Szybkie mrożenie i kriosekcjonowanie mózgu myszy w stadium E12.5

Witam, nazywam się Spencer Curley z University of California Irvine i laboratorium Eda Makiego. Zaprezentuję, jak przeprowadzić kriosekcjonowanie. W tym celu wykorzystam najpierw następujące, powszechnie stosowane odczynniki. Zastosowany przeze mnie środek do zatapiania, czyli medium do zatapiania, to OCT (optimal cutting temperature).

Jest to przejrzysty roztwór, bardzo gęsty i lepki, który dobrze utrzymuje tkankę, umożliwiając jej odpowiednie zorientowanie przed zamrożeniem; ponadto jest on rozpuszczalny w wodzie, co pozwala na jego usunięcie podczas dowolnej procedury barwienia. Tkankę zatapiam w formie. Te krioformy do biopsji są dostępne w różnych rozmiarach.

Będę używać tej mniejszej formy, ponieważ pracuję z tkanką embrionalną myszy. Naszą tkankę mrozimy gwałtownie w ciekłym azocie. Najpierw napełnię tę ochronną kolbę próżniową ciekłym azotem z naszego zbiornika.

Przed błyskawicznym zamrażaniem tkanki należy przeprowadzić tzw. krioprotekcję, w przeciwnym razie sam proces zamrażania zniszczy tkankę. W tym celu tkankę zanurza się w 30% roztworze sacharozy na noc. Jeśli proces ten potrwa dłużej, nie stanowi to problemu, o ile tkanka całkowicie opadnie na dno.

Jak widać, głowy myszy z 12,5 dnia embrionalnego zatunął w roztworze sacharozy, zatem są gotowe do zamrożenia. Teraz po prostu przeleję tkankę znajdującą się w roztworze sacharozy do większejy szalki, aby móc nią manipulować. Pobiorę trochę OCT i wleję go do tej 35-milimetrowej szalki, która spoczywa na pokrywce, tak aby utrzymać ją pod kątem.

W związku z tym OCT gromadzi się wzdłuż krawędzi, tworząc głębszą warstwę. Używam pary starszych, stępionych pincet, ponieważ nie muszą być one ostre, a nie chcę zniszczyć kolejnej pary pincet. Chwytam je i bardzo delikatnie wyjmuję jedną z tych główek, a następnie umieszczam ją w pierwszej kąpieli z OCT.

Chcę jedynie powlec zarodek OCT. Pozwala to na lepsze i bardziej jednorodne zamrażanie tkanki. Należy upewnić się, że wokół tkanki nie pozostały żadne resztki sacharozy ani pęcherzyki powietrza.

Należy zdecydowanie unikać pęcherzyków powietrza. Delikatnie mieszam OCT wokół i pod głową, przesuwając głowę wewnątrz OCT i pozostawiając ją tam na kilka sekund podczas napełniania formy do mrożenia. Teraz napełnię formę do mrożenia OCT, ponownie unikając pęcherzyków.

Wypełnię go teraz aż po samą górę formy. Zauważą Państwo, że oznakowałem formę, dzięki czemu będę mógł określić orientację próbki po zamrożeniu.

Gdy OCT zamarza, staje się biały i nie widać już tkanki. Dlatego zdecydowanie warto opisać markerem permanentnym formę do krioembeddingu.

W rzeczywistości w OCT pojawił się pęcherzyk powietrza, więc użyję pęsety, aby wypchnąć go poza krawędź. Nie można dopuścić, aby zakłócało to zamrażanie tkanki. Teraz przeniosę głowę z tej szalki do OCT znajdującego się w formie.

Po prostu wyjmę tkankę z naczynia i bardzo delikatnie umieszczę ją w formie. Następnie przejdę do mikroskopu, aby zorientować tkankę. Mam tutaj tkankę w formie do mrożenia i będę oglądać ją przez mikroskop, aby móc ją odpowiednio zorientować.

