Name: Techniki obrazowania sygnalizacji Ca2+ w plemnikach ludzkich (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-16T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Poznaj techniki obrazowania sygnałów wapniowych w plemnikach ludzkich przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej time-lapse. Ta metoda pozwala badać dynamikę jonów Ca²⁺ w pojedynczych komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Praca ta jest finansowana przez Wellcome Trust, The Medical Research Council, The Royal Society, Birmingham Science City oraz The Infertility Research Trust. Chcielibyśmy podziękować firmie Cairn Research za specjalistyczną pomoc przy budowie i integracji systemów obrazowania.

Plemniki od zdrowych, płodnych mężczyzn z prawidłowym wynikiem analizy nasienia są zazwyczaj przygotowywane do obrazowania w następujący sposób.
<ol>
<li> Próbki nasienia przechowuje się w temperaturze 37°C nie dłużej niż przez 30 min. Komórki izoluje się z osocza nasiennego metodą swim-up w suplementowanym zrównoważonym roztworze soli Earle'a (sEBSS; mM: 1,8 CaCl2.2H2O, 5,37 KCl, 0,81 MgSO4.7H2O, 26,2 NaHCO3, 1,0 NaH2PO4.2H2O, 116,4 NaCl, 55,6 D-glukozy, 2,73 pirowinianu sodu, 41,8 mleczanu sodu) uzupełnionym o 0,3% BSA frakcji V odtłuszczonej węglem aktywnym/wolnej od kwasów tłuszczowych (jakość BSA jest kluczowa dla pomyślnej kapacytacji plemników). 1 ml sEBBS pipetuje się do każdej z serii probówek o objętości 5 ml i delikatnie podkłada 0,3 ml nasienia. Po inkubacji przez 1 godzinę (37°C; 6% CO2) z każdej probówki delikatnie pobiera się górne 0,7 ml i łączy. 10 μl zawiesiny plemników rozcieńcza się 90 μl 1% (v/v) formaliny w celu unieruchomienia komórek, a następnie plemniki zlicza się w komorze Neubauera. Gęstość komórek w zawiesinie dostosowuje się następnie (za pomocą sEBSS) do poziomu 6 milionów komórek/ml.</li>
<li> Próbkę dzieli się następnie na alikwoty po 200 μl w probówkach z luźnymi nakrętkami i inkubuje (37°C; 6% CO2) przez 5-6 h, aby umożliwić kapacytację.</li>
<li> Szkiełka nakrywkowe (22x50 mm) były wcześniej traktowane poli-D-lizyną. 10 μl roztworu poli-D-lizyny (10% w/v) nanosi się w postaci serii małych kropli na środek szkiełka nakrywkowego. Następnie pozwala się poli-D-lizynie wyschnąć na powietrzu. Może to odbywać się na podgrzewanym stole i powinno trwać do całkowitego wyschnięcia. Szkiełko nakrywkowe przytwierdza się smarem próżniowym do zamkniętej, specjalnie zaprojektowanej, przepływowej poliwęglanowej komory obrazowej (wymiary 35 mm x 20 mm x 5 mm; pojemność ≈ 180 μl) podobnej do komory Warner RC20. Szkiełko nakrywkowe pokryte poli-D-lizyną stanowi podstawę komory podczas obserwacji komórek pod mikroskopem odwróconym, a okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm tworzy górną powierzchnię komory, umożliwiając przepuszczanie światła.</li>
<li> Do znakowania komórek używa się Oregon Green BAPTA1-AM (OGB) lub Calcium Green 1-AM. OGB przygotowuje się poprzez rozpuszczenie w DMSO. W DMSO dodaje się kwas Pluronic F127 (detergent), aby zapobiec „zbrylaniu się” barwnika. Można go przygotować w laboratorium (100 mg Pluronicu w 0,5 ml DMSO) bezpośrednio przed użyciem lub zakupić w formie gotowej. 20 μl dodaje się do alikwoty 50 μg OGB (2,5 mg/ml). Fiolkę można następnie przechowywać w zamrożeniu i rozmrażać do późniejszego użycia.</li>
