Name: Analiza ekspresji genów u omacnicy szmaragdowej (Agrilus planipennis) przy użyciu ilościowego Real Time-PCR (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-05-04T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Poznaj analizę ekspresji genów u omacnicy szmaragdowej Agrilus planipennis przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Ta metoda pozwala badać poziomy mRNA w tkankach larwalnych i różnych stadiach rozwojowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażamy wdzięczność Lourdes Delta Arrueta Antequera (Department of Entomology, Ohio State University/OARDC, Wooster, OH) za pomoc w przygotowaniu eksperymentów. Dziękujemy dr Therese Poland (USDA, Forest Services, NRS) za przesłanie próbek larw EAB. Doceniamy pomoc dr. Luisa A Canasa i Nuris M Acosta w konfiguracji mikroskopu. Finansowanie projektu pochodziło ze środków stanowych i federalnych przyznanych Ohio Agricultural Research and Development Center, The Ohio State University.

Pełny protokół z poszczególnymi etapami przedstawiono na schemacie blokowym na Rysunku 1. Szczegółowe opisy poszczególnych kroków obejmujących sekcję, ekstrakcję RNA, syntezę pierwszej nici cDNA oraz qRT-PCR znajdują się poniżej.
I. Disekcja larw
<ol>
 <li>Przed rozpoczęciem procedury umieścić larwy opłatek jesionowego (EAB) na wilgotnym papierze pocienkanym do momentu przeprowadzenia sekcji. Świeżo przygotowany 1X roztwór soli fosforanowej w buforze (PBS) należy przechowywać w lodzie, aby utrzymać niską temperaturę buforu przez cały proces sekcji.</li>
 <li>Na początek unieruchomić larwy EAB na płytce sekcyjnej za pomocą cienkich szpilek sekcyjnych. Następnie wlać na płytkę sekcyjną zimny 1X PBS.</li>
 <li>W pierwszej kolejności odciąć głowy larw za pomocą cienkich nożyczek sekcyjnych. Następnie usunąć ostatni segment odwłoka larw.</li>
 <li>Używając pęsety zegarmistrzowskiej, oddzielić kutykulę od tułowia larwy. Następnie wykonać nacięcie wzdłuż tułowia za pomocą nożyczek. Należy uważać, aby nie przerwać ciągłości jelita podczas wykonywania nacięcia.</li>
 <li>Ostrożnie wyizolować tkankę jelita środkowego z pozostałych tkanek, takich jak ciała tłuszczowe i tkanka łączna. Następnie wypłukać tkankę w świeżym buforze 1X PBS, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczeń z ciała tłuszczowego. Przenieść wyizolowane jelito środkowe do probówki eppendorfowskiej o pojemności 1,5 mL zawierającej 50 μL schłodzonego odczynnika Trizol.</li>
 <li>Następnie wyizolować tkankę ciała tłuszczowego za pomocą pęsety i przenieść ją do probówki eppendorfowskiej o pojemności 1,5 mL zawierającej 50 μL schłodzonego odczynnika Trizol.</li>
 <li>Na koniec wyizolować tkankę kutykuli z tułowia larwy, zeskrobując wszelkie przylegające tkanki i uważając, aby nie naruszyć integralności tkanki. Wypłukać wyizolowaną tkankę kutykuli w świeżym buforze PBS i przenieść ją do probówki eppendorfowskiej o pojemności 1,5 mL z 500 μL schłodzonego odczynnika Trizol.</li>
 <li>Wyizolowane tkanki ciała tłuszczowego, kutykuli i jelita środkowego można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA.</li>
 <li>W ramach przygotowania do ekstrakcji RNA pogrupować poszczególne próbki EAB zgodnie z etapami rozwoju. Etapy te obejmują 1., 2., 3. i 4. stadium larwalne, przepoczwary oraz osobniki dorosłe.</li>
</ol>
II. Ekstrakcja RNA (zgodnie z protokołem producenta dla odczynnika Trizol)
Homogenizacja
<ol>
	<li>Aby rozpocząć ekstrakcję RNA, najpierw należy użyć plastikowych tłuczków do homogenizacji tkanek w probówkach Eppendorf o pojemności 1,5 mL zawierających Trizol. Po homogenizacji należy uzupełnić objętość każdej próbki odczynnikiem Trizol do 1 mL.</li>
 <li>W przypadku etapów rozwojowych należy homogenizować całe zwierzę w ciekłym azocie za pomocą moździerza i tłuczka. Następnie należy dodać alikwot homogenatu (50 μg) do 1 mL Trizolu.</li>
</ol>
Rozdział faz:
<ol start="3">
 <li>Inkubuj probówki z próbkami z 1 mL Trizol przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
 <li>Po inkubacji dodaj 20 μL chloroformu do każdej probówki. Natychmiast po dodaniu chloroformu energicznie wstrząsaj probówkami przez około 15 sekund. Następnie inkubuj probówki w temperaturze pokojowej przez kolejne 2-3 minuty.</li>
 <li>Następnie odwiruj próbki przy 12,0Xg przez 15 minut w temperaturze 2 °C. Po wirowaniu RNA znajdzie się w fazie wodnej. Objętość fazy wodnej powinna wynosić 60 μl, czyli 60% całkowitej objętości Trizol.</li>
</ol>
Wytrącanie RNA
<ol start="6">
 <li>Ostrożnie pobierz wyłącznie fazę wodną. Obecność substancji znajdujących się poniżej fazy wodnej spowoduje zanieczyszczenie ekstrahowanego RNA. Następnie przenieś fazę wodną do odpowiednio oznakowanej probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 mL.</li>
 <li>Aby wytrącić RNA z fazy wodnej, dodaj do każdej probówki 0,5 mL alkoholu izopropylowego i wymieszaj. Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji odwiruj probówki z prędkością 12,0Xg przez 10 minut w temperaturze 2°C.</li>
</ol>
Przemywanie RNA
<ol start="8">
