Name: Wyprowadzanie mysich komórek macierzystych trofoblastu z blastocyst (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-08T17:03:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Poznaj metodę wyprowadzania mysich komórek macierzystych trofoblastu z blastocyst. Film pokazuje izolację blastocyst, hodowlę na warstwach podajnikowych oraz indukcję różnicowania komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Janet Rossant za oryginalny protokół. Niniejsze badanie zostało sfinansowane z grantu CA106308 National Institute of Health przyznanego WH.

W niniejszym protokole opisujemy przygotowanie blastocyst myszy oraz ustanowienie linii komórek TS. Ogólne manipulacje z myszami przed pobraniem blastocyst, w tym przygotowanie do kojenia naturalnego i indukcję superowulacji, opierają się w zasadzie na standardowym protokole opisanym przez Nagy et al. 203 (str. 146-150).
Wytwarzanie i utrzymanie komórek TS
<ol>
 <li>Przygotuj krzyżówkę hodowlana wybranych myszy. </li>
 <li>Przygotuj embrionalne fibroblasty mysie (MEF) jako komórki odżywcze. Na dwa dni przed pobraniem blastocyst, MEF (2 x 106 komórek) wysiewamy do szalek 10 mm. Następnego dnia komórki te traktujemy 10 ml pożywki TS zawierającej mitomycynę C (20 mg/ml) podczas 2-godzinnej inkubacji w temperaturze 37°C, 5% CO2. Następnie komórki płuczemy dwukrotnie roztworem PBS. Komórki potraktowane mitomycyną C wysiewamy do płytek 12-dołkowych (1 x 105 komórek/dołek). </li>
 <li>W dniu pobierania blastocyst (3,5 dpc, określonym jako dzień pierwszy), pożywkę hodowlaną MEF zastępujemy pożywką TS z dodatkiem 1x FGF4/Heparin (0,5 ml/dołek). </li>
 <li>Przygotowanie do pobrania macicy: uśmierć mysz i zlokalizuj macicę (Rysunek 1A).</li>
 <li>Usuń macicę, chwytając ją pęsetą w obrębie szyjki (znajdującej się za pęcherzem moczowym) i przetnij w miejscu połączenia macicy z szyjką (Rysunek 1B). Wyciągnij macicę, odetnij błony oraz tkanki tłuszczowe i przetnij macicę poniżej miejsca połączenia z jajowodem (Rysunek 1C). Umieść macice (Rysunek 1D) w niewielkiej objętości (0,2 ml) pożywki TS w szalce 60 mm. </li>
 <li>Wypłucz każdy róg macicy 1 ml pożywki TS, używając strzykawki 1-ml z igłą 26G. Wprowadź igłę do podstawy macicy i powoli wypłukuj zawartość do nowej szalki 60 mm z 1 ml pożywki TS. Podczas płukania macica powinna być w pełni nadmuchana i rozciągnięta. </li>
 <li>Ostrożnie zbierz i przenieś blastocysty do czystej płytki 12-dołkowej zawierającej pożywkę TS, używając pipety ustnej. Płucz blastocysty trzykrotnie poprzez seryjne przenoszenie w pożywce TS w płytkach 12-dołkowych. Umieść jedną blastocystę na dołek (Rysunek 2A) w płytce 12-dołkowej zawierającej odżywcze MEF potraktowane mitomycyną C i inkubuj w temperaturze 37°C, 5% CO2. </li>
 <li>Blastocysty wyjdą z błony przejrzystej (zona pellucida) i przywrą do dołków w ciągu 24 do 36 godzin. Mały przyrost będzie łatwo widoczny w 3. dniu. Dokarmiaj hodowle 50 μl świeżej pożywki TS z dodatkiem 1x FGF4/Heparin.</li>
 <li>W 4. lub 5. dniu przyrost blastocysty powinien być gotowy do dysagregacji, zależnie od jego wielkości. Idealny rozmiar do dysagregacji komórek TS przedstawiono na Rysunku 3B. Płucz hodowle raz 0,5 ml PBS. Dodaj 100 ml 0,25% trypsyny/EDTA i inkubuj przez 5 minut w temperaturze 37°C, 5% CO2. Rozbij przyrost na małe skupki, energicznie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety P10. Przerwij trypsynizację, dodając dołka TS-70CM-1.5F4H (30% pożywki TS, 70% MEF-CM plus 1,5x FGF4/Heparin). Wymień pożywkę 8 godzin po dysagregacji i kontynuuj dokarmianie komórek co 2 dni.</li>
 <li>Między 6. a 10. dniem (zależnie od przypadku) można zaobserwować kolonie komórek TS. Mają one płaską morfologię przypominającą arkusz nabłonkowy z wyraźną granicą kolonii (Rysunek 2C). Kontynuuj dokarmianie hodowli co 2 dni. </li>
 <li>Gdy komórki TS osiągną 50% konfluencji (zazwyczaj między 15. a 20. dniem), wypłucz je raz roztworem PBS i dodaj 10 ml 0,25% trypsyny/EDTA. Podczas trypsynizacji pipetuj w górę i w dół, aby uzyskać zawiesinę bliską pojedynczym komórkom. Przerwij trypsynizację, dodając TS-70CM-1.5F4H i przenieś komórki do nowych płytek 6-dołkowych lub szalek 60 mm zawierających odżywcze MEF potraktowane mitomycyną C (2,5 x 105 komórek/dołek 6-dołkowy lub 5 x 105 komórek/szalka 60 mm). </li>
 <li>Wymień pożywkę 8 godzin po pasażowaniu i kontynuuj dokarmianie hodowli co 2 dni. </li>