Wykonam przekroje wieńcowe głowy myszy. Muszę ją zatem zorientować tak, aby móc umieścić ją w kriosztacie do wykonania cięć w płaszczyźnie wieńcowej. Ponownie używam tych stępionych pęset i, jak widać, pojawiły się tutaj pęcherzyki powietrza, które postaram się jak najlepiej usunąć.

Jednak te mniejsze pęcherzyki nie są szkodliwe. Nie zauważyłem żadnych problemów w przypadku tych mniejszych pęcherzyków. Należy jedynie unikać dużych pęcherzyków.

Więc po prostu wysunę je najlepiej jak potrafię i będę często wycierać pęsetę, ponieważ w ten sposób można lepiej uniknąć pęcherzyków powietrza. Jeśli teraz spojrzycie na moje oznaczenia, na górze mam literę T, a po lewej stronie literę F. Wskazuje mi to, że góra głowy będzie skierowana w górę, a przód lub twarz będzie znajdować się po mojej lewej stronie.

W ten sposób wiem, którą powierzchnię przeciąć w celu wykonania przekrojów wieńcowych, i jedynie delikatnie przesuwam tkankę. Ponownie, czasami wprowadza to pęcherzyki powietrza, które należy wypchnąć, aby nie zamarzły wraz z tkanką. Obecność pęcherzyków jest niewskazana, głównie dlatego, że podczas mrożenia mogą one powodować niejednorodne zamrażanie tkanki.

Celem szybkiego mrożenia jest jednoczesne zamrożenie całej próbki. Ponadto, podczas przecinania tkanki w kriosztacie, jeśli ostrze trafi na pęcherzyk powietrza zamiast na OCT lub tkankę, może to spowodować szarpnięcie lub rozdarcia, co doprowadzi do zniszczenia lub uszkodzenia tkanki. Dlatego należy za wszelką cenę unikać powstawania takich pęcherzyków.

Zwłaszcza te większe. Dlatego wciąż je tutaj orientuję. Tkanka ta była utrwalana przez 24 godziny, więc jest dość odporna na moje manipulacje.

Inne tkanki mogą być nieco bardziej miękkie, dlatego należy zachować szczególną ostrożność. Gdy ustawię próbkę pod mikroskopem tak, aby twarz była skierowana w lewo, a góra głowy była u góry, muszę upewnić się, że jest ona prawidłowo zorientowana również w pozostałych płaszczyznach. Dlatego podniosę kostkę i obejrzę wszystkie jej ściany, aby upewnić się, że jest ustawiona właściwie.

Widzę, że jest lekko nachylone w dół, więc muszę je po prostu unieść pęsetą. Dobrze? To zdecydowanie wymaga dużo ćwiczeń. Dobrze, wygląda to dobrze.

Teraz przejdę tutaj i zamrożę próbkę w ciekłym azocie. Dobrze, teraz gdy tkanka jest odpowiednio zorientowana w formie do kriosekcji, wleję ciekły azot do tej szalki. Jest to zwykła plastikowa szalka Petriego do hodowli tkanek, wypełniam ją po samą górę.

Paruje to dość szybko. Użyję pęsety i opuszczę formę kriogeniczną. Jak widać, wygiąłem dolną krawędź.

To zdecydowanie pozwala na lepszą obsługę. Zamrożę to. W miarę jak tkanka i OCT zamarzają, przybierają one stały biały kolor.

Po zakończeniu procesu całość stanie się biała. Następnie muszę szybko umieścić zamrożoną tkankę w zamrażarce -80°C w celu przechowywania. Należy trzymać próbkę w taki sposób, aby tkanka nie została całkowicie zanurzona.

Należy zatem zachować szczególną ostrożność, aby utrzymać próbkę jedynie na powierzchni ciekłego azotu. Dobrze, teraz jest zamrożona. Przytrzymam ją tam jeszcze przez kilka sekund, zanim przeniosę ją do zamrażarki -80°C.

