Błyskawiczne zamrażanie i kriosekcja mózgu myszy E12.5

Cześć, nazywam się Spencer Curley z University of California Irvine i Ed Maki's Lab i zamierzam zademonstrować, jak przeprowadzić kriosekcję. Aby to zrobić, najpierw używam tych powszechnie używanych odczynników. Używany przeze mnie środek do zatapiania lub media do zatapiania nazywa się OCT dla optymalnej temperatury cięcia.

Jest to klarowny roztwór, jest bardzo gęsty i lepki, i ładnie trzyma tkankę, gdy można ją zorientować, a następnie zamarza, a ostatecznie jest rozpuszczalny w wodzie, dzięki czemu można się go pozbyć podczas każdego rodzaju procedury barwienia. Osadzam więc tkankę w formie. Te pojemniki do biopsji krioformy są dostępne w różnych rozmiarach.

Będę używał tutaj tej mniejszej formy, ponieważ robię tkankę embrionalną z myszy. Błyskawicznie zamrażamy nasze tkanki i ciekły azot. Więc najpierw napełnię tę ochronną termos ciekłym azotem z naszego zbiornika.

Przed błyskawicznym zamrożeniem tkanki należy ją tak nazwać krioochroną, w przeciwnym razie samo zamrożenie zniszczy tkankę. Więc to, co robisz, to zatapiasz tkankę w 30% roztworze sacharozy na noc. A jeśli trwa to dłużej, to w porządku, tak długo, jak długo tkanka tonie.

I jak widać, głowy myszy w wieku 12,5 dnia są zanurzone w roztworze sacharozy, więc są gotowe do zamrożenia. Więc teraz po prostu przeleję tkankę znajdującą się w roztworze sacharozy do większego naczynia, dzięki czemu będę mógł manipulować tkanką. Wezmę trochę tego OCT i wleję go do tego 35-milimetrowego naczynia, które faktycznie spoczywa na pokrywce, żebym mógł go ustawić pod kątem.

Tak więc OCT gromadzi się wzdłuż krawędzi, aby uzyskać głębokość. Więc używam pary starszych, kleszczy po prostu dlatego, że nie potrzebujesz, aby były ostre i nie chcesz zrujnować kolejnej pary kleszczy. Więc ja, biorę je i bardzo delikatnie podnoszę jedną z tych główek i wkładam ją do tej pierwszej kąpieli OCT.

Chcę tylko pokryć zarodek w OCT. Pozwala to na lepsze, bardziej równomierne zamrożenie tkanki. Nie chcesz żadnych pozostałości sacharozy wokół tkanki ani żadnych pęcherzyków powietrza.

Zdecydowanie unikaj pęcherzyków powietrza. Więc po prostu delikatnie mieszam OCT wokół i pod głową, przesuwając głowicę przez OCT i pozwalam jej tam siedzieć przez kilka sekund, podczas gdy napełniam moją krioformę. Więc teraz zamierzam wypełnić formę kriogeniczną za pomocą OCT, ponownie, unikając pęcherzyków.

A ja po prostu wypełnię go aż do samej góry formy. I jak zapewne zauważycie, oznaczyłem to jako pleśń. Więc zrobię to, będę mógł zobaczyć swoją orientację po zamrożeniu.

Kiedy OCT zamarza, zmienia kolor na biały i nie widać już swojej tkanki. Więc na pewno chcesz oznaczyć markerem permanentnym. Forma kriogeniczna.

Właściwie dostałem bańkę w październiku, więc zamierzam użyć kleszczy, aby po prostu wypchnąć ją przez krawędź. Nie chcesz, żeby to przeszkadzało w twoim, w zamrażaniu twoich tkanek. Więc teraz zamierzam przenieść głowę z tego naczynia do OCT, który jest w mojej formie.

Po prostu wyjmę go z naczynia i bardzo delikatnie włożę do formy. Następnie idę do mikroskopu, gdzie ustawię tkankę. Mam tutaj tkankę w mojej krioformie i zamierzam spojrzeć przez lunetę, aby móc ją zorientować.