 <li>Po jednym lub dwóch kolejnych pasażach (odstęp 3-5 dni między pasażami) na odżywczych MEF, komórki TS można hodować bez nich. Ponieważ MEF przywierają do płytki hodowlanej znacznie szybciej niż komórki TS po trypsynizacji, różnicę w szybkości adhezji można wykorzystać do oddzielenia komórek TS odżywczych MEF. Po pasażowaniu hodowlanych komórek inkubuj je w temperaturze 37°C, 5% CO2 przez 30 min. Większość MEF przywrze do płytki, a populacja TS pozostanie w zawiesinie. Przenieś supernatant do nowej płytki. Powtarzaj ten proces przez kilka pasaży, aby uzyskać czystą populację TS. </li>
 <li>Utrzymuj komórki TS w pożywce TS-70CM-1.5F4H i pasażuj je co 4 dni (rozcieńczenie 1:10 do 1:20) lub gdy hodowla osiągnie 70% konfluencji. Pasażowanie komórek przy wysokiej gęstości (wyższej niż rozcieńczenie 1:5) lub hodowanie ich przy zbyt wysokiej konfluencji może spowodować ich różnicowanie. </li>
 <li>Tożsamość komórek TS można potwierdzić poprzez immunostaining markera komórkowego Cdx2 (Rysunek 3). </li>
</ol>
Mrożenie komórek TS
<ol>
 <li>Przygotować 2x medium do mrożenia (50% FBS, 30% medium TS i 20% DMSO).</li>
 <li>Zebrać komórki TS poprzez trypsynizację, a następnie odwirować przy 450g przez 6 min. Resuspendować je w medium TS z równą objętością 2x medium do mrożenia.</li>
 <li>Mrozić komórki powoli, używając komory z alkoholem izopropylowym w temperaturze -70°C, a po 24-48 godzinach przenieść do ciekłego azotu.</li>
 <li>Zazwyczaj płytkę 60 mm (z 70% konfluencją) przechowuje się w 2 fiolkach.</li>
</ol>
Rozmrażanie komórek TS
<ol>
 <li>Szybko rozmrozić fiolkę w temperaturze 37°C, zebrać komórki w 10 ml pożywki TS poprzez wirowanie (450g, 6 min), a następnie resuspendować w 30% pożywki TS, 70CM-1.5F4H.</li>
 <li>Zawartość jednej fiolki z komórkami wysiać na płytkę 60 mm.</li>
</ol>
Różnicowanie komórek TS w TGC
Różnicowanie komórek TS w olbrzymie trofoblastowe (TGCs) można indukować poprzez usunięcie MEF-CM, FGF4 i heparyny. Fenotyp TGC (duże jądra komórkowe) można wykryć cztery dni po indukcji (Tanaka et al., 198 oraz Chiu et al. 208). Immunobarwienie p450scc pozwala wykryć ekspresję tego markera TGC w zróżnicowanej hodowli (Rysunek 4A). Analiza cytometryczna komórek barwionych PI (jodkiem propidyny) dodatkowo wykazuje obecność zróżnicowanych komórek o wyższej zawartości DNA (Rysunek 4B). Wyniki te sugerują, że komórki TS przechodzą endoreduplikację, stając się poliploidalnymi TGCs.
Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig1.jpg" alt="Proces sekcji, schemat przedstawiający widoczność organów i skalę pomiarową w badaniu biologicznym." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rysunek 1. Disekcja macic myszy. (A) Położenie macic zaznaczono strzałkami. (B) Przecięcie w miejscu połączenia macicy z szyjką macicy, zgodnie z rysunkiem. (C) Przecięcie macicy tuż poniżej jajowodu (OD), pod jajnikiem (OV). (D) Obraz macic. 
<img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig2.jpg" alt="Etapy rozwoju zarodkowego; obrazy mikroskopowe ICM i TS; analiza struktury komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Reprezentatywne zdjęcia przedstawiają blastocystę myszy, wypustkę blastocysty oraz kolonię trofoblastu. (A) Przedstawiono blastocystę myszy pobraną w dniu E3.5. ICM, masa komórek wewnętrznych; MT, ścienny trofektoderm; PT, polarny trofektoderm. (B) Przedstawiono wypustkę trofoblastu na komórkach zasilających MEF. TS, komórka macierzysta trofoblastu. (C) Kolonia komórek macierzystych trofoblastu wykazuje wyraźną krawędź na komórkach zasilających MEF. Strzałki wskazują granicę komórkową.
<img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig3.jpg" alt="Mikroskopia fluorescencyjna, Oct4, Cdx2, komórki macierzyste barwione DAPI, porównanie, komórki TS vs ES." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
 Rysunek 3. Identyfikacja komórek TS za pomocą analizy immunobarwienia. Poddano identyfikacji markerów w komórkach TS (A-D) oraz ES (kontrolnych, E-H). Komórki poddano immunobarwieniu przeciwciałami rozpoznającymi Oct4 (A, E) lub Cdx2 (B, F) oraz przeciwbarwieniu DAPI (C, G), przedstawionym na obrazach scalonych (D, H). Pasek skali, 50 μm. 
<img src="/files/ftp_upload/1964/1964fig4.jpg" alt="Obrazy różnicowania komórkowego: p450scc, barwienie DAPI, mikroskopia fluorescencyjna, histogram zawartości DNA." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rysunek 4. Różnicowanie komórek TS in vitro. (A) Niezróżnicowane (Undiff) lub zróżnicowane (Diff) komórki w hodowli poddano analizie pod kątem ekspresji markeru TGC, p450scc (zielony), z przeciwbarwieniem DAPI (czerwony). (B) Analiza cytometryczna przepływowa zróżnicowanych komórek, zabarwionych jodożymidyną (PI), mierzy zawartość DNA (M1, od dwóch do czterech kopii; M2, ponad cztery kopie). Populacja M2 reprezentuje poliploidalne komórki trofoblastu.

