Name: Ustalanie wewnątrzczaszkowych ksenoprzeszczepów guza mózgu z późniejszą analizą wzrostu guza i odpowiedzi na terapię za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-13T17:55:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Poznaj metodę wewnątrzczaszkowych ksenoprzeszczepów guza mózgu u myszy z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego. Technika umożliwia monitorowanie wzrostu guza i odpowiedzi na terapię w badaniach przedklinicznych neuroonkologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Granty NINDS NS49720 i NS65819 oraz grant NCI CA97257

1. Przygotowanie komórek nowotworowych.
Komórki do ksenoprzeszczepów guzów mózgu człowieka można pozyskać albo z guzów propagowanych jako wzrosty podskórne u myszy atypicznych, albo z hodowli komórkowych. Poniżej omówiono wykorzystanie obu źródeł komórek wraz z demonstracją metody implantacji komórek.
Aby przygotować komórki z guzów podskórnych do przeniesienia do przestrzeni wewnątrzczaszkowej, wycięte guzy z boku ciała umieszcza się w naczyniach hodowlanych, gdzie tkankę początkowo rozdrabnia się skalpelem, a następnie rozbija mechanicznie poprzez wielokrotne pipetowanie w celu utworzenia zawiesiny agregatów komórkowych1. Zawiesinę agregatów komórkowych przepuszcza się następnie przez filtr z nylonowej siatki o oczkach 70 μM, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek odpowiednią do wstrzyknięcia do czaszki. Zawiesinę komórkową wiruje się z prędkością 10 rpm przez 10 minut w temperaturze 4°C, a następnie odsysa się supernatant przed ponownym zawieszeniem osadu komórkowego w odpowiedniej objętości medium bezsurowiczego w celu uzyskania końcowego stężenia roboczego (patrz poniżej). W przypadku przygotowania ustalonych linii komórkowych do implantacji wewnątrzczaszkowej, komórki pozyskuje się poprzez trypsynizację monowarstw lub poprzez zbieranie kultur zawiesin neurosfer, a następnie wirując i resuspendując komórki zgodnie z powyższym opisem 2. Liczba wstrzykiwanych komórek jest zmienna i zależy od neuroanatomicznego miejsca wstrzyknięcia. W przypadku wstrzyknięć nadnamiotowych rutynowo wstrzykujemy 3-5 x 105 komórek w 3 μL medium bezsurowiczego (DMEM), natomiast w przypadku wstrzyknięć do pnia mózgu 3 wstrzykuje się już tylko 5 x 104 komórek w 0,5 μL. Wstrzyknięcie objętości większych niż zalecane może doprowadzić do refluksu komórek nowotworowych przez kanał igły, co skutkuje egzofitycznym (Rysunek 1), a nie wewnątrzczaszkowym wzrostem guza. Po pobraniu próbki do wstrzyknięcia wewnątrzczaszkowego, pozostałą zawiesinę komórkową należy umieścić w lodzie, często mieszając zawartość, aby utrzymać odpowiednie stężenie podczas kończenia procesu wszczepiania guzów u kolejnych osobników w serii wstrzyknięć.
2. Implantacja komórek nowotworowych
Uwaga: wszystkie poniższe procedury zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Wykorzystania Zwierząt (Institutional Animal Use and Care Committee) na Uniwersytecie Kalifornijskim w San Francisco.
<ol>
	<li>Obszar chirurgiczny należy przygotować, spryskując wszystkie powierzchnie środkiem dezynfekcyjnym, takim jak 2% roztwór chlorheksydyny. Po zastosowaniu środka dezynfekcyjnego w obszarze chirurgicznym należy umieścić następujące materiały:
	<ul>
		<li>Mata grzewcza w celu utrzymania temperatury ciała myszy</li>
		<li>Dwie małe płytki Petriego; jedna zawierająca 3% nadtlenek wodoru, a druga 2% chlorheksydynę</li>
		<li>Sterylna gaza i patyczki higieniczne</li>
		<li>Sterylne jednorazowe skalpele</li>
		<li>Autoklawowany zszywacz chirurgiczny</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Do znieczulenia należy użyć środka podawanego w zastrzyku; zazwyczaj jest to mieszanina ketaminy i ksylazyny.</li>
	<li>Po znieczuleniu myszy skórę głowy przygotowuje się, przecierając ją kilkakrotnie kawałkiem sterylnej gazy nasączonej roztworem chlorheksydyny. Należy zastosować maść do oczu, aby utrzymać odpowiednią wilgotność podczas zabiegu. Za pomocą sterylnego skalpela wykonuje się nacięcie strzałkowe nad kością ciemieniowo-potyliczną o długości około 1 cm. Odsłoniętą powierzchnię czaszki oczyszcza się następnie patyczkiem higienicznym nasączonym 3% roztworem nadtlenku wodoru. Na tym etapie widoczna powinna być bregma (patrz wideo).</li>
	<li>Współrzędne wstrzykiwania komórek nowotworowych różnią się w zależności od pożądanego miejsca powstawania guza. Poniżej przedstawiono procedurę, której używamy do wewnątrzczaszkowego wywoływania nowotworu2 w lokalizacji neuroanatomicznej, w której u wielu pacjentów z guzami mózgu rozwija się nowotwór. Inne lokalizacje istotne w badaniach nad guzami mózgu obejmują most, do modelowania anatomicznego guzów pnia mózgu3, oraz wstrzyknięcia podtwardówkowe do modelowania lokalizacji guzów oponowych4. Przed wstrzyknięciem komórek nowotworowych należy użyć sterylnej igły 25 G, aby nakłuć czaszkę 2 mm na prawo od bregmy i 1 mm przed szwem czołowym, tworząc w ten sposób otwór do wstrzyknięcia komórek nowotworowych (patrz wideo). Procedura ta sprawdza się zarówno u myszy, jak i szczurów (igła 2 G dla szczurów).</li>
	<li>Przed nabraniem komórek do strzykawki należy wymieszać zawiesinę komórkową, opukując naczynie palcem. Należy napełnić strzykawkę pożądaną ilością zawiesiny komórkowej, uważając, aby nie powstały pęcherzyki powietrza. Zewnętrzna część strzykawki powinna zostać oczyszczona za pomocą gazika z alkoholem, aby usunąć z powierzchni wszelkie przylegające komórki, co zapobiegnie powstawaniu i wzrostowi guzów poza czaszką (Rysunek 1A). Aby zapewnić odpowiednią głębokość wstrzyknięcia, należy użyć skalpela do odcięcia 3 mm z ostrego końca końcówki do pipety P20. Ten fragment końcówki można nasunąć na strzykawkę, co ograniczy głębokość wstrzyknięcia i dodatkowo zapewni, że końcówka igły strzykawki znajdzie się 3 mm od strony spodniej czaszki. Należy ustawić strzykawkę prostopadle do czaszki w uprzednio wykonanym otworze i powoli wstrzyknąć zawiesinę komórkową (zawiesinę o objętości 3 µL należy wstrzykiwać w ciągu 1 minuty). Nieprawidłowy kąt włożenia strzykawki może doprowadzić do wstrzyknięcia komórek do komór mózgu i następującego po tym rozsiewu do rdzenia kręgowego (Rys. 1B: Prawa strona). Po zakończeniu wstrzykiwania należy pozostawić igłę w miejscu przez kolejną minutę, a następnie powoli ją wycofać (patrz wideo): kroki te pomogą zmniejszyć cofanie się komórek nowotworowych.</li>