 <li>Po odwirowaniu usunąć nadsącz z probówek. RNA znajduje się w żelowatym osadzie utworzonym na dnie probówki. Przemyć osad 75% ethanolem, dodając co najmniej 1 mL 75% ethanolu na każde 1 mL Trizol. Wymieszać za pomocą wortexa. Następnie wirować probówki z prędkością 7500Xg przez 5 minut w temperaturze 2 °C.</li>
</ol>
Elucja RNA
<ol start="9">
 <li>Odlej nadsącz z probówek. Ponownie odwiruj probówki w małej wirówce stołowej przez 1 minutę. Usuń pozostały nadmiar nadsączu z probówki za pomocą ostrożnego pipetowania. Pozostaw probówkę otwartą i pozwól osadowi wyschnąć na powietrzu przez 5-10 minut. Należy uważać, aby nie przesuszyć osadu, ponieważ znacznie zmniejszy to jego rozpuszczalność.</li>
 <li>Po wysuszeniu na powietrzu resuspenduj osad w wodzie traktowanej <a href="http://en.wikipedia.org/wiki/Diethylpyrocarbonate">pirowęglanem dwuetylowym</a> (DEPC). Ilość wody użytej do resuspensji osadu zależy od jego wielkości. Użyj 50 μL wody traktowanej DEPC dla małego osadu lub 100 μL dla dużego osadu. Pozwól osadowi całkowicie rozpuścić się w wodzie traktowanej DEPC, kilkakrotnie przesuwając końcówkę pipety w górę i w dół. </li>
 <li>Po rozpuszczeniu osadu inkubuj próbkę w temperaturze 5 °C przez 10 minut. </li>
 <li>Następnie zmierz stężenie każdej próbki RNA za pomocą spektrofotometru Nanodrop (2 μL próbki RNA). </li>
 <li>Próbki RNA przechowuj w temperaturze -80°C do czasu dalszego użycia. </li>
</ol>
III. Synteza pierwszej nici cDNA (zgodnie z protokołem producenta przy użyciu zestawu SuperScript first strand Synthesis firmy Invitrogen).
<ol>
	<li>Do każdej próbki RNA dodać do probówki PCR następujące składniki:
	<table border="0">
 <tbody >
 <tr><td>RNA</td><td>x μl</td></tr>
 <tr><td>10mM dNTP mix M</td><td>1μl</td></tr>
 <tr><td>Oligo(dt) (0.5 μg/ μl)</td><td>1 μl</td></tr>
 <tr><td>Woda traktowana DEPC</td><td>(8-x) μl</td></tr>
 	<tr><td>Objętość całkowita:</td><td>10 μl</td></tr>
 <tr><td colspan="2">Uwaga: x to objętość RNA użytego do syntezy cDNA. W zależności od stężenia RNA, do każdej reakcji należy użyć 2-3 μg RNA, a całkowita objętość każdej reakcji powinna wynosić 10 μl.</td></tr>
	</tbody>
 </table>
 </li>
 <li>Umieścić powyższą mieszaninę reakcyjną w termocyklerze w temperaturze 65°C na 4 minuty.</li>
	<li>Wyjąć probówki z termocyklera i natychmiast umieścić je na lodzie na co najmniej 2 minuty.</li>
 <li>Przygotować master mix pierwszej nici, dodając następujące składniki:
	<table border="0">
 <tbody >
 <tr><td>10X RT Buffer</td><td>2μl</td></tr>
 <tr><td>25mM MgCl2</td><td>4 μl</td></tr>
 <tr><td>0.1M DTT</td><td>2 μl</td></tr>
 <tr><td>RNase out</td><td>1 μl</td></tr>
 </tbody>
 </table>
	</li>
 <li>Do każdej probówki zawierającej próbkę RNA dodać 9 μl master mixu, wymieszać poprzez pipetowanie i krótko odwirować mieszaninę.</li>
 <li>Umieścić probówki z powrotem w termocyklerze i inkubować przez 2 minuty w temperaturze 42°C.</li>
 <li>Wstrzymać pracę termocyklera i do każdej probówki dodać 1 μl enzymu odwrotnej transkryptyazy Superscript II (Invitrogen). Ten etap należy przeprowadzić szybko.</li>
 <li>Inkubować próbki w temperaturze 42°C przez 1,5 godziny.</li>
 <li>Zakończyć reakcję w temperaturze 70°C przez 15 minut.</li>
 <li>Wyjąć probówki z termocyklera i umieścić je na lodzie.</li>
 <li>Do każdej probówki dodać 1 μl RNazy H i ponownie umieścić je w termocyklerze w temperaturze 37°C na 20 minut.</li>
 <li>Po wyjęciu próbek z termocyklera dodać do każdej probówki 20 μl wody wolnej od nukleaz. Na tym etapie objętość każdej próbki ulega podwojeniu.</li>
 <li>Sprawdzić stężenie każdej próbki, wykorzystując 2 μl materiału. Odmierzyć alikwot każdej próbki, aby uzyskać stężenie 20ng/μl do wykorzystania w qRT-PCR. Ilość wody potrzebna do doprowadzenia próbek do stężenia 20ng/μl zależy od początkowego stężenia zsyntetyzowanego cDNA.</li>
</ol>
IV. qRT-PCR:
Projektowanie starterów i wyznaczenie genu referencyjnego
<ol>
 <li>Zaprojektuj primery o temperaturze topnienia (Tm) 60°C i rozmiarze produktu ok. 10bp.</li>
 <li>W tym eksperymencie jako gen docelowy wykorzystano AP-PERI1. Do późniejszej analizy i normalizacji danych niezbędny jest gen referencyjny lub kontrola wewnętrzna. Jako gen referencyjny w tym doświadczeniu zastosowano białko rybosomalne (AP-RP1).</li>
 <li>Przygotuj roztwory robocze primerów o stężeniu 5uM, w tym primery dla genu referencyjnego.</li>
</ol>
Przygotowanie standardów
<ol start="4">
 <li>W celu obliczenia wydajności stosowanych starterów należy przygotować standardy.</li>
 <li>Przygotować mieszaninę cDNA z różnych próbek, które będą testowane.</li>
 <li>Wykonać 5-krotne rozcieńczenia seryjne dla każdego pożądanego punktu na wykresie. Cztery rozcieńczenia powinny być wystarczające, ale wysoce zaleca się wykonanie pięciu.</li>
 <li>Objętość będzie zależeć od liczby punktów oraz liczby powtórzeń technicznych. Powinno być wystarczająco dużo materiału, aby przygotować standard dla każdego badanego genu, w tym genu referencyjnego.</li>
</ol>
Szablon płytki
<ol start="8">