<ol><li>Chiu, S. Y., Asai, N., Costantini, F. &amp, Hsu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO-specific+protease+2+is+essential+for+modulating+p53-Mdm2+in+development+of+trophoblast+stem+cell+niches+and+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">SUMO-specific protease 2 is essential for modulating p53-Mdm2 in development of trophoblast stem cell niches and lineages.</a> PLoS Biol. 6, E310-E310 (2008).</li>
<li>Kunath, T., Arnaud, D., Uy, D. G., Okamoto, I., Chureau, C., Yamanaka, Y., Heard, E., Gardner, R. L., Avner, P., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinted+X-inactivation+in+extra-embryonic+endoderm+cell+lines+from+mouse+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Imprinted X-inactivation in extra-embryonic endoderm cell lines from mouse blastocysts.</a> Development. 132, 1649-1661 (2005).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+Mouse+Embryo%3A+The+Laboratory+Manual%22">Manipulating the Mouse Embryo: The Laboratory Manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2003).</li>
<li>Tanaka, S., Kunath, T., Hadjantonakis, A. K., Nagy, A., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promotion+of+trophoblast+stem+cell+proliferation+by+FGF4%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promotion of trophoblast stem cell proliferation by FGF4.</a> Science. 282, 2072-2075 (1998).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