	<li>Jako alternatywę dla podejścia bez wspomagania lub „z wolnej ręki” do wewnątrzczaszkowej implantacji komórek nowotworowych5, można zastosować stereotaktyczną ramę dla małych zwierząt (panel F na schemacie przekrojowym), co zazwyczaj sprzyja bardziej spójnej lokalizacji wstrzyknięcia, ale kosztem znacznego wydłużenia czasu procedury. W naszym doświadczeniu dwóch pracowników chirurgicznych może wstrzyknąć do 60 myszy na godzinę przy zastosowaniu metody z wolnej ręki, podczas gdy maksymalne tempo wstrzykiwania przy użyciu ramy stereotaktycznej dla małych zwierząt wynosi około 15 myszy na godzinę. Sprawność procedury jest ważnym elementem przy wstrzykiwaniu dużych serii myszy i pomaga skrócić czas, przez który komórki nowotworowe przeznaczone do wstrzyknięcia pozostają w lodzie.</li>
	<li>Czaszkę należy oczyścić 3% nadtlenkiem wodoru i osuszyć sterylnym suchym patyczkiem higienicznym. W otwór należy wprowadzić sterylny wosk kostny. Za pomocą pęsety należy zbliżyć brzegi skóry głowy nad czaszką i zamknąć ranę zszywaczem. Dla optymalnego gojenia skóra głowy powinna zostać zszyta tak, aby warstwy skóry właściwej z każdej strony stykały się ze sobą (spodem do spodu). Zszytą skórę głowy należy oczyścić roztworem chlorheksydyny, a następnie podać buprenorfinę w zastrzyku podskórnym w celu pooperacyjnego uśmierzenia bólu.</li>
	<li>Wszystkie myszy należy monitorować po operacji aż do momentu, gdy odzyskają zdolność poruszania się i normalną aktywność. Zazwyczaj czas rekonwalescencji wynosi około 30 minut.</li>
</ol>
3. Monitorowanie wzrostu guza za pomocą bioluminescencji
<ol>
	<li>Wstęp. Obrazowanie bioluminescencyjne (BLI) opiera się na utlenianiu lucyferyny [kwas d-(-)-2-(60-hydroksy-20-benzotiazolyl)-tiazon-4-karboksylowy] w obecności tlenu i trifosforanu adenozyny (ATP). Reakcja ta jest katalizowana przez enzym lucyferazę, która przekształca energię chemiczną w fotony, co skutkuje emisją światła. Komórki ludzkie mogą zostać zmodyfikowane tak, aby ekspresowały lucyferazę (patrz poniżej), przy czym tylko komórki ekspresujące lucyferazę są zdolne do emisji światła w obecności substratu, jakim jest lucyferyna. Bioluminescencja tła organizmów gospodarzy poddanych działaniu lucyferyny jest minimalna, co zapewnia bardzo korzystny stosunek sygnału do szumu podczas detekcji emisji luminescencji z komórek nowotworowych zmodyfikowanych lucyferazą, umożliwiając wysokoczułe monitorowanie wzrostu guza i odpowiedzi na terapię in vivo. Ponadto wykazano, że lucyferaza i jej substrat, lucyferyna, nie są toksyczne dla komórek ssaków, a nie zaobserwowano różnic funkcjonalnych między komórkami ekspresującymi lucyferazę a odpowiadającymi im komórkami niemodyfikowanymi. Lucyferyna łatwo przenika przez błony komórkowe i barierę krew-mózg po wstrzyknięciu doszpikowym (i.p.) lub dożylnym (i.v.) u myszy, co pozwala na obrazowanie każdego przedziału zawierającego komórki zmodyfikowane lucyferazą. Poziom emisji fotonów i widmo emitowanego światła z komórek zmodyfikowanych lucyferazą są wystarczające, aby przeniknąć przez tkanki małych zwierząt laboratoryjnych, takich jak myszy i szczury, i mogą być wykrywane zewnętrznie za pomocą kamer do obrazowania słabego światła. Nieinwazyjny charakter obrazowania bioluminescencyjnego pozwala na wielokrotne monitorowanie wzrostu guza i odpowiedzi na terapię u poszczególnych osobników zwierząt.</li>
	<li>Implantowane źródła komórek powinny być stabilnie zmodyfikowane pod kątem ekspresji lucyferazy świetlikowej. Takie źródła komórek można zakupić lub wytworzyć w poszczególnych laboratoriach przy użyciu lentiwirusów skonstruowanych do konstytutywnej ekspresji lucyferazy. Zdecydowanie zalecamy stosowanie komórek zmodyfikowanych lentiwirusem kodującym lucyferazę, a nie plazmidem, aby zapewnić stabilną komórkową ekspresję lucyferazy in vivo, co jest niezbędne do ilościowego obrazowania luminescencji w celu dokładnego wskazania zmian w obciążeniu nowotworowym u poszczególnych osobników zwierząt, które są wielokrotnie obrazowane w trakcie eksperymentu.</li>
	<li>Monitorowanie BLI. Zalecamy przeprowadzanie ilościowego obrazowania bioluminescencyjnego (qBLI) 1–2 razy w tygodniu, zaczynając tydzień po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. Nasze qBLI jest przeprowadzane przy użyciu stacji obrazowania IVIS Lumina (Caliper Life Sciences), a nasze wyniki wskazują, że podobne dane uzyskuje się przy użyciu stacji obrazowania IVIS Lumina, IVIS 150 lub IVIS 20. W ramach przygotowania do obrazowania myszy są jednocześnie znieczulane ketaminą/ksylazyną i otrzymują lucyferynę (sól potasowa D-lucyferyny, 150 mg/kg, Caliper Life Sciences) poprzez wstrzyknięcie doszpikowe, a obrazowanie myszy odbywa się 12 minut po wstrzyknięciu. Farmakokinetyka lucyferyny wskazuje, że czas między podaniem lucyferyny a oznaczeniem luminescencji komórek powinien wynosić od 10 do 15 minut po wstrzyknięciu lucyferyny, aby uzyskać maksymalną emisję luminescencji i największą czułość detekcji. Wybrany czas w przedziale 10–15 minut powinien pozostać stały dla wszystkich obrazowanych zwierząt. Niezwykle ważne jest zachowanie spójności czasu pomiędzy wstrzyknięciem lucyferyny a odczytem BLI. Obszary zainteresowania obejmujące wewnątrzczaszkowy obszar sygnału są definiowane za pomocą oprogramowania Living Image (Rysunek 2), a całkowita liczba fotonów/s/sr/cm2 (fotonów na sekundę na steradian na centymetr kwadratowy) jest rejestrowana (patrz wideo).</li>