 <li>Przygotuj szablon wskazujący nazwę próbki dla każdej studzienki w płytce do qRT-PCR. Pamiętaj o uwzględnieniu standardów dla każdego genu oraz co najmniej dwóch powtórzeń technicznych dla każdej próbki.</li>
</ol>
Ustaw parametry cyklu
<ol start="9">
 <li>Włącz urządzenie do qRT-PCR i wprowadź parametry cykli. Parametry cykli dla tego eksperymentu są następujące:
 Krok 1:
 <ul>
 	<li>1 cykl: 95°C 3 min</li>
 </ul>
 Krok 2:
 <ul>
 <li>40 cykli: 95°C 15 sec, a następnie 60°C 30 sec (Opcjonalnie: w celu wyznaczenia krzywej topnienia należy uwzględnić poniższe kroki)</li>
 </ul>
	Krok 3:
	<ul>
 <li>1 cykl: 95°C 1 min</li>
 </ul>
	Krok 4:
	<ul>
	<li>1 cykl: 55°C 1 min</li>
 </ul>
	Krok 5:
	<ul>
 <li>81 cykli: 5°C 30 sec</li>
 </ul>
 </li>
</ol>
	Przygotowanie płytki dla urządzenia CFX96 (BioRad)
<ol start="11">
<li>Przygotować mieszaninę główną (master mix) dla każdego genu (w tym genu referencyjnego) w oddzielnych probówkach. Dla każdej dołki mieszanina główna składa się z
	<table border="0">
 <tbody>
 <tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>2μl</td></tr>
 <tr><td>2,5X SYBR Green</td><td>4 μl</td></tr>
 <tr><td>Starter przedni</td><td>1 μl</td></tr>
 <tr><td>Starter odwrotny</td><td>1 μl</td></tr>
 <tr><td>Objętość całkowita</td><td>8 μl</td></tr>
	</tbody>
 </table>
 </li>
 <li>Podczas przygotowywania mieszaniny głównej (master mix) należy uwzględnić 1-2 dodatkowe reakcje, aby zniwelować błędy pipetowania.</li>
 <li>Zgodnie z wcześniej zaprojektowanym szablonem, dodać 2 μL (20 ng/ μL) cDNA do każdej dołki. Następnie dodać 8 μL mieszaniny master mix do każdej studzienki, co daje objętość całkowitą wynoszącą 10 μL na jedną reakcję.</li>
 <li>Pipetować w górę i w dół (2–3 razy), aby upewnić się, że próbka została dobrze wymieszana. Sprawdzić, czy na końcówce nie pozostał płyn. Aby uniknąć kontaminacji krzyżowej, należy używać nowej końcówki dla każdej próbki.</li>
 <li>Po przygotowaniu całej płytki należy zakleić ją taśmą optyczną. Należy unikać dotykania taśmy, ponieważ obecność tłuszczu może wpłynąć na odczyt. Następnie płytkę należy wirować z prędkością 50 obr./min przez 1 minutę, aby upewnić się, że wszystkie produkty w dołkach znajdują się na dnie płytki.</li>
 <li>Po odwirowaniu należy upewnić się, że na dnie płytki nie ma lodu ani wody. Następnie płytkę należy umieścić w urządzeniu do qRT-PCR i uruchomić program PCR.</li>
</ol>
V. Schematyczne przedstawienie eksperymentu
<img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig1.jpg" alt="Schemat procesu ekstrakcji RNA i qRT-PCR z tkankami larwalnymi, syntezą cDNA oraz wykresem wyników." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1: Schemat blokowy przedstawiający sekwencyjny przebieg etapów badania ekspresji genów.
<img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig2.jpg" alt="Obrazy mikroskopowe wzrostu grzybni; badanie preparatu, badanie biologiczne, mikroskopia." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rysunek 2A) sekcja larwy EAB z widocznym jelitem środkowym w części centralnej. B) wyizolowane jelito środkowe larwy EAB
<img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig3.jpg" alt="Wykres analizujący średnie wartości REV oraz względną krotność zmiany dla Cu, MG, FB; porównanie danych eksperymentalnych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rysunek 3: A) Średnie wartości względnej ekspresji (REV) dla genu peritrofiny (AP-PERI1) w różnych tkankach larwalnych, w tym w kutykuli (Cu), jelicie środkowym (MG) i ciałkach tłuszczowych (FB). Specyficzne dla EAB białko rybosomalne (tutaj nazwane, AP-RP1) wykorzystano jako kontrolę wewnętrzną do normalizacji danych uzyskanych dla badanego genu, AP-PERI1B) Względna krotność zmiany AP-PERI1 w tkankach larwalnych. Tkanka kutykuli wykazywała najniższą ekspresję, dlatego została przyjęta jako próbka kalibracyjna (1X) (Pfaffl, 201).
<img src="/files/ftp_upload/1974/1974fig4.jpg" alt="Wykres liniowy i słupkowy przedstawiający średnie wartości REV oraz względną zmianę krotności w poszczególnych warunkach w celu analizy danych." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4: A) Średnie wartości względnej ekspresji (REV) dla genu peritrofin (AP-PERI1) w różnych stadiach rozwojowych EAB, w tym w stadiach larwalnych (I, II, III i IV), przepoczwarach (PP) oraz imago (A). Specyficzne dla EAB białko rybosomalne (AP-RP1) wykorzystano jako kontrolę wewnętrzną do normalizacji danych uzyskanych dla badanego genu, AP-PERI1B) Względna krotność zmiany AP-PERI1 na różnych etapach rozwoju. Próbka PP wykazała najniższy poziom mRNA, w związku z czym przyjęto ją jako kalibrator (próbka 1X). 
VI. Podsumowanie
Ilościowa reakcja łańcuchowa polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) jest skutecznym narzędziem do diagnozowania poziomów mRNA w różnych tkankach owadów oraz na różnych etapach ich rozwoju. Ponadto qRT-PCR stanowiła przede wszystkim kluczowe narzędzie służące do walidacji danych uzyskanych z wysokoprzepustowych analiz ekspresji genów, takich jak mikromacierze oraz sekwencjonowanie RNA nowej generacji (RNA-Seq).

