Fotokonwersja oczyszczonych białek fluorescencyjnych i optyczne wyróżnianie z użyciem podwójnej sondy w żywych komórkach

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wykorzystanie białek fluorescencyjnych M orange oraz two andron do dwusondowego optycznego wyróżniania w celu selektywnego znakowania czterech poszczególnych populacji komórek lub przedziałów komórkowych. Osiąga się to najpierw poprzez naświetlanie komórek światłem wzbudzającym o niskiej intensywności o długości fali 488 nanometrów, aby wygasić całą zieloną fluorescencję drawn per. W drugim kroku komórki są eksponowane na światło wzbudzające o wysokiej intensywności o długości fali 488 nanometrów, co powoduje fotokonwersję fluorescencji m orange na czerwoną.

Następnie komórki poddaje się dwufotonowemu wzbudzeniu światłem o długości 800 nanometrów w celu aktywacji fluorescencji dualnej. Ponownie uzyskano wyniki wykazujące, że możliwe jest znakowanie komórek w czterech odrębnych kombinacjach w oparciu o optyczne wyróżnianie za pomocą podwójnej sondy z M Orange two oraz drawn ppa. Główną zaletą tej procedury w porównaniu z istniejącymi eksperymentami, takimi jak frakcjonowanie subkomórkowe, jest to, że jest ona przeprowadzana na żywych komórkach.

Niniejsza procedura może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórek beta, takie jak przyczyna wydzielania tylko niewielkiej frakcji pęcherzyków insulinowych. Chociaż procedura ta pozwala na lepsze zrozumienie funkcji komórek beta, może ona zostać zastosowana również w innych systemach, na przykład do śledzenia komórek nowotworowych in vivo. Próbka kropel białka fluorescencyjnego składa się z emulsji wodnej w układzie oktalnym, w której białko fluorescencyjne znajduje się w fazie wodnej.

Emulsję tę umieszcza się pomiędzy szkiełkiem przedmiotowym a kwadratowym szkiełkiem nakrywkowym o boku 22 mm w celu zastosowania w mikroskopii. Przed rozpoczęciem tej procedury szkiełka przedmiotowe i nakrywki muszą zostać oczyszczone i pokryte środkiem hydrofobowym. Szkło należy oczyścić, myjąc je przez pięć minut w acetonie.

Po myciu pozostaw szkło do wyschnięcia na powietrzu. Następnie przygotuj 2% roztwór metylotrimetoksysilanu w acetonie i zanurz w nim szkło na dwie minuty w celu powlekania. Po powleczeniu wyjmij szkło z roztworu i pozostaw do wyschnięcia.

Następnie opłucz szkło 70% ethanol z butelki z atomizerem. Po opłukaniu pozostaw szkło do ponownego wyschnięcia na powietrzu i usuń wszelkie pozostałości cieczy. Po przedmuchaniu sprężonym powietrzem pokryte szkło można przechowywać przez co najmniej miesiąc.

Po przygotowaniu szkła laboratoryjnego należy pobrać białka fluorescencyjne, które zostały wcześniej oczyszczone jako białka z tagiem His z E. coli. Zmierz widmo absorbancji oczyszczonego białka. Przygotuj roztwór stokowy o gęstości optycznej około 0.1 w roztworze soli buforowanej Tris o pH 8 zawierającym 0.1% albuminy surowicy bydlęcej.

Dodatkowo, w probówce stożkowej o pojemności 15 ml przygotować 10 ml mieszaniny oktanu i roztworu soli buforowanej triss (TBS) w stosunku 1:1 i wymieszać energicznie. Po zmieszaniu pozostawić mieszaninę do całkowitego rozdzielenia faz. Górna faza to oktan; aby przygotować emulsję, pipetować 45 µl oktanu oraz 5 µl białka fluorescencyjnego do probówki typu Eppendorf.

Kilkukrotnie stuknij probówkę, aby rozpocząć tworzenie emulsji, a następnie poddaj ją sonikacji przez 30 sekund w kąpieli ultradźwiękowej. W międzyczasie przygotuj powleczoną szkiełko przedmiotowe i szkiełko nakrywkowe po sonikacji. Emulsja powinna być całkowicie mętna.

