Name: Znakowanie i obrazowanie komórek w tyłomózgowiu danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Poznaj technikę znakowania i obrazowania komórek nerwowych w tyłomózgowiu Danio rerio przy użyciu GFP skierowanego do błony komórkowej. Metoda umożliwia wizualizację dynamiki pojedynczych komórek w żywych zarodkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Niniejsza praca była wspierana z grantu NIH przyznanego R. Brewsterowi (1R01GM085290-01A1).

1.Mikroiniekcja
<ol>
 <li>Rozcieńczyć plazmid kodujący skierowane do błony białko fluorescencyjne GFP (mGFP, courtesy of Richard Harland) do stężenia 40 ng/ml. DNA przygotowuje się poprzez linearyzację plazmidu (mGFP/PCS2+, courtesy of Richard Harland) oczyszczonego przy użyciu zestawu Qiagen Maxi Prep Kit. W celu wizualizacji roztworu zaleca się dodanie czerwieni fenolowej (rozcieńczonej 1/10 całkowitej objętości). Roztwór DNA przechowywać na lodzie.</li>
 <li>Pod stereomikroskopem skalibrować igłę do iniekcji (kapilary szklane 90 mm firmy Narishinge Scientific; nr kat. NA-GD-1), ustawiając igłę na szkiełku pomiarowym i delikatnie uderzając w część igły o średnicy 1 μm za pomocą czystego ostrza brzytwy (aby uzyskać końcówkę o odpowiednim rozmiarze).</li>
 <li>Aby skalibrować igłę do iniekcji znanej objętości (2 nl), podłączyć igłę do aparatury do mikroiniekcji (mikroinjektor PCI 10; Harvard Apparatus) i napełnić igłę od przodu 0,5 μl roztworu zawierającego czerwień fenolową i wodę umieszczoną na kawałku parafiny. Roztwór można wydzielać za pomocą pedału nożnego. Ustawić ciśnienie na 7 KPa i zmieniać czas (10 msec – 30 msec) tak, aby wydzielenie 0,5 μl roztworu wymagało 250 naciśnięć pedału.</li>
 <li>Ostrożnie umieścić skalibrowaną igłę na pasku wosku w nawilżonej szalce Petriego o średnicy 10 mm. Aby nawilżyć szalkę, należy umieścić mokre chusteczki Kimwipes wokół krawędzi (zapobiega to odparowaniu roztworu z igły).</li>
 <li>Za pomocą mikropipety wprowadzić 0,5-1 μl DNA do końca igły (końca, który nie był kalibrowany).</li>
 <li>Gdy roztwór dotrze do końcówki igły, podłączyć koniec użyty do ładowania do aparatury do mikroiniekcji. Dostosować ustawienia mikroinjektora tak, aby za pomocą pedału nożnego podawać około 2 nl na jedną iniekcję.</li>
 <li>Następnie umieścić embriony zebrafish w środku szalki Petriego wypełnionej pożywką do embrionów (Embryo Medium: 1,0 ml Hank's Stock #1, 0,1 ml Hank's Stock #2, 1,0 ml Hank's Stock #4, 95,9 ml ddH2O, 1,0 ml Hank's Stock #5, 1,0 ml świeżego Hank's Stock #6; użyć około 10 kropli 1 M NaOH do uzyskania pH 7,2).</li>
 <li>Gdy embriony osiągną pożądany stopień rozwoju, delikatnie uchwycić chorion cienkimi pęsetą i umieścić igłę w obszarze przeznaczonym do iniekcji. W celu uzyskania szerokiej ekspresji mGFP wstrzyknąć DNA do żółtka lub cytoplazmy w stadium 1 komórki. Aby ograniczyć ekspresję mGFP do mniejszego obszaru, wstrzyknąć DNA w stadium 4 (lub więcej) komórek do cytoplazmy pojedynczej komórki.</li>
 <li>Nacisnąć pedał nożny aparatury do mikroiniekcji i podać około 2 nl, upewniając się, że roztwór (widoczny dzięki dodatkowi czerwieni fenolowej) został prawidłowo wstrzyknięty.</li>
 <li>Ostrożnie wyciągnąć igłę z embrionu.</li>
 <li>Powtórzyć procedurę dla wszystkich embrionów w szalce Petriego.</li>
 <li>Pozostawić embriony do rozwoju w temperaturze 28,5°C do pożądanego stadium.</li>
 <li>Przeprowadzić dechorionację embrionów, delikatnie zdejmując chorion za pomocą cienkiej pęsety (jeśli embriony mają mniej niż 24 hpf, dechorionacja w szklanej szalce Petriego zwiększa przeżywalność embrionów).</li>