Będę robił przekroje koronalne przez tę głowę myszy. Muszę więc ustawić go tak, aby móc ustawić go w kriostacie dla sekcji koronalnych. Więc znowu używam tych starych, kleszczy i jak widać, jest tu trochę bąbelków i postaram się jak najlepiej je usunąć.

Ale te mniejsze bąbelki nie są, nie są złe. Nic nie zauważyłem z tymi mniejszymi bąbelkami. Po prostu nie chcesz dużych bąbelków.

Więc po prostu zamierzam je wysunąć najlepiej, jak potrafię i zdecydowanie często wycierać kleszcze, ponieważ w ten sposób lepiej unikasz bąbelków. A teraz, jeśli widzicie moje etykiety, mam literę t tutaj na górze i F po lewej stronie. To tylko wskazuje mi, że głowa, czubek głowy będzie podniesiony, a przód lub twarz będzie po mojej lewej stronie.

W ten sposób wiem, przez którą powierzchnię należy przeciąć w przypadku odcinków koronalnych i po prostu szturcham tkankę. I znowu, czasami wprowadza to bąbelki i po prostu chcesz je wypchnąć, aby nie zamarzły wraz z tkanką. Tak więc źle jest mieć bąbelki, głównie dlatego, że podczas zamrażania bąbelki w tkankach mogą powodować niespójne zamrażanie.

Celem błyskawicznego zamrażania jest zamrożenie wszystkiego na raz. Ponadto, kiedy przecinasz tkankę i kriostat, jeśli ostrze przejdzie przez pęcherzyk, a nie OCT lub tkankę, może to spowodować zaczepienie lub rozdarcie i zniszczyć lub złamać tkankę. Więc na pewno chcesz tego uniknąć, ponieważ te bąbelki za wszelką cenę.

Zwłaszcza te większe. Więc nadal orientuję to tutaj. Ta tkanka została utrwalona na 24 godziny, więc jest dość odporna na moje manipulacje.

Inne tkanki mogą być nieco bardziej miękkie, więc po prostu chcesz być bardzo delikatny. Więc kiedy już umieszczę go pod lunetą z twarzą w lewo i czubkiem głowy do góry, będę musiał upewnić się, że jest poprawny również w innych płaszczyznach orientacji. Zamierzam więc podnieść i przejrzeć wszystkie ściany sześcianu, aby upewnić się, że jest właściwy.

I widzę, że jest lekko pochylony w dół, więc muszę po prostu podnieść kleszczemi. Porządku? A to zdecydowanie wymaga dużo praktyki. Okej, wygląda dobrze.

Teraz przejdę się tutaj i zamrozię to w ciekłym azocie. Okej, teraz, gdy tkanka jest prawidłowo zorientowana w formie kriogenicznej, wleję mój ciekły azot do tego naczynia. To jest po prostu zwykła plastikowa szalka Petriego do hodowli tkankowej tylko do góry.

Dość szybko paruje. Wezmę kleszcze i opuszczę formę kriogeniczną. I jak widzicie, faktycznie zgiąłem dolną wargę.

To zdecydowanie pozwala na lepsze, lepsze prowadzenie. Zamierzam to zamrozić. A gdy tkanka i OCT zamarzają, zmienia kolor na jednolity biały.

A kiedy będzie gotowy, wszystko będzie białe. A potem muszę szybko umieścić zamrożoną tkankę w zamrażarce minus 80 do przechowywania. Chcesz trzymać go tak, aby tkanka nie została zanurzona.

Musisz więc być bardzo ostrożny, aby utrzymać go na górnej powierzchni ciekłego azotu. Okej, teraz jest zamrożony. Przytrzymaj go tam przez kilka dodatkowych sekund, zanim przejdę do minus 80.

Dobra, teraz zamierzam podnieść to do minus 80. Więc wziąłem moją tkankę z minus 80 i umieściłem ją w tym kriostatu tutaj. W komorze temperatura spadła do minus 24 stopni Celsjusza.