<ol><li>Lehane, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peritrophic+matrix+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Entomol%22%5BJournal%5D)">Peritrophic matrix structure and function.</a> Annu Rev Entomol. 42, 525-550 (1997).</li>
<li>Mittapalli, O., Sardesai, N., Shukle, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cDNA+cloning+and+transcriptional+expression+of+a+peritrophin-like+gene+in+the+Hessian+fly%2C+Mayetiola+destructor+%5BSay%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Arc+of+Insect+Bio%22%5BJournal%5D)">cDNA cloning and transcriptional expression of a peritrophin-like gene in the Hessian fly, Mayetiola destructor [Say].</a> Arc of Insect Bio. 64, 19-29 (2007).</li>
<li>Pauchet, Y., Wilkinson, P., van Munster, M., Augustin, S., Pauron, D., ffrench-Constant, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pyrosequencing+of+the+midgut+transcriptome+of+the+poplar+leaf+beetle+Chrysomela+tremulae+reveals+new+gene+families+in+Coleoptera.+Ins+Bio+and+Mol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Pyrosequencing of the midgut transcriptome of the poplar leaf beetle Chrysomela tremulae reveals new gene families in Coleoptera. Ins Bio and Mol.</a> 39, 403-413 (2009).</li>
<li>Pfaffl, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+mathematical+model+for+relative+quantification+in+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 29, 2002-2007 (2001).</li>
<li>Tellam, R. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTellam%2C+RL+%22Biology+of+the+Insect+Midgut%22">Biology of the Insect Midgut</a>. Lehane, M. J., Billingsley, P. F. , Chapman and Hall. London. 86-114 (1996).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