W tym filmie prezentujemy proces pobierania blastocyst w stadium E3.5 z macic oraz procedury eksperymentalne służące do ustanowienia linii komórek TS. Opisujemy również warunki utrzymania pluripotencji komórek TS oraz indukcję ich różnicowania w komórki wyspecjalizowane. Dwoma krytycznymi krokami w celu uzyskania czystych linii komórek TS są czas dysagregacji wypustek (krok 9) oraz proces pierwszego pasażowania (krok 11). Wykazano, że w kulturze mogą pojawić się komórki pochodzące z pierwotnej endodermy po zbyt rozległym...

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Odczynniki&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;u&gt;pożywka TS:&lt;/u&gt;&lt;br/&gt;RPMI-1640, 20% FBS, 1 mM pirogronian sodu, 100 mM beta-merkaptoetanolu&amp;#8211;etanol i 100 mg/ml penicyliny-streptomycyny.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;u&gt;Mitomycyna C:&lt;/u&gt;&lt;br/&gt;Rozpuścić 2 mg mitomycyny C (Sigma M-0503) w 2 ml PBS, a następnie dodać tę 2-ml mieszaninę do 200 ml pożywki TS (10 ng/ml). Przygotować 20 alikwotów (po 10 ml) i przechowywać w temperaturze -20°C.&amp;#x00B0;w temperaturze -20°C do momentu użycia. Należy dodać jedną porcję na płytkę 100 mm.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;u&gt;Pożywka warunkowana embrionalnymi fibroblastami myszy (MEF-CM):&lt;/u&gt;&lt;br/&gt;Wysiać MEF na płytki 100 mm (1 x 10&lt;sup&gt;6&lt;/sup&gt;/płytkę). Następnego dnia dodać 10 ml pożywki TS na każdą płytkę i kontynuować hodowlę przez 48 godzin. Zebrać pożywkę hodowlaną, przefiltrować ją (0,45 mm) i przechowywać w temperaturze -20&amp;#x00B0;C w aliquotach po 35 ml. Każdą aliquotkę rozmrażać w razie potrzeby; można je przechowywać w temperaturze 4&amp;#x00B0;C. MEF można wykorzystać do przygotowania jeszcze dwóch partii pożywki warunkowej (CM) przed osiągnięciem przez nie pełnej konfluencji.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;u&gt;PBS/BSA:&lt;/u&gt;&lt;br/&gt;Rozpuścić BSA, frakcja V (Sigma A3311, 0,1% (m/v)) w PBS (10 ml), przefiltrować przez filtr strzykawkowy 0,45 mm i przygotować alikwoty po 1 ml w probówkach 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -70°C.&amp;#x00B0;odwirować i rozmrażać jedną probówkę w razie potrzeby, aby przygotować FGF4.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;u&gt;FGF4 (1000x):&lt;/u&gt;&lt;br/&gt;Resuspend liofilizowany FGF4 (Sigma F8424, 25 mg) w 1 ml roztworu PBS/BSA. Dokładnie wymieszać i rozdzielić na 10 alikwotów (100 µl) do probówek 1,5 ml, a następnie przechowywać w temperaturze -70°C.&amp;#x00B0;C. Rozmrażaj każdą probówkę w miarę potrzeb, a pozostałe przechowuj w temperaturze 4°C&amp;#x00B0;C, nie zamrażać ponownie. Rozcieńczyć 1000-krotnie w medium TS, aby uzyskać 1x FGF4 (25 ng/ml). </td></tr><tr><td colspan="4">&lt;u&gt;Heparyna (1000x):&lt;/u&gt;&lt;br/&gt;Resuspender heparynę (Sigma H3149, 10 000 jednostek) w PBS do stężenia końcowego 1 mg/ml (1000x). Przygotować aliquoty po 100 µl w probówkach 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -70°C.&amp;#x00B0;C. rozmrażać alikwoty w razie potrzeby i przechowywać pozostałe w temperaturze 4°C&amp;#x00B0;C, nie zamrażać ponownie. Rozcieńczyć 1000-krotnie w pożywce dla komórek TS, aby uzyskać stężenie 1x heparyny (1 ng/ml).</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie mysich komórek macierzystych trofoblastu z blastocyst

