Name: Błyskawiczne zamrażanie i kriosekcja mózgu myszy E12.5 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 28 min 32 s
Description: Naucz się technik błyskawicznego zamrażania i kriosekcji tkanek mózgu embrionalnego myszy. Poznaj metody przygotowania próbek OCT, obsługi kriostatu oraz rozwiązywania problemów z pęknięciami w neurobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol>
<li>Utrwalić tkankę w 4% paraformaldehydzie w PBS przez wybrany czas.</li>
<li>Infundować tkankę sacharozą (krioprotekcja) <ol>
<li>Przygotować 30% roztwór sacharozy w PBS w/v w probówce 2059.</li>
<li>Przepłukać tkankę 3x w PBS (~ 5 min z kołysaniem).</li>
<li>Umieścić tkankę w 30% roztworze sacharozy.&nbsp; Tkanka nie powinna zatonąć.</li>
<li>Przechowywać tkankę w 4°C przez noc lub do momentu, aż zatonie.</li>
</ol></li>
<li>Oznaczyć formę do mrożenia (cryomold) o odpowiednim rozmiarze, podając informacje oraz orientację.</li>
<li>Wypełnić formę do mrożenia medium O.C.T. (unikając pęcherzyków powietrza).</li>
<li>Przenieść tkankę do kąpieli z O.C.T. i pokryć ją tym medium.</li>
<li>Przenieść tkankę do O.C.T. w formie do mrożenia.</li>
<li>Zorientować tkankę pod mikroskopem.</li>
<li>Wlać ciekły azot do plastikowej szalki Petriego.</li>
<li>Szybko i ostrożnie zanurzyć tkankę w formie do mrożenia w azocie (nie zanurzać górnej części formy).</li>
<li>Gdy O.C.T. stanie się białe i stałe, umieścić zamrożoną tkankę w zamrażarce -80°C w celu przechowywania.</li>
<li>Dostosować temperaturę tkanki do ~20°C przez co najmniej 30 min przed przystąpieniem do cięcia.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Forma do mrożenia Tissue-Tek Cryomold</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>27181</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T.</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>27050</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór sacharozy</td><td></td><td></td><td>30% roztwór sacharozy w PBS w/v</td></tr><tr><td>paraformaldehyd</td><td></td><td></td><td>4% paraformaldehyd w PBS </td></tr></tbody></table>

szybkie mrożenie i kriosekcjonowanie mózgu myszy w stadium e12.5

Flash Freezing and Cryosectioning E12.5 Mouse Brain

<p class="jove_content">W niniejszym filmie zaprezentowano techniki błyskawicznego mrożenia i sekcjonowania tkanki zarodkowego mózgu myszy. Przedstawiono przydatne wskazówki dotyczące obsługi kriostatu, w tym metody rozwiązywania problemów, które można zastosować podczas cięcia, aby zapewnić, że uzyskane przekroje tkankowe będą wolne od pęknięć i innych zniekształceń.</p>

Szybkie mrożenie i kriosekcjonowanie mózgu myszy w stadium E12.5

<p>Witam, nazywam się Spencer Curley z University of California Irvine i laboratorium Eda Makiego. Zaprezentuję, jak przeprowadzić kriosekcjonowanie. W tym celu wykorzystam najpierw następujące, powszechnie stosowane odczynniki. Zastosowany przeze mnie środek do zatapiania, czyli medium do zatapiania, to OCT (optimal cutting temperature).</p><p>Jest to przejrzysty roztwór, bardzo gęsty i lepki, który dobrze utrzymuje tkankę, umożliwiając jej odpowiednie zorientowanie przed zamrożeniem; ponadto jest on rozpuszczalny w wodzie, co pozwala na jego usunięcie podczas dowolnej procedury barwienia. Tkankę zatapiam w formie. Te krioformy do biopsji są dostępne w różnych rozmiarach.</p><p>Będę używać tej mniejszej formy, ponieważ pracuję z tkanką embrionalną myszy. Naszą tkankę mrozimy gwałtownie w ciekłym azocie. Najpierw napełnię tę ochronną kolbę próżniową ciekłym azotem z naszego zbiornika.</p><p>Przed błyskawicznym zamrażaniem tkanki należy przeprowadzić tzw. krioprotekcję, w przeciwnym razie sam proces zamrażania zniszczy tkankę. W tym celu tkankę zanurza się w 30% roztworze sacharozy na noc. Jeśli proces ten potrwa dłużej, nie stanowi to problemu, o ile tkanka całkowicie opadnie na dno.</p><p>Jak widać, głowy myszy</p>

flash-freezing-and-cryosectioning-e125-mouse-brain

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mrożenie błyskawiczne i cięcenie tkanek mózgu myszy w 12,5 dniu rozwoju

Ten film demonstruje kriokonserwację mózgu myszy w celu odizolowania dyskretnych obszarów anatomicznych lub określonych populacji komórek z tkanek nowotworowych. Technika ta ma kluczowe znaczenie dla uzyskania optymalnej rozdzielczości optycznej morfologii tkanki mózgowej do późniejszej analizy.

