Name: Fotokonwersja oczyszczonych białek fluorescencyjnych i optyczne podświetlanie za pomocą podwójnej sondy w żywych komórkach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-26T23:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Poznaj metodę fotokonwersji białek fluorescencyjnych mOrange2 i Dronpa w żywych komórkach. Technika podwójnej sondy umożliwia selektywne etykietowanie czterech populacji komórkowych w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Mike’owi W. Davidsonowi (Florida State University) za udostępnienie plazmidowego DNA kodującego białka fluorescencyjne. Praca ta była finansowana z grantu National Institutes of Health GM72048 (przyznanego D.W.P.).

1. Przygotowanie próbek kropel białek fluorescencyjnych
Próbka kropli białka fluorescencyjnego składa się z emulsji 1-oktanolu z wodą, w której faza wodna zawiera białko fluorescencyjne. Emulsja ta jest umieszczona pomiędzy szkiełkiem przedmiotowym a kwadratowym szkiełkiem zakrywowym o boku 22 mm w celu zastosowania w mikroskopii.
<ol>
<li>Przed przygotowaniem próbek kropel białka fluorescencyjnego należy oczyścić szkiełka przedmiotowe i nakrywkowe oraz pokryć je środkiem hydrofobowym.</li>
<li>Szklane elementy należy oczyścić, myjąc je przez 5 minut w acetonie, a następnie pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. (Opcjonalnie, po czyszczeniu szklane elementy można poddać 30-sekundowej obróbce w oczyszczaczu plazmowym, aby uzyskać optymalne wyniki powlekania).</li>
<li>Należy przygotować 2% roztwór metylotrimetoksysilanu w acetonie i powlec szklane elementy podczas 2-minutowej inkubacji w tym roztworze. Po powleczeniu należy wyjąć szklane elementy z roztworu i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu. Następnie należy je opłukać 70% etanolem z butelki z rozpylaczem i ponownie pozostawić do wyschnięcia. (Opcjonalnie, na tym etapie szklane elementy można wyprać przez 1 godzinę w temperaturze 80°C, aby kowalencyjnie związać powłokę z powierzchnią szkła). Powlekane elementy szklane można przechowywać przez co najmniej miesiąc.</li>
<li>Białka fluorescencyjne są oczyszczane jako białka z znacznikiem His6 z E. Coli 1. Należy zmierzyć widmo absorbancji oczyszczonego białka i przygotować roztwór zapasowy o gęstości optycznej ~0,1 w buforze STE (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA), zawierającym 0,1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Dodatkowo należy przygotować 10 ml mieszaniny 1-oktanolu i buforu STE w stosunku 1:1 w 15 ml probówce stożkowej i energicznie wymieszać. Po zmieszaniu należy pozostawić do całkowitego rozdzielenia faz. Faza górna to 1-oktanol. (Uwaga: Ze względu na silny zapach 1-oktanolu ważne jest stosowanie zamkniętego pojemnika na odpady dla wszystkiego, co miało kontakt z 1-oktanolem).</li>
<li>Aby przygotować emulsję, należy nalać do probówki do wirówki 45 μl 1-oktanolu i 5 μl białka fluorescencyjnego. Kilkakrotnie postukać w probówkę palcem, aby zainicjować tworzenie emulsji, a następnie poddać probówkę działaniu ultradźwięków przez 30 sekund w myjce ultradźwiękowej. W tym czasie należy przygotować powlekone szkiełko przedmiotowe i nakrywkę. Po sonikacji emulsja powinna być całkowicie mętna. Natychmiast po sonikacji należy nanieść 4 μl emulsji ze środka probówki na powlekone szkiełko przedmiotowe i przykryć powleczoną nakrywką.</li>
<li>Jeśli procedura zostanie wykonana prawidłowo, emulsja powinna równomiernie rozprzestrzenić się między szkiełkiem przedmiotowym a nakrywką. W ciągu kilku minut próbka powinna stać się stabilna, składając się z fluorescencyjnych kropel o grubości ~10 μm i zróżnicowanej średnicy. Największe krople znajdują się blisko centrum próbki, a mniejsze są zlokalizowane bliżej krawędzi.</li>
</ol>
 2. Przygotowanie eksperymentu fotokonwersji
 Poniższa procedura stanowi ogólną strategię przygotowania eksperymentu fotokonwersji białek fluorescencyjnych. Procedura ta może być stosowana zarówno w przypadku oczyszczonych białek, jak i żywych komórek.
 <ol>
 <li>Następujące parametry stanowią ogólny punkt wyjścia do konfiguracji eksperymentu fotokonwersji: 
 obiektyw imersyjny 40x 1.3NA 
 Rozmiar obrazu = 512 x 512 pikseli 
 Zoom skanowania = 4 
 