Derivation of Mouse Trophoblast Stem Cells from Blastocysts

Specyfikacja trofektodermy jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń różnicowania w rozwoju ssaków. Linia trofoblastyczna pochodząca z trofektodermy pośredniczy w implantacji i generuje płodową część łożyska. W związku z tym rozwój tej linii jest niezbędny dla przeżycia zarodka. Izolacja komórek macierzystych trofoblastu (TS) z blastocyst myszy została po raz pierwszy opisana przez Tanakęet al.1998. Zdolność komórek TS do zachowania właściwości specyficznych dla trofoblastu oraz ekspresja markerów specyficznych dla stadium i typu komórek po odpowiedniej stymulacji stanowi cenny system modelowy do badania rozwoju linii trofoblastycznej poprzez odtworzenie wczesnych zdarzeń placentacji. Co więcej, komórki trofoblastu są jednym z niewielu typów komórek somatycznych podlegających naturalnej amplifikacji genomu. Chociaż molekularne ścieżki leżące u podstaw poliploidyzacji trofoblastu zaczynają być odkrywane, rola fizjologiczna i korzyść płynąca z amplifikacji genomu trofoblastu pozostają w dużej mierze nieznane. Rozwój diploidalnych komórek macierzystych w poliploidalne komórki trofoblastu w hodowli sprawia, że tenex vivosystem stanowi doskonałe narzędzie do wyjaśniania mechanizmów regulacyjnych replikacji genomu i niestabilności w zdrowiu i chorobie. W niniejszej pracy opisujemy protokół oparty na wcześniejszych doniesieniach, z modyfikacjami opublikowanymi przez Chiuet al.2008.

W niniejszym filmie prezentujemy izolację blastocyst myszy oraz wyprowadzenie komórek macierzystych trofoblastu z blastocyst. Opisujemy również warunki utrzymania właściwości macierzystych komórek, a także indukcję ich różnicowania w hodowli.