Wartość cyklu progowego (Ct) uzyskano dla każdej próbki na płytce do qRT-PCR. W celu sporządzenia krzywej wzorcowej wartość Ct uzyskaną dla każdego rozcieńczenia naniesiono na wykres w funkcji logarytmu jego stężenia. Następnie wartości Ct dla próbek eksperymentalnych naniesiono na tę krzywą wzorcową serii rozcieńczeń. Ilości docelowe obliczono na podstawie oddzielnych krzywych wzorcowych wygenerowanych dla każdego eksperymentu, tj. ekspresji w tkankach i ekspresji rozwojowej. Wartości ekspresji względnej (REVs) określon...

analiza ekspresji genów u opiętka jesionowego (agrilus planipennis) z wykorzystaniem ilościowej reakcji pcr w czasie rzeczywistym

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Opuszka jesionowa (EAB,Agrilus planipennis) jest egzotycznym inwazyjnym szkodnikiem, który zabił miliony jesionów (Fraxinusspp) w Ameryce Północnej. EAB nadal szybko się rozprzestrzenia i atakuje jesiony w różnym wieku, od sadzonek po drzewa dojrzałe. Do tej pory jednak wiedza molekularna na temat EAB jest bardzo ograniczona lub nie istnieje. Jesteśmy zainteresowani rozszyfrowaniem opartych na mechanizmach molekularnych procesów fizjologicznych na poziomie tkankowym, które pomagają EAB w skutecznej kolonizacji jesionów. W niniejszym raporcie przedstawiamy efektywne wykorzystanie ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) do określenia poziomów mRNA w różnych tkankach larwalnych (w tym w jelicie środkowym, ciałkach tłuszczowych i kutykuli) oraz w różnych stadiach rozwojowych (w tym 1st- , 2gie- 3rd- , 4th(stadia larwalne, przepoczwarki i osobniki dorosłe) EAB. Jako przykład, gen peritrofin (nazwany tutaj,AP-PERI1) jest przedstawiony jako gen docelowy oraz białko rybosomalne (AP-RP1) jako kontrolę wewnętrzną. Peritrofiny są ważnymi składnikami błony/macierzy peritroficznej (PM), która stanowi wyściółkę jelita owada. PM pełni różnorodne funkcje, w tym uczestniczy w trawieniu oraz zapewnia ochronę mechaniczną nabłonka jelita środkowego.

Ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) jest skutecznym narzędziem do diagnostyki poziomów mRNA w różnych tkankach i stadiach rozwojowych owadów. W niniejszym raporcie prezentujemy zastosowanie qRT-PCR do oznaczenia poziomów mRNA w różnych tkankach larwalnych oraz stadiach rozwojowych inwazyjnego gatunku owada – opiętka jesionowego.

Analiza ekspresji genów u opiętka jesionowego (Agrilus planipennis) z wykorzystaniem ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym

Opuszka jesionowa (EAB, Agrilus planipennis) to egzotyczny szkodnik inwazyjny, który doprowadził do wyginięcia milionów jesionów (Fraxinus spp) w Ameryce Północnej. EAB ...