 <li>Usunąć pusty chorion z szalki Petriego za pomocą pipety szklanej.</li>
</ol>
2. Obrazowanie przekrojów wykonanych wibratomem z etykietą mGFP
<ol>
 <li>Za pomocą szklanej pipety przenieś embriony do utrwalacza (4% paraformaldehydu w 1X roztworze buforu fosforanowego (PBS)). Utrwalaj embriony przez noc w temperaturze 4°C.</li>
 <li>Przepłucz embriony w 1X PBS 3 razy po 5 minut.</li>
 <li>Umieść embriony w szalce Petriego i za pomocą precyzyjnej pęsety usuń żółtko, nie uszkadzając embrionu. Usuń jak najwięcej żółtka.</li>
 <li>Przygotuj 4% niskotopliwą agarozę w H2O.</li>
 <li>Wlej roztopioną agarozę do plastikowej formy do sekcjowania.</li>
 <li>Używając precyzyjnej pęsety, podnieś wstrzyknięty embrion z szalki Petriego, a następnie umieść go i zorientuj w agarozie. Embrion powinien być ustawiony w stronę jednego z końców formy.</li>
 <li>Po stwardnieniu agarozy użyj narzędzia z płaską powierzchnią, np. szpatułki, aby wyjąć blok agarowy z formy.</li>
 <li>Odetnij dolną krawędź bloku agarowego żyletką, aby wyrównać powierzchnię.</li>
 <li>Nanieś kroplę superkleju na stolik wibrotomu i umieść na nim blok agarowy (strona bloku wyrównana żyletką powinna być skierowana w stronę kleju). W przypadku sekcjowania wielu embrionów, zamocuj na stoliku kilka okazów zatopionych w agarozie.</li>
 <li>Przymocuj stolik do wibrotomu (Vibratome, Inc.).</li>
 <li>Ustaw parametry wibrotomu (typowe ustawienia: prędkość-3; grubość-50μm). Przy sekcjowaniu wielu embrionów wyrównaj bloki agarowe na stoliku i upewnij się, że ostrze przechodzi przez cały embrion, ale nie przez całą szerokość bloków agarowych (tak, aby przekroje odpowiadające temu samemu embrionowi pozostały razem).</li>
 <li>Wlej 1X PBS na stolik wibrotomu.</li>
 <li>Wykonaj sekcjowanie.</li>
 <li>Po zacięciu embrionów usuń bloki agarowe ze stolika wibrotomu.</li>
 <li>Ostrożnie oddziel każdy przekrój, przecinając tył bloków agarowych.</li>
 <li>Używając precyzyjnej pęsety, wybierz pożądane przekroje i umieść je w wielooddziałkowej szalce wypełnionej 1X PBS (użyj różnych oddziałków dla przekrojów pochodzących z różnych embrionów).</li>
 <li>Powtórz czynność dla każdego embrionu.</li>
 <li>Przejdź do znakowania przeciwciałami (kroki od 19 do 23), aby wzmocnić obrazowanie mGFP (ten etap może nie być konieczny, jeśli obrazowanie przekrojów odbywa się w ciągu jednego lub dwóch dni od przygotowania).</li>
 <li>Inkubuj przekroje przez 30 minut w temperaturze pokojowej w roztworze blokującym w 1X PBS, aby zablokować wiązania niespecyficzne.</li>
 <li>Inkubuj przekroje z przeciwciałem pierwszorzędowym (rabbit a-GFP, Invitrogen Cat No. A112) rozcieńczonym 1:20 w roztworze blokującym na wytrząsarce przez 5 godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4°C.</li>
 <li>Przepłucz cztery razy (odpowiednio przez 10 min, 15 min, 30 min i 60 min) w roztworze 1% BSA/1X PBS/ 1% DMSO.</li>
 <li>Traktuj przekroje odpowiednim przeciwciałem wtórnym w roztworze blokującym przez 5 godzin w temperaturze pokojowej lub przez noc w 4°C.</li>
 <li>Przepłucz cztery razy (odpowiednio przez 10 min, 15 min, 30 min i 60 min) w roztworze 1% BSA/1X PBS/ 1% DMSO.</li>
 <li>Traktuj przekroje DAPI (0,1% DAPI w 50ml 1X PBS; Invitrogen Cat No. D1306) przez 30 min w celu barwienia jąder komórkowych.</li>
 <li>Przepłucz trzy razy w 1X PBS po 5 minut.</li>
 <li>Zamontuj na szkiełku.</li>
 <li>Wykonaj obrazowanie przy użyciu mikroskopii konfokalnej.</li>
</ol>