W tej chwili musisz pozwolić tkance zrównoważyć się przez około pół godziny do godziny, zanim będziesz mógł rozpocząć cięcie. W przeciwnym razie jest zbyt kruchy. Tak więc, chociaż wszystkie statystyki kriosów są różne, zamierzam tylko zwrócić uwagę na kilka podstawowych rzeczy na temat tej maszyny.

Używamy więc Leica CM 30 50 s. Jest to dobra maszyna, ponieważ ma oddzielną jednostkę chłodzącą dla samej próbki, co jest miłą dodatkową korzyścią. Możesz ustawić temperaturę próbki, a różne tkanki wymagają różnych temperatur do cięcia.

Więc kiedy po raz pierwszy ładujesz tkankę, musisz dokonać kilku korekt. Są one podobne we wszystkich statystykach kriogenicznych. To jest elektronika, część z nich jest obsługiwana ręcznie.

Na przykład będziesz musiał schować ramię kriostatu lub przesunąć je, aby ustawić je dalej lub bliżej ostrza. Możesz to zrobić szybko lub wolno. Możesz ustawić grubość cięcia za pomocą, z tym plusem lub minusem tutaj.

I będziesz wybierać między przycinaniem a grubością sekcji, która jest wskazana na środkowym przycisku tutaj. Ustawisz temperaturę komory lub samej próbki obok tego cyfrowego wyświetlacza, po prostu naciskając go i używając tych strzałek w górę lub w dół, aby dostosować temperaturę. Tak więc dla nas, kiedy wykonujemy kriosekcję, używamy tych szkiełek do ryb marki Super frosts plus szkiełka mikroskopowe.

Są one pokryte klejem, dzięki czemu tkanka podczas przetwarzania nie odpada. Czasami podczas cięcia zauważysz, że tkanka wydaje się nieco miękka, a niektóre oznaki tego będą takie, że uderzy w ostrze i zbije się. A to, czego możesz użyć, aby to naprawić, to super przyjazne zamrażanie marki Fisher.

To, to, to błyskawiczne zamrażanie tkanki i po prostu celujesz nią w tkankę i naciskasz spust, a szybko ponownie zamrozi tkankę, jeśli jest zbyt miękka. Zanim zamontujesz chusteczkę na uchwycie w celu cięcia, chciałbym zabrać Cię na krótką wycieczkę po niektórych rzeczach w maszynie. Więc to jest miejsce, w którym faktycznie ładujesz ostrze, które jest zabezpieczone tą metalową płytką.

Pociągając to ramię do góry, możesz w razie potrzeby zdjąć i wymienić ostrze. Upewnij się, że jest ładny i bezpieczny. Nie chcesz nadmiernie zabezpieczać ostrza, w przeciwnym razie zostanie ono wypaczone.

I zauważysz w swoim przekroju, że grubość tkanki nie jest, nie jest spójna. Więc chcesz, nie chcesz pchać tego ramienia do samego dołu. Chcesz po prostu dostać się tam, gdzie jest, nawet za pomocą samego ostrza.

To jest kolejna rzecz, którą być może będziesz musiał dostosować podczas sekcji. Nazywa się to płytą przeciwprzechyłową. To jest kawałek szkła, który pasuje do tego uchwytu tutaj i możesz go wyregulować za pomocą tej sprężynowej tutaj.

I w zasadzie przesuwasz go do przodu lub do tyłu. A to sprawi, że tkanka lub sekcje będą płaskie, dzięki czemu będzie można je zamontować na szkiełku. Kolejną rzeczą, którą możesz chcieć dostosować podczas cięcia, jest miejsce na ostrzu, które wykonuje właściwe cięcie.

Więc jak to wyregulować, to po prostu podnieś tę dźwignię i możesz przesunąć całe to ustrojstwo w lewo lub w prawo. I używasz tego tylko wtedy, gdy zauważysz, że twoja tkanka zaczepia się o określoną część ostrza lub chcesz oszczędzać ostrza, ponieważ są one dość drogie. Możesz więc znaleźć ładny, czysty obszar, po prostu przesuwając go do przodu iz powrotem.

