Analiza ekspresji genów u opiętka jesionowego (Agrilus planipennis) z wykorzystaniem ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest analiza ekspresji genów w tkankach i stadiach rozwojowych jesionowca szmaragdowego za pomocą ilościowej PCR. Jest to realizowane poprzez sekcję tkanek larwalnych i kategoryzację stadiów rozwojowych. W drugim kroku ekstrahuje się RNA z tkanek i stadiów rozwojowych przy użyciu odczynnika trizol, który następnie służy jako matryca do wygenerowania pierwszej nici cDNA; po syntezie pierwszej nici cDNA przeprowadzana jest ilościowa RT-PCR.

Uzyskano wyniki wykazujące różnicową ekspresję genu docelowego w różnych tkankach larwalnych i stadiach rozwojowych na podstawie danych o całkowitej zmianie uzyskanych z wartości progowych cyklu po amplifikacjach ilościowych R-T-P-C-R. Cześć, jestem Prakash Mi, kierownik tego laboratorium w Katedrze Entomologii na Uniwersytecie stanowym Ohio.

Moje laboratorium koncentruje się głównie na aspektach genomicznych i molekularnych interakcji między jesionem a szympianem jesionowym. Szympian jesionowy (EAB) jest egzotycznym inwazyjnym szkodnikiem pochodzącym z Chin, który zagraża samemu istnieniu populacji jesionu w całej Ameryce Północnej. Dzisiaj przedstawimy protokół analizy ekspresji genów u EAB z wykorzystaniem qPCR, czyli ilościowej polimerazy łańcuchowej w czasie rzeczywistym.

W protokół ten zaangażowani będą następujący członkowie zespołu: Swapna pri ou, która przeprowadzi sekcje wal, oraz Bin Bandari, który zaprezentuje izolację RNA. Na koniec Lauren Rivera Vega zajmie się analizą QPC. Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium również do badania ekspresji genów jesionu.

Przejdźmy zatem do działania. Przed rozpoczęciem procedury umieść larwy opiętka jesionowego (emerald ash B) na wilgotnym papierze odkładowym. Do momentu przeprowadzenia sekcji przechowuj świeżo przygotowany 1x fosforan bufor salinowy (PBS) w lodzie, aby bufor pozostał zimny przez cały czas trwania sekcji.

Na początek unieruchom larwy EAB na płytce sekcyjnej za pomocą cienkich szpilek sekcyjnych. Następnie dodaj do płytki sekcyjnej zimny 1x PBS. W pierwszej kolejności odetnij głowy larw za pomocą precyzyjnych nożyczek sekcyjnych.

Następnie, przy użyciu pęsety zegarmistrzowskiej, usuń ostatni segment odwłoka larwy. Oddziel kutykulę od tułowia larwy, a następnie za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie wzdłuż jego długości. Należy uważać, aby nie przerwać ciągłości przewodu pokarmowego.

Podczas wykonywania nacięcia należy ostrożnie odizolować tkankę jelita środkowego od pozostałych tkanek, takich jak ciała tłuszczowe i tkanka łączna. Następnie tkankę należy wypłukać w świeżym buforze 1x PBS, aby upewnić się, że nie wystąpiło zanieczyszczenie ciałami tłuszczowymi. Jelito środkowe należy przenieść do 500 µL schłodzonego odczynnika TRIzol do probówki typu eppendorf o pojemności 1,5 ml.

Następnie za pomocą pęsety wyizolować tkankę ciała tłuszczowego i przenieść ją do probówki typu eppendorf o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 µL schłodzonego odczynnika triol. Na koniec wyizolować tkankę kutykuli z tułowia larwy, zeskrobując wszelkie przylegające tkanki. Należy przy tym uważać, aby nie naruszyć integralności tkanki.

Przepłucz wyizolowaną tkankę kutykuli w świeżym buforze PBS i przenieś ją do probówki typu eppendorf o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 µL schłodzonego odczynnika triazolowego. Wyizolowane tkanki ciała tłustego, kutykuli i jelita środkowego można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu ekstrakcji RNA. W ramach przygotowania do ekstrakcji RNA posegreguj poszczególne próbki EAB zgodnie ze stadiami rozwojowymi.