3. Obrazowanie na żywo
<ol>
 <li>Przeprowadź dechorionację żywych, wstrzykniętych zarodków na 30 minut przed osiągnięciem przez nie pożądanego stopnia rozwoju. Umieść zarodki w roztworze sedatywnym (0,01% tricainy w medium dla zarodków) na 15 min.</li>
 <li>Nanieś kroplę 1% agarozy na szalkę hodowlaną z szklanym dnem o średnicy 35 mm (MatTek; nr kat. P35G-o-20-C).</li>
 <li>Pozostawić agarozę do stężenia.</li>
 <li>Podgrzej kapilarę nad płomieniem, aby wykonać 3 otwory w agarozie (do wykonania otworów można użyć innych przedmiotów, np. końcówek do mikropipet). Upewnij się, że na dnie otworów nie pozostały resztki agarozy.</li>
 <li>Napełnić szalkę Petriego pożywką dla embrionów.</li>
 <li>Za pomocą szklanej pipety umieść embrion w otworze.</li>
 <li>Następnie, za pomocą pęsety precyzyjnej, ustaw zarodek tak, aby obszar przeznaczony do obrazowania (grzbietowa część głowy) stykał się ze szkłem.</li>
 <li>Ostrożnie przenieś szalkę Petriego na stolik mikroskopu (na szalce powinna znajdować się pokrywka, aby zapobiec parowaniu).</li>
 <li>Podczas obrazowania należy upewnić się, że embriony znajdują się w 28.5°C.</li>
</ol>
4. Wyniki
Opisujemy tutaj prostą metodę obrazowania pojedynczych komórek w cewie nerwowej danio pręgowanego z wykorzystaniem ekspresji mozaikowej. Pomimo przeźroczystości optycznej zarodka danio pręgowanego, stwierdziliśmy, że wizualizacja komórek nerwowych jest znacznie lepsza w przekrojach wykonanych za pomocą wibratomu. Przekroje te są grube (50 mm), co umożliwia obrazowanie wypustek komórkowych danej komórki w różnych płaszczyznach ogniskowania przy użyciu mikroskopu konfokalnego. Wyniki uzyskane za pomocą tej metodologii zostały opublikowane w innym opracowaniu 2, jednak przedstawiono reprezentatywne obrazy komórek w cewie nerwowej zarodka typu WT (Rysunek 1) oraz mutanta N-kadheryny (N-cad) (Rysunek 2). Te drugie wykazują, że komórki w obszarach bocznych płytki nerwowej u mutantów N-cad nie orientują się prawidłowo w stronę linii środkowej (Rysunek 2). W przeciwieństwie do tego znakowania mozaikowego, immunobarwienie neuroepithelium ogólnym markerem powierzchni komórkowej, takim jak beta-katenina, nie pozwala na wizualizację morfologii poszczególnych komórek (Rysunek 3).
Obrazowanie typu time-lapse żywych embrionów uzupełniło mozaikowe znakowanie utrwalonych preparatów, co pozwoliło na lepsze zrozumienie dynamiki komórkowej zachodzącej podczas neurulacji. Film 1 wykazał, że komórki WT aktywnie migrują w kierunku linii środkowej, wysuwając zorientowane medialnie wypustki błonowe.
<img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig1.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej przedstawiający jądra komórkowe z barwieniem niebieskim i zielonym, analiza komórkowa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> 
 Rycina 1. ekspresja mGFP w rurze nerwowej zarodka zebry WT.
<img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig2.jpg" alt="Obraz z mikroskopii fluorescencyjnej tkanki, niebieskie jądra komórkowe, zielone białka, analiza struktury komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> 
 Rysunek 2. ekspresja mGFP w rurze neuronalnej zarodka ryby danio-ostroskrzelnej N-cadherin.
<img src="/files/ftp_upload/1976/1976fig3.jpg" alt="Obraz z mikroskopii konfokalnej przedstawiający strukturę komórki, z zaznaczonym jądrem (kolor niebieski) i cytoszkieletem (kolor zielony)." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 3"> 
 Rysunek 3. immunobarwienie $\beta$-kateniny w neuroepitelium.