	<li>Analiza danych. Ponieważ wzrost guza i odpowiedź na terapię są monitorowane u poszczególnych zwierząt, zdecydowanie zalecamy grupy terapeutyczne liczące co najmniej 8 osobników, aby zwiększyć pewność statystyczną wniosków dotyczących odpowiedzi nowotworu na terapię lub jej braku. W odniesieniu do prezentacji wyników qBLI, odczyty luminescencji są przeliczane na wartości znormalizowane poprzez podzielenie luminescencji każdej myszy, uzyskanej w trakcie i po zakończeniu schematu terapeutycznego, przez odpowiadający jej maksymalny odczyt luminescencji przed leczeniem6,7. Do analizy przeżywalności stosuje się estymator Kaplana-Meiera8, na podstawie którego generowane są krzywe przeżywalności i wyznaczane mediany czasu przeżycia. Różnice między krzywymi przeżywalności są porównywane za pomocą testu log-rank9.</li>
	<li>Pobieranie mózgu do późniejszej analizy guza leczonego i nieleczonego. Po eutanazji zwierzęcia mózg myszy należy szybko wyciąć (patrz wideo) i umieścić w formalinie w celu późniejszej analizy morfologii guza i immunohistochemii lub zamontować w OCT w celu zamrożenia preparatu.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
W przykładzie przedstawionym na rysunku 3A myszy, którym wykonano wewnątrzczaszkowe wstrzyknięcie komórek nowotworowych, monitorowano pod kątem luminescencji wewnątrzczaszkowej do momentu, gdy kolejne średnie wartości luminescencji wskazały na postępujący wzrost guza; w tym czasie rozpoczęto terapię (szara strzałka rozpoczynająca się w 34. dniu: erlotynib podawany codziennie w dawce 150 mg/kg aż do wymaganej eutanazji). Wartości luminescencji dla każdej myszy zostały ustawione na znormalizowaną wartość 1 w momencie rozpoczęcia terapii, a kolejne odczyty luminescencji dla każdej myszy znormalizowano do jej końcowej wartości obrazowania przed leczeniem. Na przykład mysz z końcowym odczytem luminescencji przed leczeniem wynoszącym 2,0 x 107 fotonów/s w 34. dniu, której luminescencja wzrosła do 6,0 x 107 fotonów/s w 38. dniu, miałaby w 38. dniu znormalizowaną wartość luminescencji równą 3,0. Dla każdego punktu czasowego obrazowania wykreślono średnią znormalizowaną bioluminescencję oraz odpowiadający jej błąd standardowy dla grup kontrolnej i leczonej. W tym przykładzie istotna różnica w średniej znormalizowanej luminescencji jest widoczna w pierwszym punkcie czasowym obrazowania po rozpoczęciu terapii (dzień 38), przy czym różnica w średniej luminescencji grup wykazuje dalszy wzrost w kolejnych punktach czasowych. W większości przypadków działanie przeciwnowotworowe terapii, wykazane przez qBLI, wiąże się z odpowiadającą mu istotną różnicą w przeżywalności (t.j. p &lt; 0,05), co ma miejsce również w tym przypadku (rysunek 3B). Panele 3C i 3D przedstawiają sąsiednie przekroje mózgu myszy barwione hematoksyliną i eozyną oraz przeciwciałem anty-EGFR, pobrane w momencie eutanazji po umieszczeniu wyciśniętego mózgu w formalinie i późniejszym zatopieniu w parafinie w celu wykonania skrawków.
<img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig1.jpg" alt="Obrazowanie guza u myszy nago-wykluczonych; schemat; fluorescencja optyczna; lokalizacja guza i rozkład znacznika." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Objawy błędów podczas wstrzykiwania wewnątrzczaszkowego. A) Egzofityczny wzrost guza (poza czaszką) (czerwone koło) może być spowodowany zbyt dużą objętością wstrzykiwanej zawiesiny, pozostałościami zawiesiny komórkowej przyczepionymi do strzykawki lub zbyt szybkim wycofaniem strzykawki po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. B) Wstrzyknięcie komórek nowotworowych do komór mózgu może spowodować rozsiew nowotworu do rdzenia kręgowego (mysz po prawej stronie), w przeciwieństwie do prawidłowo wstrzykniętych komórek nowotworowych, których sygnał pozostaje zlokalizowany w miejscu wstrzyknięcia (mysz po lewej stronie).
<img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig2.jpg" alt="Obrazowanie bioluminescencyjne, grupa kontrolna vs grupa badawcza, skala kolorystyczna wskazująca natężenie sygnału, eksperyment." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rysunek 2. Obrazy w formie map ciepła przedstawiające intensywność bioluminescencji dla reprezentatywnych myszy z grup kontrolnej (po lewej) i badawczej (po prawej) w eksperymencie oceniającym odpowiedź na terapię. Oprogramowanie Living Image można skonfigurować tak, aby automatycznie definiowało obszary zainteresowania (czerwone okręgi), lub operator urządzenia może zdefiniować obszary zainteresowania ręcznie. W przypadku wykorzystania takich obrazów do przygotowania ryciny zaleca się, aby operator urządzenia wyświetlał mapy ciepła przy użyciu tego samego zakresu intensywności bioluminescencji (górna część ryciny), co pozwala na wizualne przedstawienie zakresu różnic w bioluminescencji między badanymi zwierzętami.
<img src="/files/ftp_upload/1986/1986fig3.jpg" alt="Wykresy efektów erlotynibu, barwienie histologiczne, analiza PTEN i EGFR w badaniu nad rakiem." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Bioluminescencja, przeżywalność oraz analiza tkanki nowotworowej w eksperymencie, w którym widoczna jest odpowiedź terapeutyczna. A) Wykres średnich odczytów bioluminescencji dla myszy z grupy kontrolnej i grupy leczonej, z zaznaczonym błędem standardowym dla każdego punktu obrazowania. B) Wykres przeżywalności dla tych samych myszy; wartość p wyznaczona za pomocą testu log-rank 7. C) H&amp;E Barwiony przekrój mózgu myszy z guzem. D) Przekrój barwiony pod kątem EGFR. E i F) Powiększenia zaznaczonych obszarów odpowiednio z paneli C i D, przy czym panel E wykazuje negatywne barwienie dla białka supresorowego guza PTEN.