Ogólnym celem następnego eksperymentu jest analiza ekspresji genów w tkankach i stadiach rozwojowych jesionowca szmaragdowego za pomocą ilościowej PCR. Jest to realizowane poprzez sekcję tkanek larwalnych i kategoryzację stadiów rozwojowych. W drugim kroku ekstrahuje się RNA z tkanek i stadiów rozwojowych przy użyciu odczynnika trizol, który służy następnie jako matryca do wygenerowania pierwszej nici cDNA; po syntezie pierwszej nici cDNA przeprowadza się ilościową RT-PCR.Uzyskano wyniki wykazujące różnicową ekspresję genu docelowego w różnych tkankach larwalnych i stadiach rozwojowych na podstawie pełnych danych o zmianach uzyskanych z wartości progowych cyklu po amplifikacjach ilościowych R-T-P-C-R. Cześć, jestem Prakash Mi, kierownik tego laboratorium w Katedrze Entomologii na Uniwersytecie Stanowym Ohio.W moim laboratorium skupiamy się głównie na genomicznych i molekularnych aspektach interakcji między jesionem a szafranikiem jesionowym. Szafranik jesionowy, znany jako EAB, to egzotyczny gatunek inwazyjny pochodzący z Chin, który zagraża samemu istnieniu populacji jesionów w całej Ameryce Północnej. Dzisiaj przedstawimy protokół analizy ekspresji genów u EAB z wykorzystaniem qPCR, czyli ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym.W protokole tym będą uczestniczyć następujące osoby z zespołu laboratoryjnego: Swapna pri ou, która przeprowadzi sekcje wal, a następnie Bin Bandari zaprezentuje izolację RNA. Na koniec Lauren Rivera Vega zajmie się analizą QPC. Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium również do badania ekspresji genów jesionu.Zacznijmy zatem. Przed rozpoczęciem tej procedury umieść larwy opiętka jesionu (emerald ash B) na wilgotnym papierze tkankowym. Do momentu przeprowadzenia sekcji przechowuj świeżo przygotowany 1x roztwór soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) w lodzie, aby bufor pozostał zimny przez cały czas trwania sekcji.Na początku unieruchom larwy EAB na płytce do sekcji za pomocą cienkich szpilek sekcyjnych. Następnie dodaj do płytki do sekcji zimny roztwór 1x PBS. W pierwszej kolejności odetnij głowy larw za pomocą cienkich nożyczek sekcyjnych.Następnie, za pomocą pęsety zegarmistrzowskiej, odetnij ostatni segment odwłoka larw. Oddziel kutykulę od tułowia larwy, a następnie wykonaj nacięcie wzdłuż tułowia za pomocą nożyczek. Należy uważać, aby nie przerwać ciągłości przewodu pokarmowego.Podczas wykonywania nacięcia należy ostrożnie oddzielić tkankę jelita środkowego od pozostałych tkanek, takich jak ciała tłuszczowe i tkanka łączna. Następnie tkankę należy wypłukać w świeżym buforze 1xPBS, aby upewnić się, że nie występuje zanieczyszczenie ciałami tłuszczowymi. Jelito środkowe należy przenieść do 500 µl schłodzonego odczynnika TRIzol w probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml.Następnie za pomocą pęsety wyizoluj tkankę ciała tłuszczowego i przenieś ją do probówki typu eppendorf o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 µl schłodzonego odczynnika triol. Na koniec wyizoluj tkankę kutykuli z kadłuba larwy, zdrapując wszelkie przylegające tkanki. Należy przy tym uważać, aby nie naruszyć integralności tkanki.Przepłucz wyizolowaną tkankę kutykuli w świeżym buforze PBS i przenieś ją do probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 µL schłodzonego odczynnika triazolowego. Wyizolowaną kutykulę ciała tłuszczowego oraz tkanki jelita środkowego można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu ekstrakcji RNA. W ramach przygotowania do ekstrakcji RNA, posegreguj poszczególne próbki EAB zgodnie z etapami rozwoju.Etapy te obejmują pierwszy, drugi, trzeci i czwarty w stadium gwiazdy, PrepU oraz u osobników dorosłych. Aby rozpocząć ekstrakcję RNA, należy najpierw użyć plastikowych tłuczków do homogenizacji tkanek w odczynniku triol w probówkach typu einor o pojemności 1,5 milliliter. Po homogenizacji należy uzupełnić całkowitą objętość każdej próbki do 1 milliliter za pomocą odczynnika triol.W przypadku stadiów rozwojowych, homogenizować całe zwierzę w ciekłym azocie za pomocą moździerza i tłuczka. Następnie dodać alikwot homogenatu do jednego mililitra triolu. Inkubować probówki z próbkami zawierającymi jeden mililitr triolu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Po inkubacji do każdej probówki należy niezwłocznie dodać 200 µL chloroformu. Probówki należy energicznie potrząsać przez około 15 sekund. Następnie probówki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez dodatkowe dwie do trzech minut.Następnie odwiruj próbki z prędkością 12 000 g przez 15 minut w temperaturze 2 °C. Po wirowaniu RNA będzie znajdować się w fazie wodnej. Objętość fazy wodnej powinna wynosić 600 µL lub 60% całkowitej objętości triolu.Ostrożnie usuń wyłącznie fazę wodną. Obecność substancji znajdujących się poniżej fazy wodnej spowoduje zanieczyszczenie wyekstrahowanego RNA. Następnie przenieś fazę wodną do odpowiednio oznakowanej probówki einor o pojemności 1,5 mililitra.Aby wytrącić RNA z mieszaniny fazy wodnej, należy dodać 0,5 ml izopropanolu do każdej probówki. Próbki należy inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji probówki należy wirować z prędkością 12 000 G przez 10 minut w temperaturze 2 °C. Po wirowaniu