Model ogniskowego niedokrwienia mózgu poprzez endowaskularną okluzję tętnicy środkowej mózgu u szczura za pomocą szwu

W niniejszym filmie zaprezentujemy metodę wywoływania zawału mózgu poprzez endowaskularną okluzję tętnicy środkowej mózgu u szczura. Jest to powszechnie stosowany model zwierzęcy w badaniach nad udarem, który wywołuje niedokrwienie w korze mózgowej oraz w strukturach podkorowych, w tym w jądrach podstawy i podwzgórzu. Model ten pozwala na wygenerowanie zarówno trwałego, jak i przejściowego niedokrwienia mózgu.

W zależności od tego, czy szew wewnątrzświatłowy pozostanie na miejscu, czy zostanie usunięty po określonym czasie. Niedokrwienie mózgu powoduje powstanie rdzenia zawału, w którym dochodzi do śmierci komórek, oraz obszaru okołozawałowego zwanego penumbrą, w którym możliwa jest częściowa regeneracja komórkowa. Zanim zaczniemy, poświęćmy chwilę na opisanie kroków, które będziemy wykonywać.

Tutaj widzimy uproszczony schemat układu krążenia czaszkowego szczura. W tej operacji odsłonimy lewą tętnicę szyjną w pobliżu rozwidlenia tętnicy szyjnej wspólnej (CCA) na tętnicę szyjną zewnętrzną (ECA) i tętnicę szyjną wewnętrzną (ICA). Dwie małe odgałęzienia ECA, tętnica potyliczna i tętnica tarczowa górna, zostaną podwiązane za pomocą koagulacji bipolarnej, a ECA zostanie podwiązana dystalnie względem tych dwóch odgałęzień przy użyciu jedwabnej nici chirurgicznej. Na tętnicę szyjną wspólną oraz tętnicę szyjną wewnętrzną zostaną nałożone klipsy mikronaczyniowe.

Następnie przez nacięcie w ECA zostanie wprowadzony nylonowy szew monofilamentowy z końcówką pokrytą silikonem, który zostanie poprowadzony w górę do ICA. Ten wewnątrzluminalny szew zostaje lekko zawiązany za pomocą jedwabnego szwu wokół ECA przed zwolnieniem mikroklipsa z ICA. Nylonowy szew wewnątrzluminalny jest następnie przesuwany o około dwa centymetry, aż silikonowa końcówka zablokuje ujście tętnicy środkowej mózgu lub MCA.

Drugi mikroklips zostaje usunięty z CCA, a czas okluzji zostaje zmierzony. Mając teraz ogólny przegląd procedury, przejdźmy do operacji. Przygotuj szczura tak, jak przy każdej procedurze chirurgicznej, zgodnie z wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami obowiązującymi w Twojej instytucji; podajemy szczurowi znieczulenie, stosując 5% isofluranu do indukcji przy przepływie 1 l/min tlenu i 1 l/min tlenku azotu, a następnie zmniejszamy stężenie isofluranu do 1-2% w celu podtrzymania znieczulenia.

Po osiągnięciu odpowiedniego poziomu znieczulenia, do obu oczu aplikujemy maść z sztucznymi łzami, a szyję golimy trymerm. Następnie obszar ten dezynfekujemy roztworem betadyny, a potem 70%etanolem. Proces ten należy powtórzyć, aby łącznie przeprowadzić trzy cykle płukania betadyną i 70%etanolem.

Szczura umieszcza się w sterylnej pończochach i kładzie na kocu termoregulacyjnym, aby zapobiec hipotermii. Pomocne jest lekkie uniesienie szyi poprzez wsunięcie probówki stożkowej 15 ml pod głową szczura.

Ułatwi to późniejsze odsłonięcie tętnic szyjnych. Na koniec, pod mikroskopem operacyjnym, podskórnie wzdłuż planowanego miejsca nacięcia wstrzykuje się 0,2 ml 0,5% roztworu znieczulającego w celu zapewnienia przeciwbólowego działania pooperacyjnego. Za pomocą ostrza skalpela nr 10 wykonuje się nacięcie w linii pośrodkowej.

Dalsza sekcja będzie prowadzona po lewej stronie linii pośrodkowej ciała zwierzęcia. Należy rozpocząć przecinanie powięzi powierzchownej. Czynność tę wykonuje się, łącząc technikę tępego i ostrego rozcinania.

Obfita tkanka gruczołowa jest widoczna bocznie, podczas gdy duży mięsień mostkowo-odbytowy znajduje się w linii środkowej. Używając aplikatorów z bawełnianym końcem, odsuń tchawicę, aby odsłonić gruczoł bocznie i mięsień mostkowo-wyrostkowy przyśrodkowo. Pod tkanką gruczołową widoczne będą mięśnie dwubrzuźcze i mostkowo-mastoidowe, które wraz z położonym w linii środkowej mięśniem mostkowo-wyrostkowym tworzą subtelny trójkąt, którego wierzchołek został zakreślony.