 Czas ekspozycji piksela = 6 μsec. 
 Rozdzielczość Z (wielkość otworu pinhole) = 3 μm</li>
 <li>Skonfiguruj dwa kanały detekcji dla fluorescencji początkowej i fotokonwertowanej, a także „kanał fotokonwersji”. W tym przykładzie zastosujemy oczyszczone białko mOrange2, które jest fotokonwertowalnym białkiem fluorescencyjnym zmieniającym barwę z pomarańczowej na czerwoną. Postać pomarańczowa jest wykrywana przy wzbudzeniu 561 nm, a fluorescencję zbiera się w zakresie od 570 nm do 630 nm. Fotokonwertowana postać czerwona jest wykrywana przy wzbudzeniu 633 nm, a fluorescencję zbiera się w zakresie od 640 nm do 700 nm. Dla „kanału fotokonwersji” wybierz wzbudzenie 488 nm i zbieraj fluorescencję w zakresie od 490 nm do 540 nm. (Uwaga: obrazowanie kanału fotokonwersji nie jest ściśle wymagane).</li>
 <li>Użyj kanału do obrazowania fluorescencji początkowej z ciągłym skanowaniem, aby dostosować moc lasera i wzmocnienie detektora w celu uzyskania optymalnej jakości obrazu.</li>
 <li>Aktywuj kanał fotokonwersji i wybierz niską moc lasera. Rozpocznij obrazowanie serii time-lapse i stopniowo zwiększaj moc lasera do fotokonwersji, aż zaobserwowany zostanie znaczny bleaching fluorescencji początkowej. Kontynuuj skanowanie, dopóki fluorescencja początkowa nie zostanie wybielona w około 75%.</li>
 <li>Dezaktywuj kanał fotokonwersji i aktywuj kanał detekcji dla fluorescencji fotokonwertowanej. Rozpocznij obrazowanie przy wysokim wzmocnieniu detektora i niskiej mocy lasera, a następnie stopniowo zwiększaj moc lasera, aż do wykrycia fluorescencji fotokonwertowanej. Po wykryciu fluorescencji fotokonwertowanej można dostosować moc lasera i wzmocnienie detektora dla uzyskania optymalnej jakości obrazu.</li>
 <li>Na koniec należy zoptymalizować moc lasera używaną do fotokonwersji oraz czas trwania fotokonwersji. Zwiększenie mocy lasera do fotokonwersji przyspieszy tempo konwersji, jednak zbyt wysoka moc lasera spowoduje fotobleaching białka.</li>
 <li>Po ustaleniu optymalnej mocy i czasu trwania lasera do fotokonwersji, parametry te można wykorzystać do konfiguracji standardowego modułu fotobleachingu lub FRAP, a „kanał fotokonwersji” nie będzie już wymagany.</li>
</ol>
 3. Optyczne podkreślanie z użyciem dwóch sond: mOrange2 i Dronpa
 Ze względu na przesunięte w stronę czerwieni właściwości widmowe, mOrange2 może być stosowane w połączeniu z zielonym fotoprzełączalnym białkiem fluorescencyjnym Dronpa do dwusondowego optycznego podkreślania, co umożliwia selektywne wyróżnienie 4 oddzielnych populacji komórek (organelli).
 <ol>
 <li>Komórki hoduje się w naczyniach MatTek z szklanym dnem i transfekuje na 24 godziny przed obrazowaniem, stosując standardową procedurę transfekcji Lipofectamine20001.</li>
 <li>Należy przygotować mikroskop do fotokonwersji mOrange2 zgodnie z opisem w sekcji 2.</li>
 <li>Skonfiguruj mikroskop do fotoprzełączania Dronpa. Fluorescencję Dronpa można obrazować, korzystając z „kanału fotokonwersji” mOrange2 (patrz krok 2.2). (Uwaga: Należy zminimalizować moc lasera używanego do obrazowania Dronpa, ponieważ zbyt wysoka moc spowoduje inaktywację Dronpa). Dodaj kanał do fotoaktywacji Dronpa. Do fotoaktywacji stosujemy dwufotonowe wzbudzanie 800 nm, ale można to również osiągnąć za pomocą wzbudzania 405 nm. Określ moc lasera wymaganą do obrazowania, fotoaktywacji i fotoinaktywacji fluorescencji Dronpa.</li>