Wytwarzanie mysich komórek macierzystych trofoblastu z blastocyst

Specyfikacja trofektodermy jest jednym z najwcześniejszych zdarzeń różnicowania w rozwoju ssaków. Linia trofoblastyczna pochodząca z...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyprowadzenie komórek TS z blastocyst mysich. Osiąga się to poprzez wstępną izolację rogów macicy i odzyskanie blastocyst z myszy w ciąży. Drugim etapem procedury jest hodowla blastocyst na komórkach pokarmowych MEF w warunkach sprzyjających wzrostowi komórek TS.Trzecim krokiem procedury jest ekspansja kolonii TS i ostatecznie hodowla komórek TS bez dodatku karmicieli typu meth. Ostatnim etapem procedury jest hodowla komórek TS z zachowaniem właściwości komórek macierzystych w celu przeprowadzenia krio konserwacji oraz indukcji różnicowania trofoblastu. W rezultacie, za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej, można uzyskać wyniki wykazujące ekspresję markera komórek macierzystych trofoblastu IE CDX two w nieróżnicujących się komórkach TS lub markera różnicowania IEP four 50 SCC po ich dojrzewaniu do postaci olbrzymich komórek trofoblastu.Witam, nazywam się Shani Chu i pracuję w laboratorium w Katedrze Genetyki Biomedycznej w University of Rochester Medical Center. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę hodowli macierzystych komórek trofoblastu. Wykorzystujemy tę procedurę do badania wzrostu i różnicowania trofoblastu oraz jego roli w tkankach pozazarodkowych w procesie tworzenia zdrowej łożyska.Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć tę procedurę, przeprowadź krzyżowanie wybranych myszy. Następnie przygotuj MEF (embrionalne fibroblasty mysie) jako komórki karmne.Na dwa dni przed zbiorem blastocyst, wysiej komórki MeT w szalkach 100 mm. Następnego dnia potraktuj te komórki MeT 10 ml pożywki TS zawierającej 20 µg/ml mitomycyny C przez dwie godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Po dwóch godzinach przemyj komórki dwukrotnie PBS, a następnie zawieś komórki MeT potraktowane mitomycyną C w 10 ml pożywki TS i wysiej komórki na płytkę 12-dołkową. W dniu zbioru blastocyst zastąp pożywkę hodowlaną MeT pożywką TS z dodatkiem 1X FGF4 i heparyny.Jesteśmy teraz gotowi do pobrania blastocyst z macicy myszy. Najpierw połóż uśpione zwierzę na plecach i oczyść skórę oraz futro 70% ethanol. Następnie wykonaj niewielkie nacięcie boczne i odciągnij skórę w stronę głowy, a aby odsłonić jamę brzuszną, przetnij otrzewną bocznie.Aby odsłonić jamę brzuszną, należy zlokalizować macicę. Usunąć macicę, chwytając ją pęsetą w obrębie szyjki macicy znajdującej się za pęcherzem i przecinając miejsce połączenia macicy z szyjką. Wyciągnąć macicę i odciąć błony oraz tkanki tłuszczowe.Następnie odetnij macicę poniżej miejsca połączenia z jajowodem. Umieść macicę w 0,2 milliliters pożywki TS w płytce 60 millimeter. Teraz napełnij strzykawkę o pojemności one milliliter ilością one milliliter pożywki TS.Załóż igłę o rozmiarze 26 G i wprowadź ją do podstawy jednej macicy. Powoli przepłucz zawartość do nowej płytki 60 mm. Podczas płukania macica powinna być nadmuchana i w pełni rozciągnięta.W ten sam sposób wypłucz drugi róg macicy, używając pipety sterowanej ustami. Zbierz i przenieś blastocysty z pomocą mikro-aspiratora do czystej płytki 12-dołkowej zawierającej medium TS. Przepłucz blastocysty trzykrotnie poprzez seryjne przenoszenie między płytkami 12-dołkowymi z medium TS.Umieść jeden blast assist w każdej studzience. W 12-dołkowej płytce zawierającej kulturę feederów meth traktowanych mitycomycyną C w temperaturze 37°C i 5% carbon dioxide. Blast assisty wyklują się z zona lucita i przyłączą do studzienek w ciągu 24 do 36 godzin.W trzecim dniu będzie łatwo zauważalny niewielki przyrost. W czwartym lub piątym dniu zasilić hodowle 500 µL świeżego medium TS z dodatkiem 1X FGF4 heparin. Przyrost blastocysty powinien być gotowy do dysagregacji, w zależności od jego wielkości.Idealna wielkość agregatów TSL do dysagregacji została tutaj przedstawiona. Przemyj kultury raz 0,5 ml PBS. Następnie dodaj 100 µL 0,25% trypsyny w EDTA i inkubuj przez pięć minut w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2.Teraz możemy przystąpić do rozbijania