Kolejną rzeczą, którą możesz dostosować, jest kąt cięcia. Teraz po tej stronie, której nie będziesz w stanie zobaczyć, są trzy różne pozycje. Po prostu używamy środkowej pozycji, a ty dostosowujesz ją, podnosząc tę drugą dźwignię.

I, i to może, możesz sprawić, że to ustrojstwo porusza się w górę iw dół. Zawsze trzymamy go pośrodku. Na tym poprzestanę.

A więc to z tyłu to jest głowica kriostatu. W rzeczywistości utrzyma zamrożoną próbkę tkanki podczas jej cięcia. Kołysze się w górę iw dół i przesuwa się w kierunku ostrza.

Zasadniczo, montujesz chusteczkę na tym uchwycie, a my umieszczamy ją w głowicy, dokręcamy ją, a następnie używamy tych pokręteł z tyłu, aby dostosować kąt, aby cięcie było prostsze. Więc teraz zamierzam zamontować chusteczkę na uchwycie. Chcesz utrzymać uchwyty w temperaturze pokojowej, ponieważ najpierw dodasz warstwę OCT i nie chcesz, aby natychmiast zamarła, ponieważ chcesz, aby była to ładna płaska warstwa.

Użyjemy tego ustrojstwa do czegoś, co nazywa się ekstraktorem ciepła. Właściwie będzie używany do spłaszczania OCT, gdy zamarza. Więc to, co najpierw robię, to sprawdzam temperaturę w pomieszczeniu i umieszczam ją w tym uchwycie tutaj.

Weź trochę moich bąbelków OCT. Nie ma to tutaj znaczenia, bo zostaną wyciśnięci. Po prostu dodaj trochę, nie potrzebujesz wiele.

Weź wyciąg ciepła i po prostu umieść go tam na dole. Poczekaj kilka sekund. A potem widać, że OCT jest ładny i płaski.

Więc teraz mam swoją tkankę i muszę zaznaczyć rzeczywisty OCT. Okej, więc zaznaczę punkt na OCT, aby wskazać jego pozycję. Właśnie zaznaczyłem górę niebieską kropką.

Więc teraz wyjmę blok tkanki z formy i robię to, po prostu naciskając na jego tył. Więc zamierzam delikatnie popchnąć plecy i po prostu wepchnąć je do dłoni, ale znowu nie chcę, żeby się rozmroziło. Więc włożyłem go z powrotem.

Więc teraz możecie zobaczyć blok tkanki z niebieskim znakiem, który na nim umieściłem. Wiem, że to jest czubek głowy zarodka. Chcę przeciąć twarz, ponieważ to są przekroje koronalne.

Więc teraz to co zrobię, to dodam kolejną kroplę dużej kropli OCTA i muszę teraz działać szybko, ponieważ wszystko jest zimne. Wezmę moją chusteczkę i umieszczę ją na samym środku, upewniając się, że przylega płasko do już przygotowanego łóżka OCT. Teraz po prostu pozwolę temu zamarznąć i zajmie to około minuty lub dwóch.

Więc teraz skończyło się zamrażanie. Zamierzam wziąć chusteczkę, która jest zamontowana na uchwycie, umieścić ją w głowicy, ustawić ją tak prosto, jak tylko mogę, a następnie zacisnąć. Może, jest ładnie i ciasno.

Zamierzam umieścić go tuż przed ostrzem, a następnie przesunąć go, co może zająć kilka sekund. Dobra, teraz zamierzam użyć płaskiej krawędzi ostrza, aby naprawdę dobrze ułożyć tkankę. Więc po prostu, po prostu, patrzę, patrzę na krawędź i kołyszę tkanką w górę i w dół, aby upewnić się, że krawędzie się wyrównają.