 <li>Ostrzeżenie: Fotokonwersja mOrange2 oraz inaktywacja Dronpa zachodzą podczas wzbudzania 488 nm. Ze względu na wysoką moc lasera wymaganą do fotokonwersji mOrange2, doprowadzi to również do inaktywacji fluorescencji Dronpa. Z drugiej strony, inaktywacja Dronpa zachodzi już przy znacznie niższej mocy lasera i może być przeprowadzona bez istotnej fotokonwersji mOrange2.</li>
 <li>Po ustawieniu parametrów fotokonwersji mOrange2 i fotoprzełączania Dronpa, optyczne wyróżnianie podwójną sondą uzyskuje się w następujących krokach. Po pierwsze, inaktywuj fluorescencję Dronpa w całym polu widzenia, stosując wzbudzanie 488 nm o niskiej mocy. Po drugie, wybierz obszar zainteresowania (ROI) i przeprowadź fotokonwersję mOrange2 przy użyciu wzbudzania 488 nm o wysokiej mocy. Na koniec wybierz obszar zainteresowania, aby aktywować fluorescencję Dronpa.</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig1.jpg" alt="Analiza obrazowania mikroskopii konfokalnej fuzji pęcherzyków, schemat przedstawiający struktury lipidowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 1"> Rysunek 1. Przygotowanie próbki kropelkowej. A) Prawidłowo przygotowana próbka kropelkowa. B) Próbka przygotowana bez powlekania szkiełka przedmiotowego i nakrywki. C) Próbka przygotowana bez dodania 0,1% BSA.
<img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig2.jpg" alt="Wykres fluorescencji fotokonwersji; widma emisji pomarańczowej i czerwonej; analiza danych; wyniki naukowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Wpływ mocy i czasu trwania lasera fotokonwersyjnego na fotokonwersję mOrange2. Pojedyncze kropelki zawierające białko mOrange2 były poddawane ciągłej fotokonwersji przy użyciu różnych poziomów mocy lasera 488 nm. Względna moc lasera zastosowana do fotokonwersji wynosiła 10% (linia ciągła), 25% (linia przerywana) i 100% (linia kropkowana). A) Pomarańczowe gatunki fluorescencyjne. B) Fotokonwertowane czerwone gatunki fluorescencyjne.
<img src="/files/ftp_upload/1995/1995fig3.jpg" alt="Obrazowanie komórek, mikroskopia fluorescencyjna, struktury komórkowe w kolorze zielonym, pomarańczowym, czerwonym; wyniki mikroskopii." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Podwójne optyczne podkreślanie z użyciem mOrange2 i Dronpa. A) Komórka wykazująca ekspresję mOrange2-Histone H2B oraz Dronpa-Mito przed fotokonwersją, wykazująca pomarańczową fluorescencję w jądrze i zieloną fluorescencję w mitochondriach. B) Fluorescencja Dronpa została wyłączona przy użyciu wzbudzenia 488 nm o niskiej mocy, co spowodowało minimalną fotokonwersję mOrange2. C) mOrange2 uległo fotokonwersji do koloru czerwonego przy użyciu wzbudzenia 488 nm o wysokiej mocy. D) Fluorescencja Dronpa została ponownie włączona za pomocą dwufotonowego wzbudzenia 800 nm. Panele stanowią nałożenie obrazów fluorescencyjnych na obraz z kontrastem różnicowym (DIC).

