uchwyt naboju oraz zużyte naboje.

Na koniec wyczyść uchwyty nabojów i wkładki lufy, zanurzając je w zlewce z wodą z mydłem i sonicate. Przez 20 minut. Następnie spłucz wodą, aby usunąć wszelkie pozostałości mydła.

Namocz w 70% etanolu przez godzinę, a następnie wysusz na ręcznikach papierowych. Przystąp do obserwacji kawałków cebuli od 16 do 20 godzin po bombardowaniu. Po inkubacji bombardowanych kawałków cebuli przez 16 do 20 godzin w temperaturze pokojowej użyj kleszczyków z płaskimi końcami, aby powoli oderwać pojedynczą warstwę komórek od wewnętrznego naskórka cebuli.

Jest to warstwa, która jest skierowana bezpośrednio w stronę działa podczas bombardowania. Umieść obraną warstwę na kropli wody na szkiełku nakrywkowym z szkiełkiem nakrywkowym. Uważaj jednak, aby zminimalizować bąbelki.

Obserwuj fluorescencję GFP lub YFP za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, takiego jak obserwator zes axio, punkt Z pokazany tutaj w jasnym polu mikroskopu. Najpierw sprawdź, czy nie ma strumienia cytoplazmatycznego, aby upewnić się, że komórki są żywe. Aby to zrobić.

Wystaw szkiełko na jasne światło pola na kilka minut, aby rozgrzać tkankę cebuli, a następnie poszukaj poruszających się tworzyw sztucznych cytoplazmatyczne Przesyłanie strumieniowe nie zawsze jest łatwe do zauważenia, więc nie zniechęcaj się, jeśli nie jest wyraźnie widoczne. Do detekcji fluorescencji należy użyć odpowiednich filtrów wzbudzenia i detekcji dla GFP lub YFP. Sprawdź również kontrole ujemne, czyli kawałki cebuli przestrzelone plazmidem niefluorescencyjnym.

Słabe żółte sygnały mogą pojawić się ze zranionych komórek, gruzu i cebuli. Sprawdź również kontrole pozytywne. Plazmid zawierający konstytutywnie wyrażony reporter fluorescencyjny.

Fluorescencja GFP jest widoczna w niektórych, ale nie we wszystkich komórkach. Pęcherzyki powietrza mogą również powodować fluorescencję tła. Widoczne sygnały GFP z komórek naskórka cebuli wskazują, że naboje, tkanki cebuli i pistolet genowy wystrzeliwane są odpowiednio przygotowane i wykonane.

Pokazano tutaj silną fluorescencję obserwowaną z 35 dodatniego plazmidu SGFP. Silna fluorescencja jest widoczna w całej komórce, w tym zarówno w jądrze, jak i cytoplazmie. Obraz w jasnym polu pozwala zobaczyć odpowiedni zarys komórek i jąder.

Nie każda komórka ulega transformacji. Sygnał fluorescencyjny YFP jest wykrywany w jądrze komórki cebuli, gdy eksperymentalna kombinacja Seuss, NYFP i L-U-H-C-Y-F-P jest bombardowana komórkami cebuli, co wskazuje, że Seuss NYFP i L-U-H-C-Y-F-P oddziałują in vivo. Jednak fluorescencja za pośrednictwem tej interakcji jest znacznie słabsza niż fluorescencja za pośrednictwem 35 SGFP w kontroli pozytywnej.

Dodatkowo czynniki transkrypcyjne SEUS i LUH są zlokalizowane w jądrach. Tak więc fluorescencję YFP obserwuje się tylko w jądrze. Co więcej, liczba komórek fluorescencyjnych jest znacznie niższa niż w przypadku 35 kontroli pozytywnej SGFP.

Dzieje się tak, ponieważ B FFC działa tylko wtedy, gdy oba plazmidy partnerskie ulegają ekspresji w tych samych komórkach cebuli. Nie wykrywa się sygnału fluorescencyjnego w cebuli, bombardowanej uchwytem naboju numer trzy zawierającym mieszaninę grzbietu krążka, wektora i L-U-H-C-Y-F-P Jak można się spodziewać po kontroli ujemnej. Właśnie pokazaliśmy, jak bombardować komórki cebuli w celu przetestowania interakcji białek białkowych za pomocą systemu pistoletów genowych BioRad Helios.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o stosowaniu odpowiednich kontroli pozytywnych i ujemnych oraz wiedzieć, że fluorescencja BIFC może być słabsza w sygnale i mniejsza w liczbie komórek fluorescencyjnych. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.