<ol><li>Giannini, C., Sarkaria, J. N., Saito, A., Uhm, J. H., Galanis, E., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient+Tumor+EGFR+and+PDGFRA+Gene+Amplifications+Retained+in+an+Invasive+Intracranial+Xenograft+Model+of+GBM%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro-Oncol%22%5BJournal%5D)">Patient Tumor EGFR and PDGFRA Gene Amplifications Retained in an Invasive Intracranial Xenograft Model of GBM.</a> Neuro-Oncol. 7, 164-176 (2005).</li>
<li>Ozawa, T., Wang, J., Hu, L. J., Bollen, A. W., Lamborn, K. R., Deen, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+human+glioblastomas+as+xenografts+in+the+brains+of+athymic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Growth of human glioblastomas as xenografts in the brains of athymic rats.</a> In Vivo. 1, 55-60 (2002).</li>
<li>Hashizume, R., Ozawa, T., Dinca, E. B., Banerjee, A., Prados, M. D., James, C. D., Gupta, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+brainstem+glioma+xenograft+model+enabled+for+bioluminescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">A human brainstem glioma xenograft model enabled for bioluminescence imaging.</a> J Neurooncol. , Forthcoming (2009).</li>
<li>Baia, G. S., Dinca, E. B., Ozawa, T., Kimura, E. T., McDermott, M. W., James, C. D., VandenBerg, S. R., Lal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthotopic+skull+base+model+of+malignant+meningioma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">An orthotopic skull base model of malignant meningioma.</a> Brain Pathol. 2, 172-179 (2007).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. Human Brain Tumor Cell and Tumor Tissue Transplantation Models. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOzawa%2C+T+%22CNS+Cancer%3A+Models%2C+Markers%2C+Prognostic+Factors%2C+Targets%2C+and+Therapeutic+Approaches%22">CNS Cancer: Models, Markers, Prognostic Factors, Targets, and Therapeutic Approaches</a>. Van Meir, E. , Humana Press-Springer. New York, NY. 147-162 (2009).</li>
<li>Sarkaria, J. N., Yang, L., Grogan, P. T., Kitange, G. J., Carlson, B. L., Schroeder, M. A., Galanis, E., Giannini, C., Wu, W., Dinca, E. B., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Molecular+Characteristics+Correlated+with+Glioblastoma+Sensitivity+to+EGFR+Kinase+Inhibition+Through+Use+of+an+Intracranial+Xenograft+Test+Panel%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of Molecular Characteristics Correlated with Glioblastoma Sensitivity to EGFR Kinase Inhibition Through Use of an Intracranial Xenograft Test Panel.</a> Mol. Cancer Ther. 6, 1167-1174 (2007).</li>
<li>Dinca, E. B., Sarkaria, J. N., Schroeder, M. A., Carlson, B. L., Voicu, R., Gupta, N., Berger, M. S., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+Monitoring+of+Intracranial+Glioblastoma+Xenograft+Response+to+Primary+and+Salvage+Temozolomide+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence Monitoring of Intracranial Glioblastoma Xenograft Response to Primary and Salvage Temozolomide Therapy.</a> J. Neurosurg. 107, 610-616 (2007).</li>
<li>Kaplan, E. L., Meier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-parametric+estimation+from+incomplete+observations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Stat.+Assoc%22%5BJournal%5D)">Non-parametric estimation from incomplete observations.</a> J. Am. Stat. Assoc. 53, 457-481 (1958).</li>
<li>Peto, R., Peto, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymptotically+efficient+rank+invariant+procedures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+R.+Stat.+Soc.+Ser.+A.+Stat.+Soc%22%5BJournal%5D)">Asymptotically efficient rank invariant procedures.</a> J. R. Stat. Soc. Ser. A. Stat. Soc. 135, 185-207 (1972).</li>
<li>Camphausen, K., Purow, B., Sproull, M., Scott, T., Ozawa, T., Deen, D. F., Tofilon, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+in+vivo+growth+on+human+glioma+cell+line+gene+expression%3A+convergent+profiles+under+orthotopic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A.%22%5BJournal%5D)">Influence of in vivo growth on human glioma cell line gene expression: convergent profiles under orthotopic conditions.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8287-8292 (2005).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Ustanowienie ortotopowego (wewnątrzczaszkowego) ksenoprzeszczepu guza mózgu zapewnia odpowiednie mikrośrodowisko10 do modelowania nowotworów OUN w celu przetestowania odpowiedzi terapeutycznej. Ten rodzaj modelowania dostarcza dodatkowo informacji na temat dostępu terapeutycznego do mózgu i guza mózgu, co jest krytycznie ważne dla określenia, czy eksperymentalny środek powinien zostać przekazany do oceny w badaniach klinicznych z udziałem pacjentów. Ponieważ wielkość wewnątrzczaszkowego ksenoprzeszczepu guza nie może być mierzona bezpośrednio, na przykład za pomocą suwmiarki, podłużne monitorowanie wzrostu guza wewnątrzczaszkowego i odpowiedzi na terapię wymaga obrazowania nieinwazyjnego; nasze doświadczenie wskazuje na obrazowanie bioluminescencyjne jako najbardziej praktyczne podejście w eksperymentach, których głównym celem jest ocena zakresu odpowiedzi guza na terapię. Gdy wyniki obrazowania bioluminescencyjnego zostaną połączone z analizą przeżywalności zwierząt, te dwa zestawy danych stanowią potężne i niezawodne podejście do oceny skuteczności eksperymentalnej terapii.
Na koniec, niezwykle ważne jest, aby ksenoprzeszczepy guzów mózgu wewnątrzczaszkowych pobierać od uśpionych zwierząt w celu oceny morfologicznych i molekularnych efektów terapii; w tym celu zaleca się całkowitą resekcję mózgu w momencie eutanazji, z zachowaniem wyciętego organu do dalszych analiz.
Podczas gdy poprzednia prezentacja odnosiła się konkretnie do badań nad guzami mózgu, przedstawione koncepcje można z pewnością uogólnić na inne nowotwory u ludzi, które nadają się do modelowania ortotopowego u gryzoni.