Etapy te obejmują pierwszy, drugi, trzeci i czwarty w stadium gwiazdy, PrepU oraz u osobników dorosłych. Aby rozpocząć ekstrakcję RNA, należy najpierw użyć plastikowych tłuczków do homogenizacji tkanek w triolu w probówkach typu einor o pojemności 1,5 ml. Po homogenizacji należy uzupełnić całkowitą objętość każdej próbki do 1 ml za pomocą odczynnika triol.

W przypadku stadiów rozwojowych, homogenizować całe zwierzę w ciekłym azocie za pomocą moździerza i tłuczka. Następnie dodać aلیکwot homogenatu do jednego mililitra triolu. Inkubować probówki z próbkami zawierającymi jeden mililitr triolu przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji dodaj 200 µL chloroformu do każdej probówki. Energicznie wstrząsaj probówkami przez około 15 sekund. Następnie inkubuj probówki w temperaturze pokojowej przez dodatkowe dwie do trzech minut.

Następnie odwiruj próbki z prędkością 12 000 GS przez 15 minut w temperaturze 2°C. Po wirowaniu RNA znajdzie się w fazie wodnej. Objętość fazy wodnej powinna wynosić 600 µL lub 60% całkowitej objętości triolu.

Ostrożnie usuń wyłącznie fazę wodną. Obecność substancji poniżej fazy wodnej spowoduje zanieczyszczenie wyekstrahowanego RNA. Następnie przenieś fazę wodną do odpowiednio oznakowanej probówki einor o pojemności 1.5 mililitra.

Aby wyprecypitować RNA z mieszaniny fazy wodnej, dodaj 0,5 milliliters izopropanolu do każdej probówki. Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minutes. Po inkubacji wiruj probówki z prędkością 12 000 Gs przez 10 minutes w temperaturze two degrees Celsius. Po wirowaniu usuń S natin z probówek.

RNA znajduje się w osadzie o konsystencji żelu utworzonym na dnie probówki. Przemyj osad 75% etanolem, dodając co najmniej 1 mL 75% etanolu na każdy 1 mL próbki, a następnie wymieszaj za pomocą wortexa. Następnie odwiruj probówki z prędkością 7 500 G przez pięć minut w temperaturze 2 °C.

Odrzuć nadsącz z probówek. Ponownie odwiruj probówki w małej wirówce stołowej przez jedną minutę. Usuń nadmiar nadsączu z probówki za pomocą ostrożnego pipetowania.

Pozostaw probówkę otwartą i pozwól osadowi wyschnąć na powietrzu przez 5 do 10 minut. Należy uważać, aby nie przesuszyć osadu, ponieważ znacząco zmniejszy to jego rozpuszczalność po suszeniu. Ponownie zawiesić osad w dathyl percarbonate lub wodzie DEP sea treated.

Ilość wody użytej do resuspensji osadu będzie zależeć od jego wielkości. Należy użyć 50 µL wody dep sea treated dla małego osadu lub 100 µL dla dużego osadu. Pozostaw osad do całkowitego rozpuszczenia w wodzie dep sea treated, poruszając końcówką pipety w górę i w dół kilka razy.

Po rozpuszczeniu osadu inkubuj próbkę w temperaturze 55°C przez 10 minut. Następnie zmierz stężenie każdej próbki RNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop. Na koniec przeprowadź syntezę pierwszej nici cDNA dla odpowiednich próbek RNA, wykorzystując system Invitrogen SuperScript First-Strand Synthesis System do RT-PCR.

Procedurę tę można znaleźć w części pisemnej niniejszego protokołu. Aby rozpocząć projektowanie ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (Q-R-T-P-C-R), należy zaprojektować każdą starter tak, aby temperatura topnienia wynosiła 60 °C, a rozmiar produktu około 100 par zasad. Jako gen docelowy w tym eksperymencie wykorzystano AP par one.

