Analiza ekspresji genów u opalisz jesionowego (Agrilus planipennis) z wykorzystaniem ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest analiza ekspresji genów w tkankach i etapach rozwojowych jesionówki szmaragdowej za pomocą ilościowego PCR. Osiąga się to poprzez wypreparowanie tkanek larwalnych i kategoryzację etapów rozwojowych. W drugim kroku ekstrahuje się RNA z tkanek i etapów rozwojowych przy użyciu odczynnika trizol, który następnie służy jako matryca do wygenerowania pierwszej nici cDNA; po syntezie pierwszej nici cDNA przeprowadzany jest ilościowy RT-PCR.

Uzyskane wyniki wykazują różnicową ekspresję genu docelowego w różnych tkankach larwalnych i stadiach rozwojowych na podstawie danych o całkowitej zmianie otrzymanych z wartości progowych cyklu po ilościowej amplifikacji R-T-P-C-R. Cześć, jestem Prakash Mi, kierownik tego laboratorium w Departamencie Entomologii na Uniwersytecie Stanowym Ohio.

Moje laboratorium koncentruje się głównie na genomowych lub molekularnych aspektach interakcji między jesionowym szympianem, jesionem a patogenami. Jesionowy szympian, znany jako EAB (emerald ash borer), jest egzotycznym inwazyjnym szkodnikiem pochodzącym z Chin, który zagraża samemu istnieniu populacji jesionów w całej Ameryce Północnej. Dzisiaj przedstawimy protokół analizy ekspresji genów u EAB z wykorzystaniem qPCR, czyli ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym.

Członkami zespołu laboratoryjnego zaangażowanymi w ten protokół są Swapna pri ou, która przeprowadzi sekcje wal, oraz Bin Bandari, który zaprezentuje izolację RNA. Na koniec Lauren Rivera Vega zajmie się analizą qPCR. Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania ekspresji genów w popiołowcu.

Zacznijmy. Przed rozpoczęciem tej procedury umieść larwy *Agrilus planipennis* na wilgotnym papierze tkankowym. Do momentu przeprowadzenia sekcji utrzymuj świeżo przygotowany 1x roztwór soli fizjologicznej w buforze fosforanowym (PBS) w lodzie, aby bufor pozostał zimny przez cały czas trwania procesu.

Na początek unieruchom larwy EAB na płytce do sekcji za pomocą cienkich szpilek sekcyjnych. Następnie dodaj do płytki do sekcji zimny 1×PBS. W pierwszej kolejności odetnij głowy larw za pomocą precyzyjnych nożyczek sekcyjnych.

Następnie, za pomocą pęsety zegarmistrzowskiej, usuń ostatni segment odwłoka larwy. Oddziel kutykulę od tułowia larwy, a następnie za pomocą nożyczek wykonaj nacięcie wzdłuż tułowia. Należy uważać, aby nie przerwać ciągłości jelita.

Podczas wykonywania nacięcia ostrożnie odizoluj tkankę jelita środkowego od pozostałych tkanek, takich jak ciała tłuszczowe i tkanka łączna. Następnie wypłucz tkankę w świeżym buforze 1x PBS, aby upewnić się, że nie ma zanieczyszczeń z ciał tłuszczowych. Przenieś jelito środkowe do 500 µL schłodzonego odczynnika TRIzol w probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml.

Następnie, za pomocą pęsety wyizoluj tkankę ciała tłuszczowego i przenieś ją do probówki typu eppendorf o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 µl schłodzonego odczynnika TRIzol. Na koniec wyizoluj tkankę kutykuli z pancerza larwy, zeskrobując wszelkie przylegające tkanki. Należy przy tym uważać, aby nie naruszyć integralności tkanki.

Przepłucz wyizolowaną tkankę kutykuli w świeżym buforze PBS, a następnie przenieś ją do probówki typu eppendorf o pojemności 1,5 ml zawierającej 500 µL schłodzonego odczynnika triazolowego. Wyizolowane tkanki ciała tłuszczowego, kutykuli oraz jelita środkowego można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu ekstrakcji RNA. W ramach przygotowania do ekstrakcji RNA, posegreguj poszczególne próbki EAB zgodnie z etapami rozwojowymi.