<ol><li>Kremers, G. J., Hazelwood, K. L., Murphy, C. S., Davidson, M. W., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoconversion+in+orange+and+red+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Photoconversion in orange and red fluorescent proteins.</a> Nature Methods. 6, 355-358 (2009).</li>
</ol>

Brak zadeklarowanych konfliktów interesów.

Oczyszczona próbka białka fluorescencyjnego w formie kropli jest bardzo wygodnym formatem do charakterystyki fotofizycznej białek fluorescencyjnych, na przykład do badania kinetyki fotoblaknięcia i kinetyki fotokonwersji. Ekstremalnie mała objętość kropli (~20 picoliter) ułatwia przeprowadzanie eksperymentów z fotoblaknięciem i fotokonwersją, które mogą być trudne do wykonania w systemach opartych na kuwetach. Ponadto, jak pokazano tutaj, próbka w formie kropli jest idealnie dostosowana do konfiguracji mikroskopu konfoka...

<table><tbody><tr><td>Lamelki do mikroskopu</td><td>VWR international</td><td>48312-003</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka zakrywkowe 22 mm</td><td>Corning</td><td>2940-245</td><td></td></tr><tr><td>1-oktanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4500</td><td></td></tr><tr><td>metylotrimetoksysilan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6420</td><td></td></tr><tr><td>Szalki MatTek</td><td>MatTek Corp.</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr></tbody></table>

fotokonwersja oczyszczonych białek fluorescencyjnych i optyczne wyróżnianie z użyciem podwójnej sondy w żywych komórkach

Photoconversion of Purified Fluorescent Proteins and Dual-probe Optical Highlighting in Live Cells

Fotokonwertowalne białka fluorescencyjne (pc-FPs) to klasa białek fluorescencyjnych o właściwościach „optycznego zakreślacza”, co oznacza, że kolor fluorescencji może ulec zmianie pod wpływem ekspozycji na światło o określonej długości fali. Optyczne zakreślanie umożliwia nieinwazyjne znakowanie subpopulacji cząsteczek fluorescencyjnych, dzięki czemu jest idealną metodą do śledzenia pojedynczych komórek lub organelli.
Krytycznymi parametrami dla wydajnej fotokonwersji są natężenie oraz czas ekspozycji na światło fotokonwersyjne. Jeśli natężenie jest zbyt niskie, fotokonwersja będzie przebiegać powoli lub w ogóle nie zajdzie. Z drugiej strony, zbyt duże natężenie lub zbyt długa ekspozycja mogą doprowadzić do fotoblaknięcia białka, co zmniejszy wydajność fotokonwersji.
Niniejszy protokół opisuje ogólne podejście do konfiguracji konfokalnego mikroskopu skaningowego do zastosowań w fotokonwersji pc-FP. W pierwszej kolejności opisujemy procedurę przygotowania próbek w formie kropel oczyszczonego białka. Taka forma próbki jest bardzo wygodna do badania właściwości fotofizycznych białek fluorescencyjnych pod mikroskopem. Następnie wykorzystamy próbkę w formie kropli białka, aby pokazać, jak skonfigurować mikroskop do fotokonwersji. Na koniec zaprezentujemy, jak przeprowadzić optyczne uwydatnianie (optical highlighting) w żywych komórkach, w tym podwójne optyczne uwydatnianie z użyciem mOrange2 oraz Dronpa.

Niniejszy protokół opisuje ogólne podejście do przeprowadzania fotokonwersji białek fluorescencyjnych przy użyciu konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego. Opisujemy procedury fotokonwersji oczyszczonych próbek białek, a także optycznego uwydatniania z użyciem dwóch sond w żywych komórkach z wykorzystaniem mOrange2 i Dronpa.

Fotokonwersja oczyszczonych białek fluorescencyjnych i optyczne wyróżnianie z użyciem podwójnej sondy w żywych komórkach

Fotokonwertowalne białka fluorescencyjne (pc-FP) to klasa białek fluorescencyjnych o właściwościach „optycznego zakreślacza”, co oznacza, że kolor...