<ol><li>Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish Practical approach series. , Oxford University press. (2002).</li>
<li>Hong, E., Brewster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-cadherin+is+required+for+the+polarized+cell+behaviors+that+drive+neurulation+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">N-cadherin is required for the polarized cell behaviors that drive neurulation in the zebrafish.</a> Development. 133, 3895-3905 (2006).</li>
<li>Andersen, E., Asuri, N., Clay, M., Halloran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+of+Cell+Motility+and+Actin+Cytoskeleton+of+Individual+Neurons+and+Neural+Crest+Cells+in+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos.</a> J Vis Exp. , (2010).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Podsumowując, opisane tutaj techniki znakowania umożliwiają analizę pojedynczych komórek w procesach morfogenetycznych zarodka danio pręgowanego. Głównym celem niniejszego protokołu są metody obrazowania znakowanych komórek w cewce nerwowej z wykorzystaniem mGFP pod kontrolą promotora powszechnego. W celu zapoznania się z dodatkowymi zastosowaniami tej metody przejściowej ekspresji czytelnicy powinni odnieść się do niedawnej publikacji Andersen et al.3.

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1976">Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain</a>. There was an error in the authors affiliations. The authors have been corrected to:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster1 1Department of Biological Sciences, University of Maryland, Baltimore County 2Center for Neuroscience, Children's National Medical Center
instead of:
Pradeepa Jayachandran1, Elim Hong2, Rachel Brewster2 1Center for Neuroscience, Children's National Medical Center 2Department of Biological Sciences, University of Maryland Baltimore County

A correction to the author affiliations has been made for the article Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain.