<table><tbody><tr><td>Skalpele jednorazowe</td><td>Feather Safety Razor Co, Ltd.</td><td>2975</td><td>Nr 21</td></tr><tr><td>Podkładka grzewcza</td><td>Dunlap</td><td>HP950</td><td></td></tr><tr><td>Gaza</td><td>Fisher Scientific</td><td>22028563</td><td></td></tr><tr><td>Patyczki bawełniane</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-100</td><td></td></tr><tr><td>2% chlorheksydyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC975695</td><td></td></tr><tr><td>3% nadtlenek wodoru</td><td>Fisher Scientific</td><td>H312P-4</td><td></td></tr><tr><td>Igła 25G</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>mikrostrzykawka Hamilton Sharp 10 µl</td><td>Hamilton Co</td><td>20734</td><td></td></tr><tr><td>Zszywacz skórny i zszywki</td><td>Stoelting Co.</td><td>59020</td><td></td></tr><tr><td>Steryotaksyczny stelaż</td><td>Stoelting Co.</td><td>51725</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie Living Image</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/Living%20Image%20Software" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-lucyferyna</td><td>Biotechnologia złota</td><td>LUCK-1G</td><td>Sól potasu</td></tr><tr><td>Xenogen Lumina</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/IVIS%20Series" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Caliper Life Sciences</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