Ogólnym celem następującego eksperymentu jest wykorzystanie białek fluorescencyjnych M orange i two andron do dwuprobowej optycznej wyróżniarki w celu selektywnego znakowania czterech oddzielnych populacji komórek lub przedziałów komórkowych. Osiąga się to poprzez najpierw naświetlanie komórek światłem wzbudzającym o niskiej intensywności o długości fali 488 nanometr, aby wyłączyć całą zieloną fluorescencję drawn per. W drugim kroku komórki poddaje się działaniu światła wzbudzającego o długości fali 488 nanometr o wysokiej intensywności, co powoduje fotokonwersję fluorescencji m orange na czerwoną.Następnie komórki poddaje się dwufotonowej ekscytacji o długości fali 800 nm w celu aktywacji fluorescencji dral. Ponownie uzyskano wyniki wykazujące, że możliwe jest znakowanie komórek w czterech odrębnych kombinacjach w oparciu o optyczne wyróżnienie za pomocą podwójnej sondy z M Orange two i drawn ppa. Główną zaletą tej procedury w stosunku do istniejących metod, takich jak frakcjonowanie subkomórkowe, jest to, że jest ona przeprowadzana na żywych komórkach.Niniejsza procedura może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórek beta, takie jak powód, dla którego wydzielana jest tylko niewielka frakcja pęcherzyków z insuliną. Choć procedura ta pozwala na zgłębienie funkcji komórek beta, może ona zostać zastosowana również w innych układach, na przykład do śledzenia komórek nowotworowych in vivo. Próbka kropel białka fluorescencyjnego składa się z emulsji wodnej w układzie oktalnym, w której faza wodna zawiera białko fluorescencyjne.Emulsję tę umieszcza się pomiędzy szkiełkiem przedmiotowym a kwadratowym szkiełkiem nakrywkowym o boku 22 mm do zastosowań mikroskopowych. Przed rozpoczęciem tej procedury szkiełka przedmiotowe i nakrywki muszą zostać oczyszczone i pokryte środkiem hydrofobowym. Szkło należy oczyścić, myjąc je przez pięć minut w acetonie.Po myciu pozostaw szkło do wyschnięcia na powietrzu. Następnie przygotuj 2% roztwór metylotrimetoksysilanu w acetonie i zanurz w nim szkło na dwie minuty. Po pokryciu wyjąć szkło z roztworu i pozwolić mu wyschnąć.Następnie opłucz szklane naczynia 70% ethanolem z butelki z atomizerem. Po opłukaniu pozostaw szkło do ponownego wyschnięcia na powietrzu i usuń pozostałą ciecz. Po użyciu sprężonego powietrza powlekione szkło można przechowywać przez co najmniej jeden miesiąc.Po przygotowaniu szkła laboratoryjnego należy pobrać białka fluorescencyjne, które zostały wcześniej oczyszczone jako białka z tagiem His z bakterii E. coli. Należy zmierzyć widmo absorbancji oczyszczonego białka. Następnie należy przygotować roztwór stokowy o gęstości optycznej wynoszącej około 0,1 w buforze Tris-saline o pH 8 zawierającym 0,1% albuminy surowicy bydlęcej.Dodatkowo, w 15 ml probówce stożkowej przygotuj 10 ml mieszaniny octanu i roztworu soli buforowanej triss w stosunku 1:1, a następnie wymieszaj energicznie. Po wymieszaniu odstaw mieszaninę do czasu całkowitego rozdzielenia faz. Górna faza to octan; aby przygotować emulsję, pipetuj 45 µL octanu i 5 µL białka fluorescencyjnego do probówki typu Eppendorf.Kilkakrotnie stuknij probówkę, aby rozpocząć tworzenie emulsji, a następnie poddaj ją sonikacji przez 30 sekund w kąpieli ultradźwiękowej. W międzyczasie przygotuj powleczone szkiełko przedmiotowe i szkiełko nakrywkowe do użycia po sonikacji. Emulsja powinna stać się całkowicie mętna.Natychmiast nanieś pipetą 4 µL emulsji z części środkowej probówki na powlekone szkiełko przedmiotowe i przykryj je powlekanym szkiełkiem nakrywką. Emulsja powinna równomiernie rozprzestrzenić się między szkiełkiem przedmiotowym a nakrywką. Próbka powinna