Kriokonserwacja mózgu myszy przez szybkie zamrażanie: technika szybkiego zamrażania całej próbki mózgu myszy do analizy histologicznej

W tym filmie pokazujemy cięcie zamrożonej tkanki guza mózgu myszy za pomocą kriostatu. Uzyskane w ten sposób zamrożone skrawki tkanki mózgowej są przechowywane w niskich temperaturach do czasu dalszej analizy.

Sekcja zamrożonej tkanki mózgowej myszy: procedura uzyskiwania cienkich zamrożonych skrawków tkanki z zamrożonej tkanki mózgowej myszy

Ten film przedstawia szczegółowy protokół krok po kroku dotyczący przygotowania zamrożonych skrawków tkanki mózgowej myszy do dalszych analiz.

Przetwarzanie mózgu myszy do dalszej analizy

Tutaj prezentujemy protokół zamrażania i cięcia tkanki mózgowej od wielu zwierząt jako oszczędzającą czas alternatywę dla przetwarzania pojedynczych mózgów. Zmniejsza to zmienność barwienia podczas immunohistochemii i skraca czas kriosekcji i obrazowania.

Jednoczesna kriosekcja wielu mózgów gryzoni

Ta procedura opisuje zbieranie dyskretnie zamrożonych obszarów mózgu w celu uzyskania wysokiej jakości białka i RNA przy użyciu tanich i powszechnie dostępnych narzędzi.

Gromadzenie zamrożonych obszarów mózgu gryzoni do dalszych analiz

Ten protokół opisuje metodę łączenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunohistochemii fluorescencji (IHC) zarówno w świeżo mrożonych, jak i stałych sekcjach mózgu myszy, w celu uzyskania wieloznakowego sygnału FISH i fluorescencji IHC. IHC celował w białka cytoplazmatyczne i przyłączone do błony.

Połączenie hybrydyzacji <em>fluorescencji in situ</em> multipleksowej z immunohistochemią fluorescencyjną na świeżo zamrożonych lub utrwalonych wycinkach mózgu myszy

Prezentowana jest wygodna metoda perfuzji grawitacyjnej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy. Immunofluorescencyjne wykrywanie fosforylowanej α-synukleiny wykazano w mysim modelu choroby Parkinsona. Praca ta kompleksowo opisuje również etapy perfuzji przezsercowej, rozwarstwienia, zamrażania/osadzania tkanek i zamrażania sekcji.

Grawitacyjna metoda perfuzji przezsercowej do analizy histologicznej ośrodkowego układu nerwowego myszy

Obecny protokół opisuje praktyczną strategię przyspieszenia etapu weryfikacji współrzędnych iniekcji stereotaktycznej przed przeprowadzeniem śledzenia wirusa za pomocą barwników i zamrożonych skrawków.

Wstępna walidacja współrzędnych iniekcji stereotaktycznej za pomocą kriosekcji

To badanie przedstawia uproszczony protokół przetwarzania tkanek obejmujący dekapitację, fiksację, kriosekcję, barwienie fluorescencyjne, barwienie immunologiczne i obrazowanie, który może być rozszerzony na obrazowanie konfokalne i wielofotonowe. Metoda zachowuje skuteczność porównywalną ze skomplikowanymi sekcjami, omijając potrzebę zaawansowanych umiejętności motorycznych. Ilościowa analiza obrazu daje szeroki potencjał badawczy.

Bezpośrednia kriosekcja głów <em>Drosophila</em> w celu wzmocnienia barwienia fluorescencyjnego mózgu i barwienia immunologicznego

Siatkówka wykazuje złożoną organizację przestrzenną w całej swojej strukturze laminarnej. Nowoczesna transkryptomika przestrzenna i techniki sekwencjonowania wymagają wycinków tkanek o grubości &lt; 20 μm, co ogranicza ich zastosowanie w badaniach siatkówki. Ta świeżo zamrożona metoda kriosekcji pozwala uzyskać cienkie przekroje siatkówki myszy, zachowując jednocześnie płaskie relacje przestrzenne, umożliwiając kompleksowe mapowanie molekularne blaszek.

<em>En face</em> Kriosekcja siatkówki myszy w celu przeprowadzenia wielowymiarowej przestrzennej analizy molekularnej

Protokół ten standaryzuje tomografię krioelektronową (cryo-ET) dla grubych tkanek poprzez integrację zamrażania pod wysokim ciśnieniem (HPF) z metodą gofrową, wyciąganie kriogenicznej wiązki jonowej (krio-FIB) oraz równoległe pobieranie pod względem dawki, co daje jednolicie cienkie lamele i próbki zwitryfikowane do powtarzalnej analizy in situ w hipokampie myszy.

Workflow tomografii krioelektronowej dla grubych tkanek wykazany u hipokampa myszy

Naucz się technik błyskawicznego zamrażania i kriosekcji tkanek mózgu embrionalnego myszy. Poznaj metody przygotowania próbek OCT, obsługi kriostatu oraz rozwiązywania problemów z pęknięciami w neurobiologii.

Szybkie mrożenie i kriosekcjonowanie mózgu myszy w stadium E12.5

Przeglądaj więcej filmów