Gdyby tego nie zrobili, wiesz, że mogłoby to wyglądać mniej więcej tak. Oczywiście przesadzam, ale widać tutaj, że to nie jest prosto w dół, ostrze. Więc po prostu wprowadzam poprawki, aż poczuję, że jest tak proste, jak tylko mogę.

Myślę, że to całkiem nieźle. Więc patrzę z każdej strony, aby upewnić się, że tkanka będzie ciąć prosto na ostrze i używam krawędzi ostrza, aby to wskazać. Więc patrzę w górę i patrzę z boku, a tkanka wygląda całkiem nieźle.

Nie muszę dokonywać wielu regulacji, ale gdybym to zrobił, po prostu użyłbym pokręteł, które są z tyłu głowy. Obracając je w lewo lub w prawo, możesz zobaczyć, że możesz w ten sposób dokonać precyzyjnych korekt. Ale wygląda całkiem nieźle.

Teraz, jestem, właściwie się naprzód z tkanką. Jest, jeszcze nie tnie, ponieważ nie jest przeciwko ostrzu. Tkanka jest osadzona w głębi OCT.

Tak więc dotarcie do tkanki może zająć kilka minut. Nie chcesz jechać zbyt szybko, ponieważ może to złapać i złamać OCT i twoją tkankę, ale nie chcesz też jechać zbyt wolno, ponieważ może to trwać wieczność. W tej maszynie jest jedna fajna funkcja, dzięki której możesz wykonać przycinanie w grubszym odcinku, co pozwoli Ci jechać szybciej.

Więc teraz właściwie, przecinam się przez OCT, więc trochę zwalniam. Tak więc nadal nie dotarłem do tkanki, ale to jest czas, w którym oceniam, jak będzie przebiegał sekcjon. Wiele zmiennych może, może spowodować, że cięcie tkanek pójdzie naprawdę dobrze lub naprawdę źle.

To, co zdarza się najczęściej w przypadku tego kriostatu, to to, że tkanka jest w rzeczywistości trochę za zimna. Obniżyłem temperaturę, ale nadal wydaje mi się, że jest trochę za zimno. I co się dzieje, to to, że ostrze będzie drgać przez, przez tkankę lub i przez OCT.

Więc dostaniesz te małe linie, te poziome linie przez, przez OCT. To, co robię, to biorę kciuk i po prostu rozgrzewam krawędź, rozgrzewam OCT, delikatnie go dotykając, przesuwając kciukiem, nie na długo. A potem, kiedy to przejrzałem, zauważyłem, że wychodzą o wiele lepiej i paplanina ustała.

To są rzeczy, które ocenię, zanim dotrę do tkanki. Zauważyłem więc, że gdy ostrze przechodzi przez tkankę, pojawia się zaczep lub, lub pęknięcie, faktycznie w OCT. Więc jedną z rzeczy, które robię najpierw, jest wymiana ostrza.

Nie jestem pewien, jak długo to ostrze jest tutaj na miejscu i kto go używał przede mną, więc po prostu pójdę dalej i wyjmę nowe ostrze. Są one oczywiście bardzo ostre, więc musisz być ostrożny. Więc zamierzam wyregulować płytkę przeciwprzechyłową, a na dole znajduje się śruba sprężynowa, pod którą wystarczy sięgnąć i można ją wsunąć lub wysunąć.

Więc posunąłem się naprzód i zrobiłem sekcję na tyle, że teraz jestem w tkance. I niestety jest pęknięcie w bloku OCT, co zdarza się często i niestety nie możesz tego kontrolować, ale są rzeczy, które możesz zrobić, aby to naprawić. Jeśli pęknięcie przeszło przez tkankę, musisz wyrzucić próbkę lub spróbować uratować to, co możesz.

W tym przypadku pęknięcie wydaje się znajdować nad tkanką. Więc to co zamierzam zrobić, to wziąć żyletkę, która była w kriostacie. Jest schłodzony.