Dobrze, teraz przeniosę to do zamrażarki -80°C. Wyjęłam tkankę z temperatury -80°C i umieściłam ją w tym kriotomacie. Komora jest obecnie schłodzona do -24°C.

W tej chwili należy pozwolić tkance na equilibrację przez około pół godziny do godziny, zanim będzie można rozpocząć krojenie. W przeciwnym razie będzie ona zbyt krucha. Ponieważ wszystkie kriostaty różnią się od siebie, wskażę jedynie kilka podstawowych elementów tej konkretnej maszyny.

Używamy urządzenia Leica CM 30 50 s. Jest to dobra maszyna, ponieważ posiada oddzielną jednostkę chłodzącą dla samego preparatu, co stanowi istotną zaletę. Można ustawić temperaturę preparatu, a różne tkanki wymagają różnych temperatur podczas cięcia.

Po pierwszym załadowaniu tkanki należy wprowadzić kilka korekt. Są one podobne w przypadku wszystkich kriostatów; niektóre z nich są sterowane elektronicznie, inne ręcznie.

Na przykład, będziesz musiał cofnąć ramię kriotomatu lub wysunąć je, aby umieścić próbkę dalej lub bliżej noża. Możesz to zrobić szybko lub powoli. Grubość cięcia możesz ustawić za pomocą tego przycisku plus lub minus.

Następnie wybierają Państwo między grubością przycinania a grubością przekroju, co jest wskazane na środkowym przycisku. Temperaturę komory lub samego preparatu ustawiają Państwo obok tego wyświetlacza cyfrowego, po prostu naciskając ten przycisk i używając strzałek w górę lub w dół w celu regulacji temperatury. W naszym przypadku, podczas wykonywania kriosekcji, używamy szkiełek przedmiotowych marki Fisher Super Frost Plus.

Są one pokryte specjalnym klejem, aby tkanka nie oddzieliła się podczas procesowania. Czasami podczas skrawania można zauważyć, że tkanka wydaje się nieco zbyt miękka, czego objawem jest jej marszczenie się w momencie kontaktu z nożem. Aby rozwiązać ten problem, można zastosować produkt Fisher Super Friendly Freeze.

Urządzenie to błyskawicznie zamraża tkankę; wystarczy nakierować je na preparat i nacisnąć spust, aby szybko zamrozić tkankę, jeśli jest ona zbyt miękka. Przed zamocowaniem tkanki na uchwycie do sekcjonowania, chciałbym przeprowadzić krótki przegląd niektórych elementów tego urządzenia. Tutaj właśnie ładuje się ostrze, które jest zabezpieczone tą metalową płytką.

Podnosząc to ramię, można wyciągnąć i wymienić ostrze w razie potrzeby. Należy upewnić się, że jest ono dobrze zamocowane. Nie należy jednak dokręcać ostrza zbyt mocno, aby nie doprowadzić do jego odkształcenia.

Zauważycie podczas krojenia, że grubość tkanki nie jest jednolita. Dlatego nie należy opuszczać tego ramienia całkowicie. Należy ustawić je tak, aby znajdowało się mniej więcej na poziomie samego ostrza.

To jest kolejny element, który być może będziesz musiał wyregulować podczas sekcjonowania. Jest to płytka przeciwrotacyjna. Jest to kawałek szkła, który pasuje do tego uchwytu, a regulować go można za pomocą tej śruby z zapadką.

Można go przesuwać do przodu lub do tyłu. Pozwoli to utrzymać tkankę lub przekroje w płaskiej pozycji, co umożliwi ich zamontowanie na szkiełku. Inną rzeczą, którą warto dostosować podczas skrawania, jest miejsce na ostrzu, w którym odbywa się właściwe cięcie.