Erratum: Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_title">Roztwory&lt;/p&gt;</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;ul&gt; &lt;li&gt;Roztwór zapasowy Hank'a nr 1: 8,0 g NaCl, 0,4 g KCl w 100 ml dd H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Roztwór zapasowy Hank'a nr 2: 0,358 g bezwodnego Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0,60 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; w 100 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Roztwór zapasowy Hank'a nr 4: 0,72 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; w 50 ml ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Roztwór zapasowy Hank'a nr 5: 1,23 g MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;x7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O w 50 ml dd H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Bufor fosforanowy 1X: 0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,02 M PO4, pH 7,3&lt;/li&gt; &lt;li&gt;Roztwór blokujący: 2% normalne surowica kozia, 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 1% dimetylosulfotlenku (DMSO)&lt;/li&gt; &lt;/ul&gt;</td></tr></tbody></table>

znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Labeling and Imaging Cells in the Zebrafish Hindbrain

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion kręgowca jest możliwość obrazowania komórek z wysoką rozdzielczością. W embrionach danio pręgowanego wstrzyknięcie plazmidowego DNA skutkuje ekspresją mozaikową, co pozwala na wizualizację pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek1Opisujemy, w jaki sposób wstrzyknięcie plazmidowego DNA kodującego skierowane do błony białko fluorescencyjne GFP (mGFP) pod kontrolą promotora wszechobecnego może być wykorzystane do obrazowania komórek podlegających neurulacji. Kluczowym elementem tego protokołu jest metodologia obrazowania znakowanych komórek w wysokiej rozdzielczości w przekrojach, a także w czasie rzeczywistym. Protokół ten obejmuje wstrzyknięcie DNA mGFP do młodych embrionów zebrafish. Następnie embriony są poddawane sekcjonowaniu za pomocą wibrotomu, znakowaniu przeciwciałami i obrazowaniu za pomocą mikroskopu konfokalnego. Alternatywnie, żywe embriony wykazujące ekspresję mGFP mogą być obrazowane przy użyciu konfokalnej mikroskopii poklatkowej. Wcześniej wykorzystaliśmy to proste podejście do analizy zachowań komórkowych, które napędzają tworzenie cewy nerwowej w regionie tylnego mózgu embrionów zebrafish.2Preparaty utrwalone pozwoliły na bezprecedensową wizualizację kształtów i organizacji komórek w rurce nerwowej, natomiast obrazowanie na żywo uzupełniło to podejście, umożliwiając lepsze zrozumienie dynamiki komórkowej zachodzącej podczas neurulacji.

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion jest możliwość obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości. Opisujemy tutaj technikę znakowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek w całych embrionach ryby danio pręgowanej za pomocą białka GFP skierowanego do błony komórkowej.

Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion kręgowców jest możliwość obrazowania komórek z wysoką rozdzielczością. U danio pręgowanego ...

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest obrazowanie komórek nerwowych z wysoką rozdzielczością w embrionie rybki zebrafish. W pierwszej kolejności do embrionu rybki zebrafish w stadium jednej komórki wstrzykuje się DNA kodujące ukierunkowane na błonę zielone białko fluorescencyjne, co skutkuje mozaikowym dziedziczeniem, umożliwiając tym samym lepsze obrazowanie rozproszonych komórek. Następnie embriony poddawane są immunoznakowaniu przeciwciałem anty-GFP i sekcjonowaniu, co pozwala na wizualizację morfologii pojedynczych komórek z wysoką rozdzielczością w preparacie utrwalonym. Alternatywnie, żywe embriony można badać za pomocą mikroskopii wideo time-lapse w celu obrazowania dynamiki komórkowej.Uzyskano wyniki obrazujące morfologię lub dynamikę komórek. W niniejszym przypadku obrazowanie tylnego mózgu danio pręgowanego wykonano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Witam wszystkich.Nazywam się PR Chandran i pracuję w laboratorium dr Rachel Brewster na wydziale nauk biologicznych na University of Maryland Baltimore County. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę znakowania i obrazowania komórek nerwowych w embrionie danio pręgowanego w wysokiej rozdzielczości. W naszej pracy laboratoryjnej

labeling-and-imaging-cells-in-the-zebrafish-hindbrain

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Oznaczanie i obrazowanie komórek w pniu mózgu rybki zebra

W tym filmie demonstrujemy metodę analizy rozwijającego się mózgu kręgowca w żywych embrionach danio pręgowanego z rozdzielczością pojedynczej komórki przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Obejmuje ona sposób, w jaki wstrzykujemy substancje do embrionu danio pręgowanego w stadium jednej komórki, a następnie montujemy i obrazujemy rozwijający się mózg.