tworzenie wewnątrzczaszkowych ksenograftów guzów mózgu z późniejszą analizą wzrostu guza i odpowiedzi na terapię z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego

Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging

Modele transplantacyjne z wykorzystaniem ludzkich komórek guzów mózgu pełnią od wielu lat kluczową funkcję w badaniach nad neuroonkologią. W przeszłości najczęściej stosowaną procedurą tworzenia ludzkich ksenograftów nowotworowych było pobieranie komórek z kolb hodowlanych, a następnie podskórne wstrzykiwanie zebranych komórek myszom z niedoborem odporności. Choć podejście to wciąż jest często stosowane w wielu laboratoriach, w ciągu ostatniej dekady nastąpiła istotna zmiana akcentów w kierunku tworzenia ksenograftów ortotopowych, co w przypadku guzów mózgu wymaga wstrzyknięcia komórek nowotworowych do odpowiednich struktur neuroanatomicznych. Ponieważ tworzenie ksenograftów wewnątrzczaszkowych uniemożliwia monitorowanie wzrostu guza poprzez bezpośredni pomiar, na przykład za pomocą suwmiarki, zmiana podejścia na rzecz ortotopowych modeli ksenograftów guzów mózgu wymusiła zastosowanie obrazowania nieinwazyjnego do oceny masy guza u zwierząt gospodarzy. spośród obecnie dostępnych metod obrazowania, monitorowanie bioluminescencyjne jest powszechnie uważane za oferujące najlepsze połączenie czułości, szybkości i kosztów. W niniejszym materiale zaprezentujemy procedury tworzenia ortotopowych guzów mózgu oraz monitorowania wzrostu nowotworu i odpowiedzi na leczenie podczas testowania terapii eksperymentalnych.

Ksenoprzeszczepy ludzkich guzów mózgu zmodyfikowane lucyferazą mogą być tworzone wewnątrzczaszkowo u myszy atymicznych, z późniejszym monitorowaniem wzrostu guza i odpowiedzi na terapię za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. W połączeniu z analizą przeżywalności, monitorowanie bioluminescencyjne stanowi niezbędne narzędzie badawcze w badaniach przedklinicznych terapii rozważanych w leczeniu guzów mózgu.