należy usunąć S natin z probówek.RNA znajduje się w żelowatym osadzie uformowanym na dnie probówki. Przemyć osad 75% etanolem, dodając co najmniej 1 mL 75% etanolu na każdy 1 mL próbki, a następnie wymieszać za pomocą wortexa. Następnie odwirować próbki z prędkością 7 500 G przez pięć minut w temperaturze 2 °C.Odlej nadsącz z probówek. Ponownie odwiruj probówki w małej wirówce stołowej przez jedną minutę. Usuń resztki nadsączu z probówki za pomocą ostrożnego pipetowania.Pozostaw probówkę otwartą i pozwól osadowi wyschnąć na powietrzu przez 5 do 10 minut. Należy uważać, aby nie przesuszyć osadu, ponieważ znacząco zmniejszy to jego rozpuszczalność po suszeniu. Ponownie zawiesić osad w węglanie dietylu lub wodzie zdejonizowanej.Ilość wody użytej do resuspensji osadu zależy od jego wielkości. Należy użyć 50 µL wody oczyszczonej metodą dep sea w przypadku małego osadu lub 100 µL w przypadku dużego osadu. Osad należy całkowicie rozpuścić w wodzie oczyszczonej metodą dep sea, kilkakrotnie przesuwając końcówkę pipety w górę i w dół.Po rozpuszczeniu osadu należy inkubować próbkę w temperaturze 55 °C przez 10 minut. Następnie za pomocą spektrofotometru NanoDrop należy zmierzyć stężenie każdej próbki RNA. Na koniec, dla odpowiednich próbek RNA, przeprowadza się syntezę pierwszej nici cDNA, wykorzystując system Invitrogen SuperScript First-Strand Synthesis System dla RT-PCR.Procedurę tę można znaleźć w części pisemnej niniejszego protokołu. Aby rozpocząć projektowanie ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (Q-R-T-P-C-R), należy zaprojektować każdą starter tak, aby temperatura topnienia wynosiła 60 °C, a rozmiar produktu około 100 pz. W tym doświadczeniu jako gen docelowy wykorzystano AP par one.Do późniejszej analizy i normalizacji danych niezbędny jest gen referencyjny lub kontrola wewnętrzna. W tym przypadku jako gen referencyjny zastosowano białko rybosomalne a P RRP one. Następnie należy przygotować szablon z nazwami próbek dla każdej studni oraz dla płytki do qPCR.Pamiętaj o uwzględnieniu standardów dla każdego genu oraz co najmniej dwóch powtórzeń technicznych na próbkę. Następnie włącz urządzenie do qRT-PCR i wprowadź parametry cykliczności, aby skonfigurować płytkę dla urządzenia CFX 96. W pierwszej kolejności przygotuj master mix dla każdego genu w oddzielnej probówce dla każdego dołka.Mieszanina główna (master mix) składa się z 2 µL wody wolnej od nukleaz, 4 µL Cyber Green (2,5x), 1 µL primera forward oraz 1 µL primera reverse, co daje objętość całkowitą 8 µL. Zgodnie z wcześniej przygotowanym schematem, do każdego dołka należy dodać 2 µL cDNA. Następnie do każdego dołka dodaje się 8 µL mieszaniny głównej, tak aby całkowita objętość jednej reakcji wyniosła 10 µL. Próbki należy wymieszać poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół.Upewnij się, że na końcówce nie pozostał żaden płyn. Aby uniknąć zanieczyszczeń krzyżowych, używaj nowej końcówki dla każdej próbki. Po przygotowaniu całej płytki należy przykryć ją taśmą optyczną.Należy unikać dotykania taśmy, ponieważ obecność tłuszczu może wpłynąć na odczyt. Następnie należy wirować płytkę z prędkością 500 RPM przez jedną minutę, aby upewnić się, że po wirowaniu wszystkie produkty w dołkach znajdują się na dnie płytki. Należy sprawdzić, czy na dnie płytki nie ma lodu ani wody.Na koniec umieść płytkę w urządzeniu do QR TPCR i uruchom program PCR; przedstawiono reprezentatywne wyniki dla larw EAB. Poniżej pokazano sekcję oraz QR TPCR. Sekcja larwy EAB powinna odsłonić jelito środkowe w środkowej części larwy EAB.Środkowy jelito larwy EAB jest izolowane w sposób pokazany tutaj, przedstawiono średnie wartości ekspresji względnej lub RAV. Dla genu paratrofiny AP par one wyniki przedstawiono tutaj dla różnych tkanek larwalnych, w tym kutykuli, jelita środkowego i ciał tłuszczowych. Specyficzne dla EAB białko rybosomalne ARP one zostało użyte jako kontrola wewnętrzna do normalizacji danych uzyskanych dla badanego genu.Wyznaczono względną krotność zmiany poziomu ekspresji genu AP par one dla różnych tkanek larwalnych. Tkanka kutykuli wykazała najniższą ekspresję i została zatem przyjęta jako próbka kalibracyjna dla średniej wartości RVs dla AP Perry one w różnych stadiach rozwojowych EAB, w tym w pierwszym, drugim, trzecim i czwartym stadium larwalnym (LAR) gwiazd.Poziomy PrepU i dorosłych określono, wykorzystując aprp one jako kontrolę wewnętrzną do normalizacji danych. Określono względną krotność zmiany AP Perry one dla różnych etapów rozwojowych. W tym przypadku próbka PrepU wykazała najniższy poziom mRNA i została zatem przyjęta jako kalibrator.Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzania sekcji bocznych oraz następującej po niej analizy ekspresji genów w tkankach bocznych, a także w różnych stadiach rozwojowych Emeral ra, przy użyciu ilościowej R-T-P-C-R podczas realizacji tej procedury. Należy zachować ostrożność podczas sekcji, aby nie doprowadzić do zanieczyszczenia krzyżowego próbek tkanek. Należy również zachować staranność podczas przeprowadzania Q-R-T-P-C-R, aby pipetować odpowiednie próbki do właściwych studzienek PCR.To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie naszego filmu i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

