Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest obrazowanie komórek nerwowych z wysoką rozdzielczością w embrionie rybki zebrafish. W pierwszej kolejności do embrionu rybki zebrafish w stadium jednej komórki wstrzykuje się DNA kodujące ukierunkowane na błonę zielone białko fluorescencyjne, co skutkuje mozaikowym dziedziczeniem, umożliwiając tym samym lepsze obrazowanie rozproszonych komórek. Następnie embriony poddawane są immunoznakowaniu przeciwciałem anty-GFP i sekcjonowaniu, co pozwala na wizualizację morfologii pojedynczych komórek z wysoką rozdzielczością w preparacie utrwalonym. Alternatywnie, żywe embriony można badać za pomocą mikroskopii wideo time-lapse w celu obrazowania dynamiki komórkowej.

Uzyskano wyniki obrazujące morfologię lub dynamikę komórek. W niniejszym przypadku obrazowanie tylnego mózgu danio pręgowanego wykonano za pomocą mikroskopii konfokalnej. Witam wszystkich.

Nazywam się PR Chandran i pracuję w laboratorium dr Rachel Brewster na wydziale nauk biologicznych na University of Maryland Baltimore County. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę znakowania i obrazowania komórek nerwowych w embrionie danio pręgowanego w wysokiej rozdzielczości. W naszej pracy laboratoryjnej stosujemy tę procedurę zazwyczaj do badania mechanizmów neuroregeneracji w embrionach danio pręgowanego na poziomie komórkowym.

Zacznijmy zatem. Umieść mokre chusteczki Kimwipes wokół krawędzi szalki Petriego o średnicy 100 mm.

Ostrożnie przymocuj szklaną igłę do mikroiniekcji do paska wosku wewnątrz nawilżonego naczynia. Pod stereomikroskopem chirurgicznym ustaw igłę względem podziałki na szkiełku przedmiotowym. Aby uzyskać końcówkę o odpowiedniej wielkości, użyj czystego ostrza brzytwy, aby delikatnie uderzyć w igłę w miejscu, gdzie jej średnica wynosi 1 µm.

Podłącz igłę do aparatury do mikroiniekcji, nanieś 0,5 µL roztworu czerwieni fenolowej z wodą na parafilm i napełnij igłę z kropli. Ustaw ciśnienie mikroiniekcji na 7 kPa i zacznij od impulsu o czasie 20 ms. Policz liczbę impulsów potrzebnych do podania całego płynu. Zmieniaj czas w zakresie od 10 do 30 ms, tak aby do podania cieczy potrzeba było około 250 impulsów.

0,5 µL roztworu. Za pomocą mikropipety wypełnij igłę od tyłu od 0,5 do 1 µL MG FPD NA w wodzie, wymieszanego z czerwienią fenolową w celu wizualizacji. Przykryj nawilżoną szalkę, aby zapobiec odparowywaniu roztworu z igły podczas obserwacji pod mikroskopem stereoskopowym.

Umieść embriony ryb w stadium jednej komórki osobno w 60 milimetrowej szalce Petriego wypełnionej embryo.Medium. Za pomocą precyzyjnej pęsety delikatnie chwyć chorion i ustabilizuj embrion. Przesuń igłę wypełnioną MGFP i czerwienią fenolową w obszar docelowy do iniekcji.

Aby uzyskać szeroki zakres ekspresji MGFP, należy wstrzyknąć roztwór do żółtka lub cytoplazmy. Używając aparatu do mikroiniekcji, należy wprowadzić około dwóch nanolitrów roztworu MGFP. Należy obserwować położenie wskaźnika czerwieni fenolowej, aby potwierdzić prawidłowe wykonanie iniekcji.

Ostrożnie wyjmij igłę z embrionu. Iniekuj wszystkie embriony w szalce, do 30 embrionów za jednym razem. Unikaj wystawiania embrionów na światło; inkubuj w temperaturze 28.5 °C, aby umożliwić rozwój embrionów do pożądanego stadium pod mikroskopem stereoskopowym.

Za pomocą precyzyjnej pęsety delikatnie usuń Corian z embrionów. Użyj pipety Pasteura, aby usunąć pusty Corian z naczynia, pozostawiając jedynie embriony pokryte dec. Przenieś wstrzyknięte i pokryte embriony do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml za pomocą pipety Pasteura wypalanej nad ogniem.

Usunąć jak najwięcej nadmiaru pożywki, a następnie dodać jeden mililitr ative. Przemyć embriony w temperaturze pokojowej 3 razy w 1X PBS, po pięć minut każde z płukań. Przenieść embriony do szalki Petriego wypełnionej 1X PBS pod mikroskopem stereoskopowym.