W obrębie tego trójkąta kontynuowana będzie dyssekcja w kierunku tętnicy szyjnej wspólnej. Za pomocą mikronożyczek należy przeciąć powięź pokrywającą mięśnie. Pozwoli to na odsuniecie mięśni i odsłonięcie leżących pod nimi naczyń.

Aplikatory z bawełnianym końcem mogą być wykorzystane do odsunięcia mięśni i odsłonięcia tętnicy szyjnej wspólnej, zewnętrznej oraz wewnętrznej. Kontynuuj pracę w celu odsłonięcia ECA wraz z jej odgałęzieniami. Wymaga to starannej, ostrej dyssekcji naczyń.

Celem tych etapów jest uwolnienie tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA) i tętnicy szyjnej wewnętrznej (ICA) z przylegającej tkanki łącznej. Należy kontynuować preparację ECA w kierunku bocznym. Należy pamiętać, że na drodze może pojawić się kość gnykowy (os hyoideum), co ograniczy zakres preparacji w kierunku rostralnym.

Nerw błędny, który ma biały kolor, przebiega wzdłuż bocznej strony zarówno wspólnej, jak i wewnętrznej tętnicy szyjnej; dokonaliśmy ostrygo odseparowania tętnicy wspólnej szyjnej (CCA) oraz tętnicy wewnętrznej szyjnej (ICA). Ostro odseparowano również dwie odgałęzie tętnicy zewnętrznej szyjnej (ECA). Pierwszą odgałęzienią biegnącą bocznie jest tętnica potyliczna, a drugą, biegnącą przyśrodkowo, jest górna tętnica tarczowa.

Zarówno pierwszą, jak i drugą odgałęzienie tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA) należy przypalić, a następnie przeciąć. Przecięcie tych odgałęzień pozwala na łatwiejszą mobilizację naczyń. W dalszej części procedury, używając jedwabnej nici, należy szczelnie podwiązać ECA tak dystalnie, jak to możliwe.

Luźno zawiąż kolejny szew jedwabny wokół ECA proksymalnie względem rozwidlenia tętnicy szyjnej wspólnej. Upewnij się, że wiązanie to nie zamyka światła naczynia, w przeciwieństwie do szwu endowaskularnego stosowanego do okluzji tętnicy środkowej mózgu. Przez ten odcinek ECA przejdziemy, aby założyć klipsy mikronaczyniowe zarówno na tętnicę szyjną wspólną, jak i na tętnicę szyjną wewnętrzną.

Pozycja ta znajduje się w pewnej odległości od początku ECA. Następnie wykonaj częściową arteriotomię pomiędzy dwoma wiązaniami jedwabnymi na ECA. Może dojść do uwolnienia niewielkiej ilości pozostałej krwi, jednak obfite krwawienie prawdopodobnie wskazuje na nieprawidłowe założenie klipsów mikronaczyniowych.

W takim przypadku należy upewnić się, że w szczękach klipsa nie zakleszczyła się żadna tkanka podścielająca, co mogłoby uniemożliwić pełne zamknięcie. Kolejnym krokiem jest wprowadzenie do ECA trzydziestocentymetrowego odcinka monofilamentowej nici nylonowej. Pomocne będzie zaznaczenie nici w odległości 2 cm od jej silikonowanej końcówki.

Szycie to jest dostępne w handlu, a średnica końcówki oraz długość powłoki silikonowej mogą zostać dostosowane do określonych wymagań, w zależności od wieku i masy szczurów wykorzystywanych w badaniu. W przypadku szczurów o masie 300 g stosujemy końcówkę o średnicy 0,39 mm oraz powłokę silikonową o długości od dwóch do trzech mm na nici nylonowej 4-0. Wprowadź zamykającą nić nylonową do światła tętnicy szyjnej zewnętrznej (ECA), kierując ją w stronę tętnicy szyjnej wspólnej.

Zaciśnij jedwabną szsuturę wokół kikutu ECA, aby zabezpieczyć wewnątrznaczyniową szuturę nylonową i zapobiec krwawieniu. Odetnij pozostałą część ECA, aby uwolnić kikut, a następnie ustaw kikut ECA poniżej punktu rozwidlenia tak, aby znajdował się mniej więcej w jednej linii z ICA. Ułatwi to wsunięcie szutury wewnątrznaczyniowej do tętnicy szyjnej wewnętrznej.

Usuń klips mikronaczyniowy z ICA. Pamiętaj, aby otwierać klipsy powoli, by sprawdzić, czy nie występuje krwawienie przed ich całkowitym usunięciem. Kontynuuj wprowadzanie szwu nylonowego w świetle ICA, aż dotrze on do tętnicy środkowej mózgu.