Aby dokonać regulacji, należy po prostu podnieść tę dźwignię, co pozwala na przesuwanie całego urządzenia w lewo lub w prawo. Stosuje się to przede wszystkim w przypadku, gdy tkanka zaczyna zahaczać o konkretny fragment ostrza lub gdy chcą Państwo oszczędzać ostrza, ponieważ są one dość kosztowne. W ten sposób, przesuwając urządzenie w przód i w tył, można znaleźć czysty, niezużyty obszar tnący.

Kolejnym elementem, który można dostosować, jest kąt cięcia. Po boku, w miejscu niewidocznym na nagraniu, znajdują się trzy różne pozycje. Korzystamy z pozycji środkowej, którą ustawia się, podnosząc drugi dźwignia.

I, i można sprawić, że ten mechanizm porusza się w górę i w dół. Zawsze utrzymujemy go w pozycji środkowej. Zatem teraz zostawię go w tej pozycji.

To, co znajduje się tutaj z tyłu, to głowica kriostatu. Służy ona do utrzymania zamrożonej próbki tkanki podczas jej sekcjonowania. Głowica porusza się w górę i w dół oraz przesuwa się w kierunku ostrza.

W zasadzie montuje się tkankę na tym uchwycie, a następnie umieszczamy uchwyt w głowicy, mocno go dokręcamy i używamy tych pokręteł z tyłu, aby dostosować kąt i uzyskać bardziej proste cięcie. Teraz zamontuję tkankę na uchwycie. Uchwyty należy trzymać w temperaturze pokojowej, ponieważ najpierw nakłada się warstwę OCT i nie chcemy, aby zamarzła ona natychmiast, gdyż zależy nam na uzyskaniu ładnej, płaskiej warstwy.

Użyjemy tego urządzenia, zwanego ekstraktorem ciepła. Służy ono do spłaszczania OCT podczas zamrażania. Najpierw biorę próbkę w temperaturze pokojowej i umieszczam ją w tym uchwycie.

Pobierz nieco z moich pęcherzyków OCT. Nie ma to tutaj znaczenia, ponieważ zostaną one wyciśnięte. Po prostu dodaj trochę, nie potrzeba go wiele.

Weź ekstraktor ciepła i umieść go bezpośrednio w tym miejscu. Odczekaj kilka sekund. Wtedy można zauważyć, że OCT jest gładki i płaski.

Mam już tkankę i muszę zaznaczyć właściwy OCT. Zaznaczę punkt na OCT, aby wskazać jego położenie. W ten sposób właśnie oznaczyłem górną część niebieską kropką.

Teraz wyjmę blok tkanki z formy, robiąc to poprzez nacisk na jej tył. Delikatnie nacisnę z tyłu i wypchnę go do dłoni, ale ponownie zaznaczam, że nie chcę, aby tkanka rozmroziła się, więc natychmiast umieszczam ją z powrotem.

Teraz można zobaczyć blok tkanki z niebieskim oznaczeniem, które naniosłem. Dzięki temu wiem, że jest to górna część głowy zarodka. Chcę wykonać cięcia przez twarz, ponieważ są to przekroje wieńcowe.

Teraz dodam kolejną, większą kroplę OCT; muszę działać szybko, ponieważ wszystko jest zimne. Następnie wezmę tkankę i umieszczę ją dokładnie na środku, upewniając się, że przylega płasko do przygotowanej warstwy OCT. Teraz pozostawię to do zamrożenia, co zajmie około minuty lub dwóch.

Zamrażanie zostało zakończone. Teraz wezmę tkankę zamontowaną na uchwycie, umieszczę ją w głowicy, ustawiając ją jak najprościej, a następnie mocno dokręcę.

Umieścę go tuż przed ostrzem, a następnie przesunę, co może zająć kilka sekund. Dobrze, teraz użyję płaskiej krawędzi ostrza, aby precyzyjnie ustawić tkankę. Po prostu spojrzę na krawędź i będę przesuwać tkankę w górę i w dół, aby upewnić się, że krawędzie są wyrównane.