Etapy te obejmują pierwszy, drugi, trzeci i czwarty w przypadku gwiazd, PrepU oraz osobników dorosłych. Aby rozpocząć ekstrakcję RNA, najpierw użyć plastikowych tłuczków do homogenizacji tkanek w probówkach typu einor o pojemności 1,5 mililitra zawierających triol. Po homogenizacji doprowadzić całkowitą objętość każdej próbki do 1 mililitra za pomocą odczynnika triol.

W przypadku poszczególnych stadiów rozwojowych należy zhomogenizować całe zwierzę w ciekłym azocie za pomocą moździerza i tłuczka. Następnie do jednego mililitra triolu należy dodać alikwot homogenatu. Probówki z próbkami zawierającymi jeden mililitr triolu inkubowano przez 15 minut w temperaturze pokojowej.

Po inkubacji, niezwłocznie po dodaniu chloroformu, dodaj 200 µL chloroformu do każdej probówki. Energicznie wstrząsaj probówkami przez około 15 sekund. Następnie inkubuj probówki w temperaturze pokojowej przez dodatkowe dwie do trzech minut.

Następnie odwiruj próbki przy 12 000 g przez 15 minut w temperaturze 2 °C. Po wirowaniu RNA znajdzie się w fazie wodnej. Objętość fazy wodnej powinna wynosić 600 µL lub 60% całkowitej objętości triola.

Ostrożnie usuń wyłącznie fazę wodną. Obecność substancji poniżej fazy wodnej spowoduje zanieczyszczenie wyekstrahowanego RNA. Następnie przenieś fazę wodną do odpowiednio oznakowanej probówki typu einor o pojemności 1,5 ml.

Aby wytrącić RNA z mieszaniny fazy wodnej, dodaj 0,5 mililitra izopropanolu do każdej probówki. Inkubuj próbki w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Po inkubacji wiruj probówki przy 12 000 G przez 10 minut w temperaturze dwóch stopni Celsjusza. Po wirowaniu odlej S natin z probówek.

RNA znajduje się w żelowatym osadzie uformowanym na dnie probówki. Przemyj osad 75% etanolem, dodając co najmniej 1 mL 75% etanolu na każdy 1 mL próbki, a następnie wymieszaj za pomocą vorteXa. Następnie odwiruj zawartość probówek przy 7 500 G przez pięć minut w temperaturze 2 °C.

Odlej nadsącz z probówek. Ponownie odwiruj probówki w małej wirówce stołowej przez jedną minutę. Usuń nadmiar nadsączu z probówki za pomocą ostrożnego pipetowania.

Pozostaw probówkę otwartą i pozwól osadowi wyschnąć na powietrzu przez 5 do 10 minut. Należy uważać, aby nie przesuszyć osadu, ponieważ znacząco zmniejszy to jego rozpuszczalność po suszeniu na powietrzu. Ponownie zawieś osad w węglanie dietylu lub wodzie zdejonizowanej.

Ilość wody użytej do resuspensji osadu zależy od jego wielkości. W przypadku małego osadu należy użyć 50 µL wody opracowanej zgodnie z procedurą DEP sea, a w przypadku dużego osadu 100 µL. Należy całkowicie rozpuścić osad w wodzie opracowanej zgodnie z procedurą DEP sea, kilkakrotnie przesuwając końcówkę pipety w górę i w dół.

Po rozpuszczeniu osadu należy inkubować próbkę w temperaturze 55 °C przez 10 minut. Następnie należy zmierzyć stężenie każdej próbki RNA za pomocą spektrofotometru NanoDrop. Na koniec należy przeprowadzić syntezę pierwszej nici cDNA dla odpowiednich próbek RNA, korzystając z zestawu Invitrogen SuperScript First-Strand Synthesis System do RT-PCR.

Opis tej procedury znajduje się w części pisemnej niniejszego protokołu. Aby rozpocząć projektowanie ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (Q-R-T-P-C-R), należy zaprojektować każdy starter tak, aby temperatura topnienia wynosiła 60 °C, a wielkość produktu około 100 par zasad. Jako gen badanego w tym eksperymencie wykorzystano AP par one.