ustabilizować się w ciągu kilku minut.Poniższa procedura przedstawia ogólną strategię przygotowania eksperymentu fotokonwersji białek fluorescencyjnych z wykorzystaniem konfokalnego skaningowego mikroskopu laserowego. Procedurę tę można zastosować zarówno w przypadku białek oczyszczonych, jak i żywych komórek. W niniejszym eksperymencie, jako ogólny punkt wyjścia dla procesu fotokonwersji, wykorzystano próbkę w postaci kropli zawierającej oczyszczone białko m orange two.Skonfiguruj konfokalny skaningowy mikroskop laserowy w następujący sposób. Użyj obiektywu imersyjnego olejowego 40x o aperturze numerycznej 1,3 oraz rozmiaru obrazu 512 na 512 pikseli. Ustaw czas przebywania wiązki na piksel na 6 µs podczas skanowania, powiększenie (zoom) na 4 i zwiększ otwór pinhole tak, aby odpowiadał rozdzielczości w osi Z wynoszącej 3 µm.Skonfiguruj dwa kanały detekcji dla fluorescencji początkowej i po fotokonwersji, a także kanał fotokonwersji. Obserwuj formę pomarańczową, wykorzystując światło wzbudzenia o długości 561 nanometrów, i zbieraj fluorescencję w zakresie od 570 do 630 nanometrów. Wykrywaj formę czerwoną po fotokonwersji, wykorzystując światło wzbudzenia o długości 633 nanometrów, i zbieraj fluorescencję w zakresie od 640 do 700 nanometrów.W kanale fotokonwersji należy wybrać linię lasera 488 nm i zbierać fluorescencję w zakresie od 490 do 540 nm. Kanał fotokonwersji nie jest ściśle wymagany, ale może być pomocny. Aby rozpocząć eksperyment, należy użyć kanału detektora do obrazowania początkowej fluorescencji przy ciągłym skanowaniu, aby dostosować moc lasera i wzmocnienie detektora w celu uzyskania optymalnej jakości obrazu.Następnie aktywuj kanał fotokonwersji i wybierz niską moc lasera. Rozpocznij obrazowanie serii time-lapse i stopniowo zwiększaj moc lasera do fotokonwersji, aż do zaobserwowania znacznego wygaszenia początkowej fluorescencji. Kontynuuj skanowanie, dopóki początkowa fluorescencja nie zostanie wygaszona w około 75%.Następnie dezaktywuj kanał konwersji fotochemicznej i aktywuj kanał detekcji fluorescencji po konwersji. Rozpocznij obrazowanie przy wysokim wzmocnieniu detektora i niskiej mocy lasera. Następnie stopniowo zwiększaj moc lasera, aż do momentu wykrycia fluorescencji po konwersji.Po wykryciu sygnału należy dostosować moc lasera oraz detekcję lub wzmocnienie (gain) w celu uzyskania optymalnej jakości obrazu. Na koniec należy zoptymalizować moc lasera wykorzystywanego do fotokonwersji, a także czas jego trwania. Zwiększenie mocy lasera przyspieszy tempo fotokonwersji.Jednakże zbyt duża moc lasera spowoduje fotoblaknięcie białka. Po ustaleniu optymalnej konwersji fotochemicznej, mocy oraz czasu trwania naświetlania laserem, parametry te można wykorzystać do skonfigurowania standardowego modułu fotoblaknięcia lub modułu odzyskiwania fluorescencji po fotoblaknięciu. Wówczas kanał konwersji fotochemicznej nie będzie już wymagany ze względu na właściwości spektralne przesunięcia ku czerwieni M orange two.Można go stosować w połączeniu z zielonym przełączalnym światłem białkiem fluorescencyjnym rysunku PU w celu podwójnego optycznego wyróżnienia sondy. Aby rozpocząć podwójne optyczne wyróżnianie sondy, należy hodować komórki HeLa w szalkach z matową szklaną podstawą, a następnie transfekować komórki plazmidami kodującymi białka fluorescencyjne na 24 godziny przed obrazowaniem, stosując standardową transfekcję LIPECTOMY 2000.Umieść żywe komórki w konfokalnym mikroskopie skaningowym i skonfiguruj go do fotokonwersji M orange two zgodnie z wcześniejszym opisem. Następnie skonfiguruj mikroskop do fotoprzełączania DPA. DPA jest wzbudzane światłem o