Natychmiast nanieś pipetą 4 µL emulsji z centralnej części probówki na powlekone szkiełko przedmiotowe i przykryj je powlekanym szkiełkiem nakrywnym. Emulsja powinna równomiernie rozprowadzić się między szkiełkiem przedmiotowym a nakrywką. Próbka powinna ustabilizować się w ciągu kilku minut.

Poniższa procedura stanowi ogólną strategię przygotowania eksperymentu fotokonwersji białek fluorescencyjnych przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego. Procedurę tę można zastosować zarówno w przypadku oczyszczonych białek, jak i żywych komórek. W niniejszym eksperymencie, jako ogólny punkt wyjścia dla doświadczenia z fotokonwersją, wykorzystana zostaje próbka w postaci kropli zawierającej oczyszczone białko m orange two.

Skonfiguruj konfokalny skaningowy mikroskop laserowy w następujący sposób. Użyj obiektywu olejowego 40 x 1,3 z aperturą numeryczną oraz rozmiar obrazu 512 na 512 pikseli. Ustaw czas przebywania wiązki na pikselu na 6 µs, zoom na 4 i zwiększ otwór pinhole tak, aby uzyskać rozdzielczość w osi Z wynoszącą 3 µm.

Skonfiguruj dwa kanały detekcji dla fluorescencji początkowej i po fotokonwersji, a także kanał fotokonwersji. Obserwuj pomarańczowe formy, używając światła wzbudzenia o długości 561 nanometrów, i zbieraj fluorescencję w zakresie od 570 do 630 nanometrów. Wykrywaj czerwone formy po fotokonwersji, używając światła wzbudzenia o długości 633 nanometrów, i zbieraj fluorescencję w zakresie od 640 do 700 nanometrów.

W przypadku kanału fotokonwersji należy wybrać linię lasera 488 nm i zbierać fluorescencję w zakresie od 490 do 540 nm. Kanał fotokonwersji nie jest ściśle wymagany, ale może okazać się pomocny. Aby rozpocząć eksperyment, należy użyć kanału detekcji do obrazowania początkowej fluorescencji przy ciągłym skanowaniu, w celu dostosowania mocy lasera oraz wzmocnienia detektora dla uzyskania optymalnej jakości obrazu.

Następnie aktywuj kanał fotokonwersji i wybierz niską moc lasera. Rozpocznij obrazowanie serii time-lapse i stopniowo zwiększaj moc lasera do fotokonwersji, aż do zaobserwowania znacznego wyblaknięcia początkowej fluorescencji. Kontynuuj skanowanie, dopóki początkowa fluorescencja nie zostanie wyblaknięta w około 75%.

Następnie należy dezaktywować kanał konwersji fotochromowej i aktywować kanał detekcji fluorescencji po konwersji. Rozpocznij obrazowanie przy wysokim wzmocnieniu detektora i niskiej mocy lasera. Następnie stopniowo zwiększaj moc lasera, aż do momentu wykrycia fluorescencji po konwersji.

Po wykryciu sygnału należy dostosować moc lasera oraz detekcję lub wzmocnienie w celu uzyskania optymalnej jakości obrazu. Na koniec należy zoptymalizować moc lasera wykorzystywanego do fotokonwersji, a także czas jego trwania. Zwiększenie mocy lasera przyspieszy tempo fotokonwersji.

Jednak zbyt duża moc lasera spowoduje fotoblaknięcie białka. Po ustaleniu optymalnych parametrów fotokonwersji, mocy oraz czasu trwania naświetlania laserem, wartości te można wykorzystać do konfiguracji standardowego modułu fotoblaknięcia lub modułu odzyskiwania fluorescencji po fotoblaknięciu. Wówczas kanał fotokonwersji nie będzie już wymagany ze względu na właściwości spektralne przesunięcia ku czerwieni M orange two.

Można go stosować w połączeniu z zielonym fotoprzełączalnym białkiem fluorescencyjnym rysunku PU w celu dwuczujnikowego optycznego podkreślania. Aby rozpocząć dwuczujnikowe optyczne podkreślanie, należy hodować komórki HeLa w szalkach z dnem typu mat tech, a 24 godziny przed obrazowaniem przeprowadzić transfekcję komórek plazmidami kodującymi białka fluorescencyjne, stosując standardową metodę transfekcji LIPECTOMY 2000.