Obrazowanie na żywo embrionalnego mózgu rybki zebrafish przy użyciu mikroskopii konfokalnej

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Hybrydyzacja in situ całego preparatu (WISH) została zastosowana w ramach zaawansowanego kursu biologii porównawczej kręgowców dla studentów studiów licencjackich, jako uzupełnienie sekcji kręgowców. Dzięki temu studenci mieli możliwość zbadania wzorców ekspresji genów oraz anatomii makroskopowej, co pozwoliło na powiązanie badań nad biologią molekularną i organizmalną w ramach jednego kursu.

Zastosowanie preparatów całych (Whole Mount) in situ Hybrydyzacja w celu powiązania biologii molekularnej i organizmalnej

Niniejszy film prezentuje metodę wykorzystującą połączenie elektroporacji i mikroskopii konfokalnej do obrazowania na żywo pojedynczych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego. W ten sposób można przeprowadzić analizę in vivo rozwoju komórek progenitorowych neuronów przedmózgowia na poziomie klonalnym.

Obrazowanie live w trybie time-lapse klonalnie powiązanych komórek progenitorowych neuronów w rozwijającym się przedmózgowiu danio pręgowanego

Ten film opisuje technikę mikrodysekcji mózgu dorosłego danio pręgowanego. Metoda ta pomaga w uzyskaniu neuorosfer pochodzących z całego mózgu, które można dalej badać.

Sekcja mózgu danio pręgowanego: technika neurobiologii ryb

Opisano obrazowanie rozwoju naczyń mózgowych u larw danio pręgowanego. Dostępne są również techniki ułatwiające obrazowanie 3D i modyfikujące rozwój naczyń mózgowych za pomocą zabiegów chemicznych.

Obrazowanie i rekonstrukcja 3D struktur naczyniowo-mózgowych u embrionalnego danio pręgowanego

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem, które może być użyte do zbadania mechanizmów komórkowych leżących u podstaw rozwoju układu nerwowego. W tym miejscu opisujemy technikę wykorzystania poklatkowej mikroskopii konfokalnej do wizualizacji dużej liczby wielokolorowych komórek znakowanych Brainbow w czasie rzeczywistym w rozwijającym się układzie nerwowym danio pręgowanego.

Wizualizacja rozwijającego się mózgu u żyjących danio pręgowanych za pomocą Brainbow i poklatkowego obrazowania konfokalnego

Tutaj prezentujemy metodę obrazowania embrionalnego mózgu danio pręgowanego in vivo, aż do stadium larwalnego i młodocianego. Ta mikroinwazyjna procedura, zaadaptowana z podejść elektrofizjologicznych, zapewnia dostęp do szczegółów komórkowych i subkomórkowych dojrzałego neuronu i może być połączona z badaniami optogenetycznymi i neurofarmakologicznymi w celu scharakteryzowania funkcji mózgu i interwencji farmakologicznej.

Obrazowanie in vivo w pełni aktywnej tkanki mózgowej u wybudzonych larw i osobników młodocianych danio pręgowanego poprzez usunięcie czaszki i skóry

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania in vivo całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej. Procedura eksperymentalna obejmuje przygotowanie próbki, akwizycję obrazu i wizualizację.

In vivo (in vivo) Obrazowanie całego mózgu larw danio pręgowanego za pomocą trójwymiarowej mikroskopii fluorescencyjnej

Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.

Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

Poznaj technikę znakowania i obrazowania komórek nerwowych w tyłomózgowiu Danio rerio przy użyciu GFP skierowanego do błony komórkowej. Metoda umożliwia wizualizację dynamiki pojedynczych komórek w żywych zarodkach.

Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Przeglądaj więcej filmów