Gdyby tak nie było, mogłoby to wyglądać mniej więcej w ten sposób. Oczywiście przesadzam, ale widać tutaj, że nie przylega to prosto do ostrza. Dlatego dokonuję kolejnych korekt, aż poczuję, że jest to ustawione tak prosto, jak to tylko możliwe.

Uważam, że wygląda to całkiem dobrze. Sprawdzam więc z każdej strony, aby upewnić się, że tkanka zostanie przecięta prostopadle do ostrza, i wykorzystuję krawędź ostrza, aby to wskazać. Patrzę z góry oraz z boku i właściwie tkanka wygląda całkiem dobrze.

Nie muszę wprowadzać wielu korekt, ale gdyby było to konieczne, użyłbym po prostu pokręteł znajdujących się z tyłu głowicy. Obracając je w lewo lub w prawo, można dokonać precyzyjnych regulacji. Jednak obecnie wszystko wygląda całkiem dobrze.

Teraz przesuwam tkankę do przodu. Nie jest ona jeszcze cięta, ponieważ nie styka się z ostrzem. Tkanka jest osadzona głęboko w OCT.

Dotarcie do tkanki może zatem zająć kilka minut. Nie należy przesuwać noża zbyt szybko, ponieważ może on zahaczyć i doprowadzić do pęknięcia OCT oraz tkanki, ale nie powinno się również robić tego zbyt wolno, aby proces nie trwał zbyt długo. Urządzenie to posiada użyteczną funkcję przycinania w grubszych sekcjach, co pozwala na szybszą pracę.

W tym momencie przecinam warstwę OCT, dlatego nieco zwalniam. Jeszcze nie dotarłem do tkanki, ale jest to czas, w którym oceniam, jak będzie przebiegać proces krojenia. Wiele zmiennych może sprawić, że sekcjonowanie tkanki pójdzie bardzo dobrze lub bardzo źle.

To, co zdarza się najczęściej w przypadku tego kriotomu, to, że tkanka jest w rzeczywistości nieco zbyt zimna. Obniżyłem temperaturę, ale mimo to wydaje się ona nadal zbyt niska. W efekcie nóż drga podczas przecinania tkanki lub OCT.

Pojawią się wtedy takie małe linie, poziome prążki przechodzące przez OCT. To, co robię, to delikatne ogrzanie krawędzi OCT kciukiem, po prostu lekko dotykając i przesuwając kciukiem przez krótką chwilę. Zauważyłem, że po takim zabiegu skrawki są znacznie lepszej jakości, a drgania ostrza ustały.

Oto kwestie, które oceniam przed przystąpieniem do pracy z tkanką. Zauważyłem, że podczas przecinania tkanki ostrze napotyka opór lub w rzeczywistości powstaje pęknięcie w OCT. Dlatego jedną z pierwszych rzeczy, jakie robię, jest wymiana ostrza.

Nie jestem pewien, jak długo to ostrze było tutaj zamontowane i kto korzystał z niego przede mną, więc po prostu wyjmę nowe ostrze. Są one oczywiście bardzo ostre, dlatego należy zachować ostrożność. Następnie wyreguluję płytkę antyprzewrotną; na dole znajduje się sprężynowa śruba, którą wystarczy przesunąć pod spodem, aby ustawić ją w pozycji wewnątrz lub na zewnątrz.

Przesunąłem i wykrawałbym już wystarczająco wiele sekcji, aby dotrzeć do tkanki. Niestety, przez blok OCT przebiega pęknięcie, co zdarza się często i niestety nie można tego w pełni kontrolować, ale istnieją sposoby, aby to naprawić. Gdyby pęknięcie przeszło przez samą tkankę, próbkę należałoby odrzucić lub spróbować odzyskać to, co się da.

W tym przypadku pęknięcie wydaje się znajdować nad tkanką. Dlatego użyję żyletek, które znajdowały się w kriosztacie i są schłodzone.