Długość ta wynosi zazwyczaj około dwóch centymetrów, co jest powodem naniesienia znacznika na szew przed wprowadzeniem. Po wprowadzeniu zmiennej długości szwu nylonowego może pojawić się opór; jeśli wystąpi on w momencie, gdy znaczna część szwu nylonowego wciąż znajduje się poza naczyniem, prawdopodobnie oznacza to, że szew wchodzi w tętnicę podniebienną. W takim przypadku należy wycofać szew i lekko go wygiąć, aby kontynuować prowadzenie wzdłuż ICA, która będzie przebiegać bardziej bezpośrednio.

Zwróć uwagę na zmianę położenia szwu wewnątrz światła ICA na tych dwóch ujęciach porównawczych. Kontynuuj wprowadzanie szwu przez ICA, aż większość szwów zostanie wprowadzona i w tym miejscu ponownie poczujesz opór. Szew wewnątrzświatłowy zablokował ujście MCA.

Uruchom stoper i zarejestruj moment zamknięcia naczynia. Odnotuj czas rozpoczęcia. Usuń drugi klips mikronaczyniowy z CCA, a następnie szybko i ostrożnie zamknij nacięcie.

Umieść szczura w klatce regeneracyjnej. Krótko przed planowanym zakończeniem okresu okluzji sprawdź, czy podłoże klatki w okolicy nosa i pyska jest wolne od materiałów ścielących, następnie znieczul szczura i otwórz nacięcie, usuwając szwy zamykające. Umieść mikroklips na CCA w taki sam sposób jak wcześniej.

Wycofaj szew zamykający częściowo z ICA, aż koniec szwu stanie się widoczny przez ICA. Nie usuwaj jeszcze całkowicie szwu. Następnie umieść kolejny mikroklips na ICA powyżej miejsca znajdującego się szwu wewnątrzświatłowego, całkowicie usuń szew zamykający i podwiąż kikut ECA.

Zapisz czas rozpoczęcia reperfuzji. Usuń mikroklipsy z ICA i CCA, nawilżając ten obszar kilkoma kroplami sterylnej soli fizjologicznej, a następnie zamknij nacięcie szwem. W celu zapewnienia dodatniego przeciwbólowego działania pooperacyjnego wstrzykujemy buprenorfinę w dawce 0,05 mg/kg masy ciała.

Podajemy również 5 ml soli fizjologicznej do jam brzusznych w celu zapewnienia nawodnienia w fazie rekonwalescencji. Po wybudzeniu szczura z narkozy testuje się behawioralne oznaki zawału, trzymając szczura za ogon i obserwując, czy jest on w stanie obrócić się na obie strony w tym teście huśtawki w pozycji uniesionej; oczekuje się, że szczur będzie zwijał się tylko w jedną stronę. Szczury wykazujące objawy udaru mogą również poruszać się po okręgu w jedną stronę podczas aktywności w otwartym polu.

Przedstawiamy tutaj wyniki 60-minutowej okluzji MCA u szczurów z nadciśnieniem samoistnym. Obrazowanie rezonansem magnetycznym wykonano 24 godziny po MCAO i pokazano dwa obrazy ważone. U tego szczura rozwinął się rozległy zawał obejmujący zarówno obszary korowe, jak i podkorowe.

Obszar hiperintensywny w badaniu MRI został zaznaczony na żółto, choć nie przedstawiamy tutaj wyników. Obszary zawału uwidocznione w MRI mogą zostać poddane dalszej analizie z wykorzystaniem obrazowania dyfuzyjnego oraz map pozornego współczynnika dyfuzji. Obszary zawału są również potwierdzane poprzez barwienie histologiczne świeżo wyizolowanych przekrojów mózgu chlorkiem 2,3,5-trifenyltetrazoliem lub TTC; dehydrogenaza w żywej tkance przekształca substrat w nierozpuszczalny czerwony barwnik.

W ten sposób obszary zawałowe pozostają niezabarwione i wydają się białe. Należy zauważyć, że wielkość zawału może być uwarunkowana kilkoma czynnikami, w tym szczepem szczura i rozmiarem zwierzęcia. Stosujemy szczury z nadciśnieniem samoistnym, ponieważ wykazują one bardziej spójną wielkość zawałów niż inne powszechnie stosowane szczepy, takie jak szczury frogg, dolly czy wistar.

Ważne jest również ustandaryzowanie docelowej masy szczura, aby ograniczyć zmienność średnicy naczyń, a tym samym poprawić skuteczność okluzji MCAA. Mamy nadzieję, że ten film okaże się pomocny w przeprowadzeniu techniki okluzji MCA we własnym laboratorium. Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w eksperymentach.