Tworzenie wewnątrzczaszkowych ksenograftów guzów mózgu z późniejszą analizą wzrostu guza i odpowiedzi na terapię z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego

Modele transplantacyjne z wykorzystaniem ludzkich komórek guzów mózgu od wielu lat pełnią kluczową funkcję w badaniach nad neuroonkologią. W przeszłości najczęstszym...

Przez wiele lat modele transplantacyjne z wykorzystaniem ludzkich komórek nowotworowych mózgu opierały się głównie na iniekcjach podskórnych u myszy z niedoborem odporności. Ostatnio nastąpiło przejście w stronę iniekcji do odpowiedniej struktury anatomicznej: mózgu.W niniejszym artykule wideo przedstawiono sposób indukowania guzów wewnątrzczaszkowych u myszy z wykorzystaniem metody iniekcyjnej, w której w czaszce wykonuje się otwór, a następnie za pomocą igły wstrzykuje się komórki nowotworowe zmodyfikowane do obrazowania bioluminescencyjnego. Po zabiegu monitoruje się tempo wzrostu guza oraz odpowiedź na leczenie. Dzięki zastosowaniu stacji do obrazowania bioluminescencyjnego, analizy przeżywalności oraz analiz histopatologicznych i ekspresji białek, uzyskane dane mogą zostać wykorzystane do oceny skuteczności eksperymentalnych terapii guzów mózgu.Ta metoda może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie neuroonkologii, takie jak kwestia tego, czy środek przeciwnowotworowy jest w stanie przeniknąć do mózgu. Zastosowanie tej techniki ma znaczenie dla terapii guzów mózgu u pacjentów, ponieważ traktujemy ludzkie guzy mózgu wyhodowane w organizmie zwierzęcia. Pracując pod laminarnym dygestorium do hodowli tkanek, przygotuj komórki guza podskórnego do przeniesienia do przestrzeni wewnątrzczaszkowej.Zacznij od umieszczenia wyciętych guzów z boku ciała w naczyniach do hodowli tkankowej. Za pomocą skalpela rozdrobnij tkankę. Następnie, używając pipety, mechanicznie rozbij tkankę, aby utworzyć zawiesinę agregatów komórkowych.Następnie przepuść zawiesinę agregatów komórkowych przez sitko z nylonowym filtrem o oczkach 70 µm i zbierz ją do probówki z okrągłym dnem. Powtórz ten proces łącznie trzy razy, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek odpowiednią do iniekcji wewnątrzczaszkowej. Odwiruj zawiesinę przy 1000 RPM przez 10 minut w temperaturze 4 °C; po wirowaniu odessij nadosad, a następnie zawieś osad komórkowy w odpowiedniej objętości medium bezsurowiczego, aby uzyskać końcowe stężenie robocze jako alternatywę dla dysagregacji guzów podskórnych.Komórki nowotworowe można pozyskać z hodowli komórkowych zawierających ustalone linie komórkowe nowotworów mózgu. Pozyskanie komórek odbywa się poprzez trypsynizację i wirowanie.Po wirowaniu i resuspensji, zawiesić komórki w odpowiedniej objętości DMEM bez surowicy do iniekcji nadnamiotowych wykonywanych ręcznie. Przygotować od 3 do 5 × 10⁵ komórek w 3 µL. Zdezynfekować pole operacyjne, spryskując wszystkie powierzchnie 2% chlorheksydyną.Następnie należy umieścić w polu operacyjnym następujące materiały: podkładkę grzewczą do utrzymania temperatury ciała myszy, dwie małe płytki Petriego (jedną z 3% nadtlenkiem wodoru, a drugą z 2% chlorheksydyną), sterylne gaziki i patyczki bawełniane, sterylne jednorazowe skalpele oraz autoklawowaną zszywaczkę chirurgiczną.Po znieczuleniu myszy mieszaniną ketaminy i ksylazyny, kilkukrotnie przemyj obszar operacyjny za pomocą sterylnych gazików nasączonych chlorheksydyną. Nakładaj żel, aby utrzymać odpowiednią wilgotność podczas procedury. Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj cięcie strzałkowe nad kością potyliczną o długości około jednego centymetra.Używając patyczka kosmetycznego nasączonego 3% roztworem nadtlenku wodoru, oczyść odsłoniętą powierzchnię czaszki. Na tym etapie bgma powinna być widoczna, aby umożliwić wykonanie otworu do wstrzyknięcia komórek nowotworowych. Użyj sterylnej ostrej igły o rozmiarze 25 G, aby przebić czaszkę.Dwa milimetry na prawo od bgma i jeden milimetr przed szwem wieńcowym. Wymieszać zawartość zawiesiny komórkowej poprzez delikatne opukiwanie. Nabrać do strzykawki pożądaną ilość zawiesiny komórkowej.Należy unikać tworzenia pęcherzyków powietrza. Zewnętrzną stronę strzykawki należy oczyścić tamponem z alkoholem, aby usunąć wszelkie przylegające komórki. Pomoże to zapobiec powstawaniu i wzrostowi dodatkowych guzów poza obszarem czaszki, co pokazano tutaj, aby zapewnić osiągnięcie odpowiedniej głębokości wstrzyknięcia.W przypadku nieużywania stereotaktycznego aparatu dla małych zwierząt, należy użyć skalpela, aby odciąć trzy milimetry z ostrego końca końcówki pipety P 20. Odcinek końcówki należy umieścić na strzykawce, aby ograniczyć głębokość wstrzyknięcia i zapewnić, by igła strzykawki znajdowała się trzy milimetry od spodu czaszki. Kolejny krok procedury jest prawdopodobnie najtrudniejszym aspektem całej metody podczas wykonywania następującego wstrzyknięcia; osiągnięcie odpowiedniej głębokości i precyzyjne podanie substancji są niezwykle istotne, aby zapewnić ustanowienie i wzrost guza w prawidłowej lokalizacji w mózgu.Następnie należy umieścić strzykawkę prostopadle do czaszki w otworze i powoli wstrzyknąć zawiesinę komórek. Wstrzykiwanie objętości większych niż zalecane może spowodować cofanie się komórek nowotworowych przez kanał igły, co prowadzi do wzrostu guza w tkankach otaczających zamiast wewnątrzczaszkowo. Jak pokazano tutaj, niewłaściwy kąt wprowadzenia strzykawki może skutkować wstrzyknięciem komórek do komór mózgowia i następczym rozprzestrzenieniem ich do kanału kręgowego, co jest widoczne tutaj po zakończeniu iniekcji.Pozostaw igłę w miejscu przez kolejną minutę, a następnie powoli ją wycofaj. Kroki te pomogą zapobiec refluksowi guza. Oczyść czaszkę 3% nadtlenkiem wodoru i wysusz.Używając sterylnego patyczka bawełnianego, nanieś sterylną wosk kostny do otworu za pomocą pęsety. Zbliż brzegi skóry głowy nad czaszką, dociskając do siebie skórę właściwą z obu stron (warstwą wewnętrzną do wewnętrznej) i zszyj zszywaczem.Następnie należy oczyścić skórę głowy za pomocą chlorheksydyny. Podaj buprenorfinę w zastrzyku podskórnym w celu uśmierzenia bólu pooperacyjnego. Choć nie pokazano tego tutaj, buprenorfina jest szybko wchłaniana.Przejdź do wstrzykiwania kolejnych myszy. Należy mieszać komórki pomiędzy iniekcjami, aby zachować odpowiednie stężenie wśród osobników w serii wstrzykiwań. W celu zapewnienia statystycznie istotnych wyników zaleca się stosowanie grup badawczych składających się z co najmniej ośmiu osobników.Monitoruj wszystkie myszy po operacji aż do momentu, gdy zaczną się poruszać i odzyskają normalną aktywność. Zazwyczaj czas rekonwalescencji wynosi około 30 minut, a obserwacje rozpoczynają się tydzień po wstrzyknięciu komórek nowotworowych. Ilościowe obrazowanie bioluminescencyjne (QBLI) należy przeprowadzać raz lub dwa razy w tygodniu.Tutaj.Badanie QBLI przeprowadza się przy użyciu stacji obrazowania IVIS Lumina oraz oprogramowania Living Image w wersji 3.2. Z menu Start systemu Windows należy wybrać program Living Image. Po uruchomieniu programu należy kliknąć przycisk Initialize IVIS System w panelu sterowania kamerą.Po inicjalizacji pole statusu temperatury powinno być zielone, co wskazuje, że kamera CCD jest odpowiednio przygotowana; należy umieścić znieczuczoną mysz z wstrzykniętą lucyferazą na stole komory obrazowania. Otwórz jeden z zapisanych plików z sesji obrazowania i zmień sposób wyświetlania danych obrazu z wartości liczbowych (counts) na fotony. Aby określić liczbę fotonów na sekundę sygnału docelowego, wybierz ikonę koła z rozwijanego menu ROI.Wokół sygnału docelowego powinien pojawić się obszar zainteresowania, oznaczony jako ROI. Sygnał należy wprowadzić do pliku Excel, w którym wskazano numer zwierzęcia oraz dzień obrazowania. Powtórz tę sekwencję dla wszystkich zwierząt analizowanych podczas sesji obrazowania.Po określeniu liczby fotonów dla każdej obrazowanej myszy i przeniesieniu wartości fotonów do pliku Excel, należy przekształcić odczyty luminescencji w wartości znormalizowane, dzieląc luminescencję każdej myszy uzyskaną w trakcie i po zakończeniu schematu terapeutycznego przez odpowiadającą jej maksymalną luminescencję przed rozpoczęciem leczenia. Aby przeprowadzić analizę przeżywalności przy użyciu oprogramowania Prism, należy zastosować estymator KAPLANA-Meiera w celu wygenerowania wykresów przeżywalności i oszacowania mediany czasu przeżycia.Różnice między krzywymi przeżywalności są porównywane z użyciem testu log-rank. Eutanazję zwierzęcia należy przeprowadzić, jeśli u zwierzęcia wystąpi znaczny spadek stanu zdrowia, w szczególności w przypadku utraty masy ciała przekraczającej 20% maksymalnej masy. Szybko wypreparuj mózg myszy z uśmierconego zwierzęcia, a następnie umieść mózg w formalinie w celu późniejszej analizy morfologii guza i immunohistochemii.Ten przykład przedstawia średnie znormalizowane wartości luminescencji dla myszy, którym podano wewnątrzczaszkowo komórki nowotworowe, a terapię erlotynibem rozpoczęto w 34. dniu. Słupki błędów oznaczają błąd standardowy. Znacząca różnica w średniej znormalizowanej luminescencji jest widoczna w pierwszym punkcie czasowym obrazowania po rozpoczęciu terapii. W większości przypadków różnica w średniej luminescencji grup wykazuje dalszy wzrost w kolejnych punktach czasowych.Aktywność przeciwnowotworowa indukowana terapią, wykazana za pomocą QBLI, wiąże się z odpowiadającą jej istotną różnicą w przeżywalności. Jak w tym przypadku, barwienie hematoksyliną i eozyną przekrojów mózgu myszy zatopionych w parafinie pokazuje wzorzec rozkładu komórek nowotworowych. P10 jest markerem często powiązanym z odpowiedzią nowotworu na inhibicję EGFR. Tutaj.Widać, że komórki nowotworowe poddane działaniu preparatu są pozbawione ekspresji P 10, co objawia się brakiem brązowego barwienia. Tutaj przedstawiono przekrój mózgu myszy zatopionego w parafinie. Komórki guza mózgu wrażliwe na inhibitor EGFR można zidentyfikować po brązowym barwieniu EGFR.Jak Państwo widzieli, najtrudniejszym aspektem tej procedury jest prawidłowa iniekcja komórek nowotworowych. Jakie dalsze eksperymenty można przeprowadzić z wykorzystaniem tej metody, na przykład w celu zbadania wpływu modyfikacji genetycznych komórek nowotworowych na ich wzrost? To wszystko.Mam nadzieję, że ta prezentacja okazała się pomocna. Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

establishing-intracranial-brain-tumor-xenografts-with-subsequent

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ustanowienie ksenograftów guzów mózgu z kolejną analizą wzrostu guza i odpowiedzi na terapię za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego

Opisano metodę niezawodnego przeszczepiania ludzkich komórek złośliwego guza pochewki nerwów obwodowych znakowanych lucyferazą do nerwu kulszowego myszy z niedoborem odporności. Omówiono również wykorzystanie obrazowania bioluminescencyjnego do wykazania prawidłowego przyjęcia przeszczepów nowotworowych oraz kryteria losowego przydziału zwierząt do grup badawczych.