Umieść żywe komórki na konfokalnym mikroskopie skaningowym i skonfiguruj go do fotokonwersji M orange two zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie skonfiguruj mikroskop do fotoprzełączania DPA. DPA jest wzbudzane światłem o długości 488 nanometrów, a jego fluorescencję można obrazować przy użyciu kanału fotokonwersji M orange two.

Należy zadbać o zminimalizowanie mocy lasera używanego do obrazowania MPA, ponieważ zbyt wysoka moc lasera spowoduje inaktywację mpa. Należy dodać kanał dla fotoaktywacji MPA przy użyciu dwufotonowej ekscytacji 800 nm, a następnie określić moc lasera wymaganą do obrazowania fotoaktywacji oraz fotoinaktywacji fluorescencji OFA.

Jednym z najtrudniejszych aspektów tej procedury jest inaktywacja RPA bez fotokonwersji M orange. Dzieje się tak, ponieważ oba procesy zachodzą przy tej samej długości fali. Aby temu zapobiec, niezwykle ważne jest dokładne zoptymalizowanie procesu fotokonwersji.

Moc i czas trwania impulsu lasera. Należy zachować ostrożność, ponieważ fotokonwersja mOrange2 oraz inaktywacja PU zachodzą podczas wzbudzenia światłem o długości fali 488 nanometr; dąży się do inaktywacji PU bez znaczącej fotokonwersji mOrange2. Po ustaleniu parametrów fotokonwersji mOrange2 oraz fotoprzełączania DPA należy zastosować niższą moc lasera.

Możliwe jest zastosowanie optycznego podkreślania za pomocą podwójnej sondy. Najpierw należy dezaktywować fluorescencję DPA w całym polu widzenia, stosując niską moc wzbudzenia przy 488 nanometrach. Następnie należy wybrać obszar zainteresowania i przekształcić m orange two, stosując wysoką moc wzbudzenia przy 488 nanometrach.

Na koniec należy wybrać obszar zainteresowania i aktywować fluorescencję DPA, wykorzystując dwufotonową ekscytację o długości fali 800 nanometrów. Próbki kropli białka fluorescencyjnego są idealnie dopasowane do konfiguracji zastosowań fotokonwersji w mikroskopii konfokalnej. Po prawidłowym przygotowaniu próbki krople wydają się bardzo jednorodne.

Jednakże, gdy próbka jest przygotowywana bez pokrycia szkiełka przedmiotowego szkiełkiem nakrywką, krople mają tendencję do spłaszczania się przeciwko jednej z powierzchni szklanych w przygotowanych preparatach. W przypadku braku 0.1%BSA białko fluorescencyjne wykazuje tendencję do gromadzenia się na jednym z interfejsów woda-olej. Utworzenie halo fotokonwersji fluorescencji jest krytycznie zależne od mocy lasera oraz czasu ekspozycji.

Zbyt duża moc lasera lub zbyt długi czas ekspozycji spowodują fotoblaknięcie, co prowadzi do zmniejszenia intensywności przekonwertowanej fotochemicznie fluorescencji czerwonej. Wyraźne właściwości spektralne M orange two oraz PHO umożliwiają jednoczesne optyczne wyróżnienie obu sond przed fotokonwersją; komórki wykazujące ekspresję M orange two, histony H2B oraz DPA mito wykazują fluorescencję pomarańczową w jądrze oraz fluorescencję zieloną w mitochondriach. Gdy cała fluorescencja zostaje wyłączona przy niskiej mocy wzbudzenia 488 nm, następuje minimalna fotokonwersja M orange.

M orange two można następnie poddać fotokonwersji do koloru czerwonego przy użyciu wysokiej mocy wzbudzenia 488 nanometrów. Po fotokonwersji M orange two, fluorescencję drawn puff można ponownie aktywować, stosując dwufotonowe wzbudzenie 800 nanometrów. Dzięki optycznemu podkreślaniu za pomocą podwójnej sondy komórki mogą być znakowane na cztery różne sposoby.

Zastosowanie tej techniki pozwala na specyficzne znakowanie czterech różnych populacji komórek. Jak Państwo widzieli, jednym z najtrudniejszych aspektów tej procedury jest inaktywacja MPA bez fotokonwersji m orange. Po opanowaniu tej metody można przeprowadzać dalsze eksperymenty z wykorzystaniem tego systemu, na przykład śledzenie wielu populacji w komórkach beta trzustki.

To już wszystko. Mam nadzieję, że ta prezentacja okazała się pomocna. Życzę powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.