Postaram się po prostu przyciąć pękniętą część, która znajduje się na górze bloku OCT. Więc znowu, zrobię to, użyję kciuka, aby podgrzać powierzchnię bloku OCT. A potem zamierzam przejść przez sekcje i jeśli widzicie to tutaj, jest pęknięte.

Więc tam zdjąłem kawałek z chusteczką, a potem resztę oct OCT, którą po prostu zrzuciłem, to była pęknięta część. Więc to, co zamierzam zrobić, to spróbuję przyciąć tę pękniętą część za pomocą schłodzonej żyletki. Muszę wchodzić bardzo prosto i muszę używać obu rąk i równomiernie naciskać na ostrze.

Zamierzam kołysać ostrzem w przód i w tył w kierunku OCT. Więc kołyszę się w przód iw tył, powoli wcinając się w OCT. Mam nadzieję, że usuwam pękniętą część.

Dobra, ograniczę usuwanie tego nadmiaru OCT. Okej, wygląda dobrze. Następnie zamierzam lekko cofnąć głowę, ponieważ stworzyłem krawędzie, które mogą zaczepić się o ostrze, a jeśli tak się stanie, może to faktycznie zerwać OCT i tkankę, co zrujnuje moją próbkę.

Więc się wycofałem, więc będę musiał trochę bardziej posunąć się do przodu, aby wrócić do tkanki i mam nadzieję, że poprawiłem pęknięcie. Dobra, teraz wracam do tkanki. Okej, wygląda na to, że ja to poprawiłem.

Nie ma już żadnych pęknięć w OCT, które znacznie ułatwiłyby uchwycenie sekcji. Więc teraz przejdę do tej części tkanki, która mnie interesuje. W tej chwili wychodzę na powierzchnię i chciałbym dostać się do mózgu tego embrionu.

Są one na tyle duże, że mogę zobaczyć struktury, które mnie interesują. Nie wspomniałem, że używam tych szczotek do czyszczenia ostrza między każdą sekcją, którą zamierzam schwytać. Ten duży służy tylko do czyszczenia obszaru i usuwania nadmiaru ooc OCT.

Używam również tych drobniejszych pędzli do manipulowania sekcją względem tej zimnej płyty tutaj, aby ustawić ją, gdy uwieczniam ją na sekcji. Ponownie, są one utrzymywane w niskiej temperaturze, dzięki czemu OCT nie topi się i nie przykleja do szczotek. Tak więc, aby uchwycić tkankę, najpierw podgrzeję OCT i tkankę kciukiem.

Wezmę jeden z tych slajdów, które już oznaczyłem. Trzymam to do góry nogami i każdy robi to inaczej. Ale sposób, w jaki to robię, polega na tym, że lubię trzymać ten prawy górny róg, gdy suwak jest skierowany w dół prawą ręką.

A następnie użyj lewego kciuka jako punktu obrotu, aby móc pójść prosto w dół na talerzu i uchwycić sekcję. OCT i tkanka faktycznie stopią się ze szkiełkiem i same się zamontują. Więc najpierw rozgrzeję chusteczkę kciukiem, powoli ją przetnij, złapię szkiełko, przytrzymam prawy róg prawą ręką, przesunę płytkę, opuszczę ją prosto w dół, pozwól jej się stopić.

Przyjrzę się chusteczce, aby upewnić się, że nie ma fałd ani pęcherzyków i czy wygląda dobrze. I będę to robił tak długo, aż przejdę przez cały mózg. Patrzę teraz na sekcje przez lunetę preparacyjną, aby upewnić się, że wyglądają dobrze i rzeczywiście wyglądają, można zobaczyć przodomózgowie na górze sekcji i wszystkie wyglądają bardzo ładnie.

Możesz użyć tych sekcji kriogenicznych do takich rzeczy, jak hybrydyzacja in situ. Czasami robimy podstawową histologię, barwienie h i e. Można również wykonać immunofluorescencję i wiele podobnych testów.

W szczególności dla mnie te sekcje zostały naprawione i przetworzone pod kątem hybrydyzacji in situ. Więc to jest to, co będę robił dalej.