analysis-gene-expression-emerald-ash-borer-agrilus-planipennis-using

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Analiza ekspresji genów w szkodniku zwanym złocieńczyk iwienczyk (Agrilus planipennis) z wykorzystaniem ilościowej metody PCR w czasie rzeczywistym

Przeprowadzono analizę mikromacierzy w celu określenia profili ekspresji genów u C. elegans, a w celu walidacji i kwantyfikacji danych z mikromacierzy zastosowano reakcję PCR w czasie rzeczywistym.

Wyznaczanie profili ekspresji genetycznej w C. elegans z wykorzystaniem mikromacierzy i PCR w czasie rzeczywistym

Opisujemy protokół z wykorzystaniem C. elegans oraz bibliotek RNAi dostarczanych drogą pokarmową, który umożliwia zautomatyzowany pomiar wielu parametrów, takich jak fluorescencja, rozmiar i nieprzezroczystość poszczególnych nicieni w populacji. Przedstawiamy przykład screeningu służącego do identyfikacji genów zaangażowanych w wrodzoną odporność przeciwgrzybiczą u C. elegans.

Ilościowe i zautomatyzowane wysokoprzepustowe przesiewy RNAi w całym genomie u C. elegans

Test ekspresji genów jednokomórkowych jest potrzebny do zrozumienia heterogeniczności komórek macierzystych.

Profilowanie pojedynczych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych za pomocą ilościowego RT-PCR

Analizy RNA-Seq stają się coraz ważniejsze dla identyfikacji molekularnych podstaw cech adaptacyjnych w organizmach niemodelowych. W tym miejscu opisano protokół identyfikacji genów o zróżnicowanej ekspresji między komarami Aedes albopictus z diapauzą i bez diapauzy, od hodowli komarów po sekwencjonowanie RNA i analizy bioinformatyczne danych RNA-Seq.

Eksperymentalny i bioinformatyczny protokół do analiz sekwencyjnych RNA diapauzy fotoperiodycznej u azjatyckiego komara tygrysiego, Aedes albopictus

Ten protokół opisuje metodę testowania hipotezy, że odwrócenie efektywnego pola geomagnetycznego (GMF) indukuje różnicową ekspresję genów i zmienia morfologię Arabidopsis thaliana. Trójosiowy ośmiokątny układ par cewek Helmholtza został wykorzystany do sztucznego generowania odwróconych warunków GMF w komorze wzrostu roślin.

Pole geomagnetyczne (Gmf) i ewolucja roślin: badanie wpływu odwrócenia GMF na rozwój Arabidopsis thaliana i ekspresję genów

Skuteczne pułapki do przyciągania i chwytania omacnicy szmaragdowej (EAB) są kluczowym elementem wykrywania i zwalczania tego inwazyjnego szkodnika. Pułapki piętrowe, umieszczane w pełnym słońcu w pobliżu jesionów, zawierają wskazówki wizualne i węchowe i były bardziej skłonne do uchwycenia EAB niż inne projekty pułapek w próbach terenowych.

Budowa dwupoziomowych pułapek do wczesnego wykrywania omacnicy szmaragdowej

Ten protokół przedstawia podejście do analizy całego transkryptomu z zarodków danio pręgowanego, larw lub posortowanych komórek. Obejmuje izolację RNA, analizę szlaku danych RNASeq oraz walidację zmian ekspresji genów opartą na qRT-PCR.

Przygotowanie próbki i analiza danych dotyczących ekspresji genów opartych na RNASeq od danio pręgowanego

Przedstawiono ulepszony protokół pomiaru przejściowej ekspresji genów z konstruktów reporterowych w komórkach aleuronowych jęczmienia po bombardowaniu cząsteczkami. Połączenie zautomatyzowanego mielenia ziarna z 96-dołkowymi testami enzymatycznymi na płytkach zapewnia wysoką wydajność zabiegu.

Pomiar ekspresji genów w warstwach aleuronu z bombardowanego jęczmienia ze zwiększoną przepustowością

Mszyca Aphis nerii kolonizuje dobrze chronione rośliny z rodziny psowatych (Apocyanaceae) i dostarcza licznych możliwości badania interakcji między roślinami a owadami. W tym miejscu przedstawiamy szereg protokołów dotyczących utrzymania kultur roślin i mszyc oraz generowania i analizy danych molekularnych i -omicznych dla A. nerii.

Utrzymywanie kultur biologicznych i pomiar ekspresji genów u Aphis nerii: niemodelowy system interakcji między roślinami a owadami

Opisujemy metodę immunofluorescencji i ilościowego PCR do lokalizacji i kwantyfikacji begomowirusów w tkankach owadów. Protokół immunofluorescencji może być stosowany do kolokalizacji białek wirusowych i wektorowych. Ilościowy protokół PCR można rozszerzyć w celu ilościowego oznaczania wirusów w całych ciałach mączlika i roślinach zakażonych wirusem.

Lokalizacja i kwantyfikacja begomowirusów w tkankach mączlika metodą immunofluorescencji i ilościowego PCR

W tym artykule opisany jest protokół o wysokiej przepustowości do szybkiego i niezawodnego określania poziomów ekspresji genów w pojedynczych lub zbiorczych próbkach C. elegans. Protokół ten nie wymaga izolacji RNA i wytwarza cDNA bezpośrednio z próbek. Może być używany razem z wysokoprzepustowymi, multipleksowanymi, nanofluidycznymi platformami qPCR w czasie rzeczywistym.

Wysokoprzepustowy ilościowy RT-PCR w pojedynczych i masowych próbkach C. elegans przy użyciu technologii nanofluidycznej

Poznaj analizę ekspresji genów u omacnicy szmaragdowej Agrilus planipennis przy użyciu ilościowego PCR w czasie rzeczywistym. Ta metoda pozwala badać poziomy mRNA w tkankach larwalnych i różnych stadiach rozwojowych.

Analiza ekspresji genów u opiętka jesionowego (Agrilus planipennis) z wykorzystaniem ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym

Przeglądaj więcej filmów