Za pomocą precyzyjnej pęsety należy utrzymać embrion w pobliżu regionu ogona. Przy użyciu drugiej pęsety lub zgłębnika należy spróbować usunąć jak najwięcej żółtka, unikając dotykania regionu tylnej ramy. Obserwując preparat pod mikroskopem stereoskopowym, należy za pomocą precyzyjnej pęsety przenieść embrion z naczynia do formy do sekcjonowania wypełnionej 4% niskotopliwym agarosem.

Umieść embrion bliżej jednego z końców formy. Pozostaw aros do stężenia w temperaturze pokojowej. Za pomocą szpatułki wyjmij utwardzony blok aros z formy, a następnie za pomocą ostrza odetnij równo dolny koniec bloku.

Jeśli jest to wymagane, należy użyć kropli superglue, aby przymocować bloczek do stolika wibracyjnego stroną cięcia do dołu. Ustaw kilka bloczków na stoliku. Przymocuj stolik do wibratora.

Upewnij się, że ostrze przetnie całkowicie każdy embrion, ale nie przetnie całkowicie bloku. Wypełnij podstawkę jedną sekcją XPBS. Embriony ostrożnie odetnij do tyłu bloku i przenieś je do szalki Petriego wypełnionej XPBS.

Oddziel sekcje pod stereomikroskopem. Używając precyzyjnej pęsety, umieść wybrane sekcje w wielodołkowej płytce wypełnionej 1x PBS. Dla każdego zarodka wykorzystaj osobny dołek.

Przebrać przekroje barwnikiem DPI i przeprowadzić immunoznakowanie przeciwciałem anty-GFP. W przeciwnym razie obrazowanie należy wykonać w ciągu 48 godzin. Na jednym szkiełku umieścić do sześciu przekrojów i przykryć je szkiełkiem nakrywką w celu obrazowania konfokalnego.

Przechowywać preparaty w ciemności, aby uniknąć fotoblaknięcia. Podczas obrazowania na żywo zarodki wstrzyknięte z MGFP muszą być chronione przed światłem. Użyć pęsety, aby przenieść zarodki na 30 minut przed osiągnięciem przez nie pożądanego stadium rozwojowego.

Przenieś pokryte embriony do roztworu uspokajającego składającego się z medium dla embrionów z 0,01% Trica i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Nanieś pipetą kroplę 1% regularnej agarozy w wodzie na szalkę hodowlaną z szklanym dnem o średnicy 35 mm, tak aby wypełniła formę. Pozostaw agarozę do stężenia.

Użyj szklanej kapilary o długości 90 mm, aby wykonać trzy otwory w kropli aros pod mikroskopem stereoskopowym. Zbadaj dno dołka i usuń pęsetą wszelkie pozostałości aros. Wypełnij szalkę pożywką dla embrionów pod mikroskopem stereoskopowym.

Za pomocą pipety do przenoszenia embrionów przenieś jeden embrion do każdego otworu w podłożu. Używając precyzyjnej pęsety, ustaw embrion tak, aby obszar zainteresowania – w tym przypadku grzbietowa część głowy – opierał się o szkło. Przykryj szalkę.

Ostrożnie przenieś szalkę na stolik mikroskopu konfokalnego. Użyj grzałek, aby utrzymać embriony w temperaturze 28.5 °C przez cały czas obrazowania. Poniżej przedstawiono przekrój przez tylny mózg embrionu typu dzikiego w stadium czterech do pięciu somytów, podwójnie znakowanego zieloną GFP ukierunkowaną na błonę oraz niebieskim D; tylko jedna komórka jest znakowana GFP związaną z błoną, co umożliwia obrazowanie morfologii i organizacji komórkowej w wysokiej rozdzielczości.

Jest to obraz porównawczy tylnego mózgowia mutanta nardi na etapie od czterech do pięciu somytów. Obraz ten ujawnia, że komórki u mutantów nardi nie orientują się prawidłowo w stronę linii pośrodkowej podczas neurulacji. W przeciwieństwie do metody znakowania komórek za pomocą MGFP, znakowanie tylnego mózgowia ogólnym markerem powierzchni komórkowej, takim jak beta-katenina, nie pozwala na wizualizację morfologii poszczególnych komórek.

Obrazowanie time-lapse tylnego mózgu zarodka oznakowanego MG FP ujawnia, że zachowania komórkowe napędzające neurorelację u danio pręgowanego są bardzo dynamiczne i obejmują wysuwanie wypustek błonowych podczas migracji i interkalacji komórek. Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak przygotować zarówno utrwalone, jak i żywe zarodki danio pręgowanego do obrazowania pojedynczych komórek w wysokiej rozdzielczości. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.