Spróbuję teraz odciąć pękniętą część, która znajduje się w górnej części bloku OCT. Ponownie użyję kciuka, aby ogrzać powierzchnię bloku OCT. Następnie wykonam przekrój i, jak widać tutaj, blok jest pęknięty.

Wówczas odłączyłem fragment z tkanką, a następnie usunąłem resztę OCT, która po prostu odpadła – była to część pęknięta. Teraz spróbuję odciąć tę pękniętą część za pomocą schłodzonego ostrza żyletki. Muszę prowadzić ostrze bardzo prosto, używając obu rąk i równomiernie naciskając na żyletkę.

Następnie będę kołysać ostrzem w przód i w tył wewnątrz OCT. Kołyszę w przód i w tył, powoli wycinając fragment OCT. Mam nadzieję, że usuwam pękniętą część.

Dobrze, teraz odetnę nadmiar OCT. Dobrze, wygląda to dobrze. Następnie lekko odsunę głowę, ponieważ stworzyłem krawędzie, które mogą zahaczyć o ostrze, a jeśli tak się stanie, mogłyby one odłamać OCT i tkankę, co zniszczyłoby moją próbkę.

Cofnąłem się, więc muszę teraz przesunąć się nieco dalej, aby ponownie wejść w tkankę i mam nadzieję, że naprawiłem pęknięcie. Dobrze, teraz wracam do tkanki. Wygląda na to, że udało mi się to naprawić.

W OCT nie ma już żadnych pęknięć, co znacznie ułatwi pobieranie sekcji. Teraz przejdę do części tkanki, która mnie interesuje. W tej chwili dotykam powierzchni i chciałbym dostać się do mózgu tego zarodka.

Są one wystarczająco duże, aby umożliwić mi dostrzeżenie struktur, które mnie interesują. Zapomniałem wspomnieć, że używam tych pędzli do oczyszczania ostrza pomiędzy każdą sekcją, którą zamierzam zarejestrować. Ten większy służy jedynie do oczyszczania obszaru i usuwania nadmiaru OCT.

Używam również tych cieńszych pędzli do manipulowania przekrojem na tej chłodnicy, aby odpowiednio go ustawić podczas przenoszenia na szkiełko. Pędzle te są utrzymywane w niskiej temperaturze, aby OCT nie stopił się i nie przywarł do włosia. Aby przejąć tkankę, najpierw ogrzeję kciukiem OCT oraz tkankę.

Następnie wezmę jeden z tych preparatów, które już opisałem. Trzymam go odwróconym do góry dnem – każdy robi to inaczej, ale ja preferuję trzymać prawy górny róg prawą ręką, gdy szkiełko jest skierowane w dół.

Następnie użyję lewego kciuka jako punktu podparcia, aby móc opuścić płytkę prosto w dół i pobrać przekrój. OCT i tkanka w rzeczywistości stopią się na szkiełku, co spowoduje ich samodzielne zamocowanie. Zatem najpierw ogrzeję tkankę kciukiem, powoli wykonam cięcie, wezmę szkiełko, przytrzymam jego prawy róg prawą ręką, przesunę płytkę, opuszczę ją pionowo w dół i pozwolę jej się stopić.

Obejrzę tkankę, aby upewnić się, że nie ma zagięć ani pęcherzyków powietrza i że wygląda ona prawidłowo. Będę kontynuować tę czynność, aż przetnę cały mózg. Obecnie oglądam przekroje pod stereomikroskopem, aby upewnić się, że są one prawidłowe – i tak jest, w górnej części przekroju widać przedmózowie, a wszystkie preparaty wyglądają bardzo dobrze.

Te skrawki mrożone można wykorzystać do takich metod jak hybrydyzacja in situ. Czasami wykonujemy podstawowe badania histologiczne, np. barwienie H&E. Można również przeprowadzić immunofluorescencję oraz szereg podobnych testów.

W moim przypadku przekroje te zostały utrwalone i poddane obróbce w celu przeprowadzenia hybrydyzacji in situ. To właśnie będę robić w następnej kolejności.