Do późniejszej analizy i normalizacji danych niezbędny jest gen referencyjny lub kontrola wewnętrzna. W tym przypadku jako gen referencyjny wykorzystano białko rybosomalne a P RRP one. Następnie należy przygotować szablon z nazwami próbek dla każdej studni oraz dla płytki QR tpcr.

Należy pamiętać o dołączeniu wzorców dla każdego genu oraz przynajmniej dwóch powtórzeń technicznych dla każdej próbki. Następnie należy włączyć urządzenie do qRT-PCR i wprowadzić parametry cykli, aby skonfigurować płytkę dla systemu CFX 96. W pierwszej kolejności należy przygotować master mix dla każdego genu w osobnej probówce dla każdej studzienki.

Mieszanina master mix składa się z 2 µL wody wolnej od nukleaz, 4 µL 2,5 x cyber green, 1 µL primera forward oraz 1 µL primera reverse, co daje objętość całkowitą 8 µL. Zgodnie z wcześniej przygotowanym schematem, do każdej studzienki należy dodać 2 µL cDNA. Następnie do każdej studzienki dodaje się 8 µL master mixu, co daje objętość całkowitą 10 µL na reakcję. Praca pipetą w górę i w dół zapewni dokładne wymieszanie próbki.

Upewnij się, że na końcówce nie pozostał żaden płyn. Aby uniknąć zanieczyszczeń krzyżowych, używaj nowej końcówki do każdej próbki. Po przygotowaniu całej płytki przykryj ją taśmą optyczną.

Należy unikać dotykania taśmy, ponieważ obecność tłuszczu może wpłynąć na odczyt. Następnie należy odwirować płytkę z prędkością 500 RPM przez jedną minutę, aby upewnić się, że po wirowaniu wszystkie produkty w dołkach znajdują się na dnie płytki. Należy sprawdzić, czy na dnie płytki nie ma lodu ani wody.

Na koniec umieść płytkę w urządzeniu do QR TPCR i uruchom program PCR; przedstawiono reprezentatywne wyniki dla larw EAB. Poniżej pokazano proces sekcji oraz QR TPCR. Sekcja larwy EAB powinna odsłonić jelito środkowe w środkowej części larwy EAB.

Środkowy jelito larwy EAB izoluje się w sposób pokazany tutaj, średnie wartości ekspresji względnej lub RAVs. Dla genu paratrofiny AP par one przedstawiono tutaj dla różnych tkanek larwalnych, w tym kutykuli, jelita środkowego i ciał tłuszczowych. Specyficzne dla EAB białko rybosomalne ARP one zostało wykorzystane jako kontrola wewnętrzna do normalizacji danych uzyskanych dla badanego genu.

Obliczono względną krotność zmiany ekspresji AP AP par one dla różnych tkanek larwalnych. Tkanka kutykula wykazała najniższy poziom ekspresji i została zatem przyjęta jako średnia wartość kalibracyjna RVs dla AP Perry. One w różnych stadiach rozwojowych EAB, w tym w pierwszym, drugim, trzecim i czwartym stadium larwalnym (LAR) w gwiazdach.

Poziomy PrepU i osobników dorosłych określono, wykorzystując aprp one jako kontrolę wewnętrzną do normalizacji danych. Wyznaczono względną zmianę krotności AP Perry one dla różnych etapów rozwojowych. W tym przypadku próbka PrepU wykazała najniższy poziom mRNA i została zatem przyjęta jako kalibrator.

Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzać sekcje boczne, a następnie analizę ekspresji genów z wykorzystaniem tkanek bocznych oraz różnych stadiów rozwojowych Emeral ra za pomocą ilościowej R-T-P-C-R podczas realizacji tej procedury. Należy zachować ostrożność podczas sekcji, aby nie doprowadzić do kontaminacji krzyżowej próbek tkanek. Należy również zachować staranność podczas przeprowadzania Q-R-T-P-C-R, aby pipetować odpowiednie próbki do właściwych studni PCR.

To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie naszego filmu i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu doświadczeń.