długości 488 nanometrów, a jego fluorescencję można obrazować przy użyciu kanału fotokonwersji M orange two.Należy zadbać o zminimalizowanie mocy lasera używanej do obrazowania MPA, ponieważ zbyt wysoka moc lasera spowoduje inaktywację mpa. Dodaj kanał dla fotoaktywacji MPA, wykorzystując dwufotonową ekscytację przy 800 nanometrach; następnie określ moc lasera wymaganą do obrazowania fotoaktywacji oraz fotoinaktywacji fluorescencji OFA.Jednym z najtrudniejszych aspektów tej procedury jest inaktywacja RPA bez fotokonwersji M orange, ponieważ oba te procesy zachodzą przy tej samej długości fali. Aby temu zapobiec, bardzo ważne jest dokładne zoptymalizowanie procesu fotokonwersji.Moc i czas trwania impulsu lasera. Należy zachować ostrożność, ponieważ fotokonwersja mOrange2 oraz inaktywacja PU zachodzą podczas wzbudzania światłem o długości fali 488 nm; dąży się do inaktywacji PU bez znaczącej fotokonwersji mOrange2. Po ustaleniu parametrów fotokonwersji mOrange2 oraz fotoprzełączania DPA należy stosować niższą moc lasera.Możliwe jest zastosowanie optycznego podkreślania za pomocą podwójnej sondy. Najpierw należy wygasić fluorescencję DPA w całym polu widzenia, stosując wzbudzanie falą o długości 488 nanometrów i niskiej mocy. Następnie należy wybrać obszar zainteresowania i przekształcić m orange two, stosując wzbudzanie falą o długości 488 nanometrów i wysokiej mocy.Na koniec należy wybrać obszar zainteresowania i aktywować fluorescencję DPA, wykorzystując dwufotonową ekscytację o długości fali 800 nanometrów. Próbki kropli białka fluorescencyjnego są idealne do konfigurowania zastosowań fotokonwersji w mikroskopii konfokalnej. Gdy próbka kropli zostanie przygotowana prawidłowo, krople wydają się bardzo jednorodne.Jednakże, gdy próbka jest przygotowywana bez nakładania szkiełka podstawowego i nakrywki, krople w przygotowanych próbkach mają tendencję do spłaszczania się przeciwko jednej z powierzchni szklanych. W przypadku braku 0,1% BSA białko fluorescencyjne wykazuje tendencję do gromadzenia się na jednym interfejsie woda-olej. Tworzenie halo konwersji fotonowej fluorescencji jest krytycznie zależne od mocy lasera oraz czasu naświetlania.Zbyt duża moc lasera lub zbyt długi czas ekspozycji spowodują fotobleaching, co doprowadzi do zmniejszenia intensywności fotokonwertowanej fluorescencji czerwonej. Wyraźne właściwości spektralne mOrange2 i PHO umożliwiają podwójne optyczne wyróżnienie sond przed fotokonwersją; komórki wykazujące ekspresję mOrange2, histony H2B i DPA mito wykazują fluorescencję pomarańczową w jądrze oraz fluorescencję zieloną w mitochondriach. Gdy cała fluorescencja zostaje wyłączona przy niskiej mocy wzbudzenia 488 nm, fotokonwersja mOrange jest minimalna.M orange two można następnie poddać fotokonwersji do koloru czerwonego przy użyciu wysokoenergetycznego wzbudzenia o długości fali 488 nanometrów. Po dokonaniu fotokonwersji M orange two, fluorescencję drawn puff można ponownie aktywować, stosując dwufotonowe wzbudzenie o długości fali 800 nanometrów. Dzięki optycznemu wyróżnianiu za pomocą podwójnej sondy komórki mogą być znakowane na cztery różne sposoby.Dzięki zastosowaniu tej techniki możliwe jest specyficzne znakowanie czterech różnych populacji komórek. Jak zauważono, jednym z najtrudniejszych aspektów tej procedury jest inaktywacja MPA bez fotokonwersji m orange. Po opanowaniu tej metody można przeprowadzać dalsze eksperymenty z wykorzystaniem tego systemu, na przykład śledzenie wielu populacji w komórkach beta trzustki.To wszystko. Mam nadzieję, że ta prezentacja okazała się przydatna. Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