Ortotopowe ksenoprzeszczepy ludzkich komórek złośliwego guza osłonki nerwów obwodowych znakowanych lucyferazą do testowania potencjalnych środków terapeutycznych in vivo

Obrazowanie bioluminescencyjne aktywności czynnika indukowanego hipoksją-1α jest stosowane do monitorowania rozwoju hipoksji guza wewnątrzczaszkowego w mysim modelu przerzutów raka piersi do mózgu.

In vivo obrazowanie bioluminescencyjne dynamiki niedotlenienia guza w przerzutach raka piersi do mózgu w modelu mysim

Dośródczaszkowa implantacja komórek GL261 u myszy C57BL/6 powoduje powstanie złośliwych glejaków, które odzwierciedlają wiele cech charakterystycznych dla ludzkiego wielopostaciowego glejakaa. Wykorzystaliśmy komórki GL261 stabilnie wykazujące ekspresję lucyferazy, co pozwoliło nam zastosować obrazowanie in vivo do śledzenia progresji guza. Przedstawiono procedurę chirurgiczną oraz trójwymiarowe obrazowanie in vivo.

Implantacja wewnątrzczaszkowa z następującym obrazowaniem bioluminescencyjnym 3D in vivo glejaków mysich

Opisujemy zintegrowaną metodę precyzyjnej implantacji stereotaktycznej ludzkich komórek wielopostaciowego glejaka do mózgów myszy nago oraz następującego po niej seryjnego obrazowania in vivo w celu monitorowania wzrostu i odpowiedzi na leczenie powstałych ksenograftów.

Stereotaktyczna implantacja wewnątrzczaszkowa i obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ksenoprzeszczepów guzów w mysim modelu glioblastoma multiforme

Źródło: Ciraku, L., et. al. Model wycinka mózgu ex vivo do badania i celowania we wzrost guza przerzutowego do mózgu raka piersi. J. Vis. Exp. (2021). Ten film pokazuje obrazowanie komórek nowotworowych wyrażających lucyferazy w organotypowym wycinku mózgu myszy. Lucyferyna jest dodawana do pożywki, a płytkę umieszcza się w komorze systemu obrazowania in vivo. Parametry przechwytywania obrazu są dostosowywane, a kształt i rozmiar guza są definiowane. Następnie rejestrowane są sygnały...

Obrazowanie bioluminescencyjne w celu oceny wzrostu guza w organotypowym wycinku mózgu myszy

Źródło: Clark, A.J., et al. Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia obrazowanie bioluminescencyjne w celu śledzenia progresji glejaka w immunokompetentnym modelu myszy, przy użyciu komórek nowotworowych eksprymujących lucyferazy i lucyferyny do nieinwazyjnego ilościowego określenia wzrostu guza.

Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego mysiego modelu glejaka

Mózg to unikalne miejsce o cechach, które nie są dobrze reprezentowane przez analizy in vitro lub ektopowe. Ortotopowe modele myszy z powtarzalną lokalizacją i charakterystyką wzrostu można niezawodnie tworzyć za pomocą wstrzyknięć wewnątrzczaszkowych przy użyciu stereotaktycznego przyrządu do fiksacji i niskociśnieniowej pompy strzykawkowej.

Tworzenie anatomicznie dokładnych i odtwarzalnych ksenoprzeszczepów wewnątrzczaszkowych ludzkich guzów mózgu

Komórki glejaka GL261 dostarczają użytecznego immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka. Celem tego protokołu jest zademonstrowanie właściwych technik monitorowania wzrostu guza wewnątrzczaszkowego za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo oraz zweryfikowanie użyteczności komórek GL261 zmodyfikowanych lucyferazą do badania immunologii guza i podejść immunoterapeutycznych w leczeniu glejaka.

Obrazowanie bioluminescencyjne immunokompetentnego modelu zwierzęcego glejaka

Fluorescencyjna tomografia molekularna do obrazowania in vivo ksenoprzeszczepów glejaka

Opracowanie ortotopowych modeli guzów mózgu u dzieci wymaga skrupulatnej precyzji, przy użyciu urządzenia stereotaktycznego do precyzyjnego wszczepiania komórek nowotworowych. Przedstawiona tutaj metodologia przedstawia etapy związane z przygotowaniem komórek guza mózgu, wykonywaniem iniekcji wewnątrzczaszkowych i wdrażaniem systemu monitorowania pooperacyjnego w celu oceny wszczepienia guza mózgu.

Opracowanie ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów dla guzów mózgu przy użyciu urządzenia stereotaktycznego

Celem tego protokołu jest dostarczenie badaczom wysoce powtarzalnej techniki implantacji czaszkowych.

Steryotatyczna wewnątrzczaszkowa implantacja linii komórek xenotransplantatu pochodzenia pacjenckiego z glioblastomu u myszy

Poznaj metodę wewnątrzczaszkowych ksenoprzeszczepów guza mózgu u myszy z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego. Technika umożliwia monitorowanie wzrostu guza i odpowiedzi na terapię w badaniach przedklinicznych neuroonkologii.

Ustalanie wewnątrzczaszkowych ksenoprzeszczepów guza mózgu z późniejszą analizą wzrostu guza i odpowiedzi na terapię za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (Wideo) | JoVE Journal

Tworzenie wewnątrzczaszkowych ksenograftów guzów mózgu z późniejszą analizą wzrostu guza i odpowiedzi na terapię z wykorzystaniem obrazowania bioluminescencyjnego

Przeglądaj więcej filmów