blastocyst, co jest prawdopodobnie najbardziej krytyczną częścią tej procedury. Następnie rozbij wspomagany wzrost blastocyst na małe skupiska, energicznie pipetując w górę i w dół za pomocą pipety P 100. Przerwij trypsynizację, dodając do dołka 0,5 milliliters medium 70 cm 1.5 F four H. Natychmiast przenieś komórki z powrotem do inkubatora. Osiem godzin po dysagregacji wymień medium.Kontynuuj dokarmianie komórek co dwa dni między szóstym a dziesiątym dniem. Czas ten jest bardzo zmienny. Można zaobserwować kolonie TSL.Wykazują płaską morfologię nabłonkową w formie płatów z wyraźną granicą kolonii. Należy kontynuować karmienie kultur co dwa dni. Gdy komórki TS osiągną 50% konfluencji, zazwyczaj między 15. a 20. dniem, należy przemyć je raz PBS i dodać 100 µL 0,25% trypsyny EDTA, pipetując roztwór w górę i w dół podczas trypsynizacji, aby zapewnić uzyskanie zawiesiny bliskiej pojedynczym komórkom.Po pięciu minutach przerwać działanie trypsyny, dodając siedem DCM 1.5 F four H medium. Następnie przenieść komórki do nowych płytek sześciodołkowych zawierających wcześniej przygotowane komórki karmiciele meth traktowane mitomycyną C i inkubować w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% Carbon dioxide; wymienić medium osiem godzin po pasażowaniu i kontynuować dokarmianie kultur co dwa dni. Po kolejnych jednym lub dwóch pasażach na karmicielach meth, TSL można hodować bez nich, aby oddzielić TSL od komórek karmicieli meth.Po przesianiu hodowli komórek inkubuj je w temperaturze 37°C w atmosferze 5% carbon dioxide przez 30 minut. Ponieważ komórki mes przywierają do płytki hodowlanej znacznie szybciej niż komórki TS po trypsynizacji, większość komórek mes przywrze do płytki, podczas gdy populacja TS pozostanie w zawiesinie. Przenieś nadsącz do nowej płytki.Powtarzaj ten proces oddzielania komórek TS od karmicieli meth przez kilka pasaży, aby uzyskać czystą populację TS. Hoduj komórki TS w naczyniach 70 cm w medium 1,5 F four H i pasażuj je co cztery dni lub gdy kultura osiągnie 70% konfluencji. Na koniec tożsamość komórek TS można potwierdzić poprzez immunobarwienie markera komórkowego.Zastosuj CDX 2, aby zamrozić komórki TS, zbierz je poprzez pipetowanie, a następnie odwiruj przy 450 g przez sześć minut. Ponownie zawieś komórki w medium TS z równą objętością dwukrotnie stężonego medium do mrożenia i przenieś do fiolek kriogenicznych. Płytka 60 mm przy 70% konfluencji jest zazwyczaj przechowywana w dwóch fiolkach.Komórki należy zamrażać powoli, korzystając z komory z alkoholem izopropylowym w temperaturze -70 °C. Po 24 do 48 godzinach przenieść je do ciekłego azotu. Rozmrażanie TSL powinno odbywać się szybko poprzez ogrzewanie fiolki w temperaturze 37 °C.Przenieść komórki haw do probówki o pojemności 15 mililitrów zawierającej 10 mililitrów pożywki TS i zebrać komórki poprzez wirowanie, a następnie zawiesić je ponownie w 70 cm, 1.5 F pożywce four H i zasiać każdą fiolkę komórek na płytce 60 milimetrów. Różnicowanie komórek TS w trofoblastyczne komórki olbrzymie (tgc) można indukować poprzez usunięcie MEC four i heparyny. Komórki T GCs są łatwe do zidentyfikowania w hodowli dzięki powiększonym jądrom i ciałom komórkowym.Fenotyp TGC można również wykryć poprzez barwienie immunocytochemiczne markerem TGC P4.50 SCC widocznym na zielono, z przeciwbarwieniem DAPI widocznym na czerwono, jak pokazano tutaj. Komórki zróżnicowane wykazują ekspresję P4.50 SCC, podczas gdy komórki niezróżnicowane nie wykazują takiej ekspresji. Analiza cytometryczna komórek zróżnicowanych barwionych jodkiem propidium wykazuje ponadto wyższą zawartość DNA, gdzie M1 reprezentuje od dwóch do czterech kopii, a M2 więcej niż cztery kopie DNA.Wyniki te sugerują, że TSL przechodzą endoreduplikację, stając się poliploidalnymi TCS reprezentowanymi przez populację M two. Przedstawiliśmy sposób pobierania blastocytów, ptosis oraz izolowania mysich komórek TS z blastocytów i ptosis. Ważne jest, aby podczas ustanawiania linii TSL kontrolować przyrost komórek i upewnić się, że ich pluripotencja jest zachowana w warunkach hodowli.To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie filmu i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.