photoconversion-purified-fluorescent-proteins-dual-probe-optical

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fotokonwersja oczyszczonych białek fluorescencyjnych i dwukanałowe świetlne podświetlanie w żywych komórkach

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Niniejszy protokół opisuje sposób obrazowania oddziaływań białko-białko z wykorzystaniem testu bliskości opartego na FRET.

Obrazowanie oddziaływań białko-białko in vivo

Wykorzystując system obrazowania z dwufotonową mikroskopią o rozdzielczości spektralnej, uzyskano mapy wydajności transferu energii rezonansowej Förstera (FRET) na poziomie pikseli dla komórek ekspresujących receptory błonowe, w których przypuszcza się tworzenie kompleksów homo-oligomerycznych. Na podstawie map wydajności FRET możliwe jest oszacowanie informacji stechiometrycznych dotyczących badanego kompleksu oligomeru.

In vivo ilościowe oznaczanie oddziaływań receptorów sprzężonych z białkiem G z wykorzystaniem spektroskopowo rozdzielczej mikroskopii dwufotonowej

Mikroskopia poklatkowa markerów autofagii znakowanych fluorescencyjnie umożliwia monitorowanie dynamicznej odpowiedzi autofagii z wysoką rozdzielczością czasową. Korzystając ze specyficznych markerów autofagii i organelli w kombinacji 3 różnych kolorów, możemy śledzić wkład białka w tworzenie autofagosomów w solidnym kontekście przestrzennym i czasowym.

Obrazowanie na żywych komórkach wczesnych zdarzeń autofagii: omegasomy i nie tylko

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Opisujemy metody obrazowania, których używamy do badania dystrybucji i ruchliwości transfekowanych białek fluorescencyjnych rezydujących w retikulum endoplazmatycznym (ER) za pomocą konfokalnego obrazowania żywych komórek. Analizujemy również ultrastrukturalnie wpływ ich ekspresji na architekturę tego przedziału subkomórkowego.

Wizualizacja subdomen retikulum endoplazmatycznego w hodowanych komórkach

Badania biomolekuł in vivo są kluczowe dla zrozumienia funkcji molekularnej w kontekście biologicznym. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę pozwalającą na internalizację biomolekuł fluorescencyjnych, takich jak DNA czy białka, do żywych mikroorganizmów. Przedstawiono i omówiono również analizę danych in vivo zarejestrowanych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Internalizacja i obserwacja biomolekuł fluorescencyjnych w żywych mikroorganizmach za pomocą elektroporacji

Tutaj prezentujemy protokół wielokolorowej lokalizacji pojedynczych białek błonowych w organellach żywych komórek. Do przyłączania fluoroforów stosuje się białka samoznakujące. Białka, znajdujące się w różnych przedziałach błonowych tych samych organelli, mogą być lokalizowane z precyzją ~18 nm.

Wielobarwna mikroskopia lokalizacyjna białek jednobłonowych w organellach żywych komórek ssaków

Förster Resonance Energy Transfer (FRET) pomiędzy dwiema cząsteczkami fluoroforu może być wykorzystany do badania interakcji białek w żywej komórce. W tym miejscu przedstawiono protokół pomiaru FRET w żywych komórkach poprzez wykrywanie uczulonej emisji akceptora i wygaszanie cząsteczki donorowej za pomocą konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej.

Ocena interakcji białek w żywych komórkach z emisją uwrażliwioną na FRET

Prezentujemy eksperymentalny protokół i proces analizy danych do przeprowadzenia dwukolorowej spektroskopii korelacji krzyżowej fluorescencji (FCCS) na żywo w połączeniu z transferem energii rezonansowej Förster (FRET) w celu zbadania dynamiki receptorów błonowych w żywych komórkach przy użyciu nowoczesnych technik znakowania fluorescencji.

Dwukolorowa spektroskopia korelacji krzyżowej fluorescencji w celu zbadania interakcji białko-białko i dynamiki białek w żywych komórkach

Ten protokół opisuje spersonalizowane znakowanie fluorescencyjne oparte na przeciwciałach i wstrzykiwanie do wczesnych zarodków Drosophila, aby umożliwić obrazowanie na żywo białek o niskiej obfitości lub modyfikacji potranslacyjnych, które są trudne do wykrycia przy użyciu tradycyjnych metod GFP/mCherry-tag.

Wizualizacja białek o niskiej liczebności i modyfikacji potranslacyjnych w żywych zarodkach Drosophila poprzez wstrzyknięcie przeciwciał fluorescencyjnych

Poznaj metodę fotokonwersji białek fluorescencyjnych mOrange2 i Dronpa w żywych komórkach. Technika podwójnej sondy umożliwia selektywne etykietowanie czterech populacji komórkowych w czasie rzeczywistym.

Fotokonwersja oczyszczonych białek fluorescencyjnych i optyczne wyróżnianie z użyciem podwójnej sondy w żywych komórkach

Przeglądaj więcej filmów