Do późniejszej analizy i normalizacji danych niezbędny jest gen referencyjny lub kontrola wewnętrzna. W tym przypadku jako gen referencyjny zastosowano białko rybosomalne a P RRP one. Następnie należy przygotować schemat określający nazwę próbki dla każdej studzienki na płytce QR tpcr.

Należy pamiętać o uwzględnieniu standardów dla każdego genu oraz co najmniej dwóch powtórzeń technicznych dla każdej próbki. Następnie należy włączyć urządzenie do qRT-PCR i wprowadzić parametry cykli, aby przygotować płytkę dla urządzenia CFX 96. W pierwszej kolejności należy przygotować master mix dla każdego genu w osobnej probówce dla każdej studzienki.

Mieszanina master mix składa się z 2 µL wody wolnej od nukleaz, 4 µL 2,5 x cyber green, 1 µL prawego primera oraz 1 µL lewego primera, co daje całkowitą objętość 8 µL. Zgodnie z wcześniej przygotowanym schematem, do każdej studzienki należy dodać 2 µL cDNA. Następnie do każdej studzienki dodaje się 8 µL mieszaniny master mix, co daje całkowitą objętość 10 µL na reakcję. Należy pipetować próbkę w górę i w dół, aby upewnić się, że została ona dobrze wymieszana.

Upewnij się, że na końcówce nie pozostała żadna ciecz. Aby uniknąć kontaminacji krzyżowej, używaj nowej końcówki dla każdej próbki. Po przygotowaniu całej płytki należy przykryć ją taśmą optyczną.

Należy unikać dotykania taśmy, ponieważ obecność tłuszczu może wpłynąć na odczyt. Następnie należy odwirować płytkę przy 500 RPM przez jedną minutę, aby upewnić się, że po wirowaniu wszystkie produkty w dołkach znajdują się na dnie płytki. Należy sprawdzić, czy na dnie płytki nie ma lodu ani wody.

Na koniec umieść płytkę w urządzeniu do QR TPCR i uruchom program PCR; przedstawiono reprezentatywne wyniki dla larv EAB. Poniżej pokazano sekcję oraz QR TPCR. Sekcja larwy EAB powinna odsłonić jelito środkowe w centralnej części larwy EAB.

Środkowy jelito larwy EAB jest izolowane w sposób przedstawiony tutaj, wartości średniej ekspresji względnej lub RAVs. Dla genu paratrophin AP par one przedstawiono tutaj wyniki dla różnych tkanek larwalnych, w tym kutykuli, jelita środkowego i ciał tłuszczowych. Specyficzne dla EAB białko rybosomalne ARP one zostało użyte jako kontrola wewnętrzna do normalizacji danych uzyskanych dla badanego genu.

Wyznaczono względną krotność zmiany poziomu AP par one dla różnych tkanek larwalnych. Tkanka kutykuli wykazała najniższą ekspresję i została zatem przyjęta jako próbka kalibracyjna dla średnich RVs dla AP Perry. One w różnych stadiach rozwojowych EAB, w tym w pierwszej, drugiej, trzeciej i czwartej stadium larwalnym w gwiazdach.

Poziomy PrepU i dorosłych określono, wykorzystując aprp one jako kontrolę wewnętrzną do normalizacji danych. Wyznaczono względną krotność zmiany AP Perry one dla różnych etapów rozwoju. W tym przypadku próbka PrepU wykazała najniższy poziom mRNA i została zatem przyjęta jako kalibrator.

Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić sekcje boczne, a następnie analizę ekspresji genów z wykorzystaniem tkanek bocznych oraz różnych stadiów rozwojowych Emeral ra za pomocą ilościowej R-T-P-C-R podczas realizacji tej procedury. Należy zachować ostrożność podczas sekcji, aby nie dopuścić do kontaminacji krzyżowej próbek tkanek. Należy również zachować ostrożność podczas wykonywania Q-R-T-P-C-R, aby pipetować odpowiednie próbki do właściwych studni PCR.

To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie naszego filmu i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.