derivation-of-mouse-trophoblast-stem-cells-from-blastocysts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pochodzenie komórek macierzystych trofoblastu mysiego z blastocyst

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje proces otrzymywania transplantowalnych hematopoetycznych komórek macierzystych z mysich embrionalnych komórek macierzystych (ESC) oraz ich późniejszą iniekcję do letalnie napromieniowanych myszy biorców. W skrócie, ESC są różnicowane do postaci ciał embroidalnych, które następnie są infekowane retrowirusem HoxB4 i współhodowane z komórkami zrębowymi OP9 oraz cytokinami hematopoetycznymi.

Wytwarzanie komórek macierzystych krwi z mysich embrionalnych komórek macierzystych

Zdolność ludzkich embrionalnych komórek macierzystych do samoodnawiania oraz różnicowania się we wszystkie typy komórek organizmu sprawia, że stanowią one ogromną obietnicę zarówno w zastosowaniach medycznych, jak i jako narzędzie badawcze służące do odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące rozwoju i chorób. W niniejszym materiale przedstawiamy zwięzły, szczegółowy protokół izolacji ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z embrionów poprzez immunosurgicalną izolację masy komórkowej...

Wytwarzanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych metodą immunochirurgii

Zdolność embrionalnych komórek zarodkowych do różnicowania się w pierwotne komórki płciowe podczas wczesnych etapów rozwoju stanowi idealny model do zweryfikowania naszej hipotezy dotyczącej nowotworów i niepłodności. Niniejszy protokół przedstawia sposób izolacji pierwotnych komórek płciowych z rozwijających się gonad w embrionach myszy w 10,5–11,5 dniu po zapłodnieniu (post coitum).

Izolacja i hodowla zarodkowych komórek macierzystych myszy

W niniejszym protokole opisujemy sekcję łożysk myszy w 10,5 dniu ciąży, a następnie izolację komórek trofoblastycznych z wykorzystaniem gradientu Percoll. Następnie demonstrujemy zastosowanie wyizolowanych komórek w teście inwazji na Matrigelu.

Izolacja pierwotnych komórek trofoblastów myszy oraz test inwazji trofoblastów

Tutaj prezentujemy protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w pełni funkcjonalne i stabilne komórki macierzyste trofoblastu przez dziesięciodniową nadekspresję Tfap2c, Gata3, Eomes i Ets2.

Protokół bezpośredniej konwersji mysich fibroblastów embrionalnych w komórki macierzyste trofoblastu

Tutaj prezentujemy protokół efektywnego generowania ludzkich komórek trofoblastycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu białka morfogennego kości 4 i inhibitorów szlaków aktywinowych/węzłowych. Metoda ta jest odpowiednia do skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych i może generować duże ilości komórek do manipulacji genetycznej.

In vitro Różnicowanie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w komórki trofoblastyczne

Ten artykuł opisuje protokół efektywnego pozyskiwania i hodowli pluripotencjalnych linii komórek macierzystych z embrionów myszy w stadium blastocysty.

Pozyskiwanie linii komórek macierzystych z zarodków myszy przed implantacją

Tutaj opisujemy metodę ogrzewania zeszklonych ludzkich blastocyst, hodowli ich przez okres implantacji in vitro, trawienia ich do pojedynczych komórek i zbierania wczesnych komórek trofoblastu do dalszych badań.

Jednokomórkowy zbiór komórek trofoblastu w zarodkach ludzkich w okresie okołoimplantacyjnym

Protokół opisujący tworzenie ludzkich blastoidów, które efektywnie, w odpowiednim czasie i sekwencyjnie generują komórki podobne do blastocyst.

Protokół modelowania rozwoju i implantacji blastocyst u ludzi

W niniejszym filmie zademonstrujemy, jak izolować komórki macierzyste siatkówki z nabłonka rzęskowego oka myszy i hodować je in vitro w celu uzyskania klonalnych sfer siatkówkowych. Izolowane sfery posiadają kluczowe właściwości komórek macierzystych: zdolność do samoodnowy oraz wielopotencjalność.

Izolacja komórek macierzystych siatkówki z oka myszy

Poznaj metodę wyprowadzania mysich komórek macierzystych trofoblastu z blastocyst. Film pokazuje izolację blastocyst, hodowlę na warstwach podajnikowych oraz indukcję różnicowania komórek.

Wytwarzanie mysich komórek macierzystych trofoblastu z blastocyst

Przeglądaj więcej filmów