<li> Po kapacytacji plemników (5-6 h w sEBBS, 37°C; 6% CO2) wybiera się probówkę do obrazowania i dodaje 1,2 μl roztworu OGB, aby uzyskać końcowe stężenie 10 μM. Probówkę inkubuje się przez kolejne 40 min, po czym zawiesinę komórkową delikatnie wstrzykuje się do wlotu komory obrazowej za pomocą końcówki pipety p1000 (niebieskiej). Komorę umieszcza się w inkubatorze stroną ze szkiełkiem pokrytym poli-D-lizyną do dołu na 20 min. Komórki mają tendencję do pływania wzdłuż powierzchni komory i będą przylegać do obszaru pokrytego poli-D-lizyną.</li>
<li> Komorę montuje się teraz na mikroskopie, podłącza do aparatury perfuzyjnej i perfunduje z prędkością ok. 0,5 ml/min. Pompa perystaltyczna podaje sól fizjologiczną do komory, a nadmiar z portu wyjścia jest usuwany przez pompę ssącą z pułapką. Preparat pozostawia się w ciemności przez co najmniej 10 min, podczas gdy luźne komórki i pozakomórkowy barwnik są usuwane poprzez perfuzję komory. Stabilność temperatury jest niezwykle ważna, ponieważ niewielkie wahania mogą nie tylko wpływać na homeostazę Ca2+ w komórkach, ale mogą również wpływać na Kd barwnika. Eksperymenty zazwyczaj przeprowadza się w temperaturze 25°C, utrzymując temperaturę ciemni na tym poziomie. Stwierdzono, że utrzymanie temperatury pomieszczenia na wymaganym poziomie zapewnia większą stabilność temperatury i ostrości niż stosowanie stołu z kontrolą temperatury lub grzałki z termostatem na wlot soli fizjologicznej.</li>
<li> Komórki obserwuje się pod obiektywem w kontraście fazowym (40x lub 60x imersyjnym) i wybiera obszar do obrazowania. Preferowany jest fragment obszaru pokrytego poli-D-lizyną znajdujący się w pobliżu portu wlotowego, gdzie przepływ soli fizjologicznej jest laminarny i jednolity. Ważne jest również wybranie obszaru o odpowiedniej gęstości komórek (nadmierna gęstość wpływa na jakość i wiarygodność danych poprzez pobieranie sygnału z sąsiednich komórek) oraz takiego, w którym komórki są odpowiednio przytwierdzone, ale aktywność wiciowata jest dostrzegalna. Zapisuje się obraz w kontraście fazowym. Następnie mikroskop przełącza się w tryb fluorescencji (pobudzenie 480 nm; emisja 540 nm) i skraca czas ekspozycji do minimum wymaganego do uzyskania wyraźnego obrazu fluorescencyjnego (zazwyczaj 50-200 ms).</li>
<li> Eksperyment rozpoczyna się poprzez aktywację oprogramowania do akwizycji obrazów w serii czasowej (IQ). Obrazy są zazwyczaj pobierane z częstotliwością 0,1 Hz, a oświetlenie jest ograniczone wyłącznie do okresów akwizycji obrazu za pomocą sterowanej programowo przesłony. Można stosować znacznie wyższe szybkości akwizycji obrazów, ale należy uwzględnić problemy z blaknięciem (bleaching) i generowaniem artefaktów z powodu uszkodzeń fotochemicznych komórek (patrz: dyskusja). IQ (oraz większość innych platform oprogramowania do akwizycji) umożliwia wykresy fluorescencji w czasie rzeczywistym podczas eksperymentu.</li>
<li> Po okresie kontrolnym trwającym od 3 do 5 minut manipulację składnikami soli fizjologicznej (takimi jak [Ca2+]o) i aplikację leków przeprowadza się poprzez wymianę soli fizjologicznej w głowicy perfuzyjnej. Odnotowuje się czas dodania każdego bodźca, aby można było obliczyć czas jego dotarcia do komory obrazowej, co zapewnia wystarczającą dokładność do oceny wolnych reakcji opisanych tutaj (próbkowanych w 0,1 Hz). W przypadku szybszych reakcji większą dokładność można osiągnąć, dodając bodźce bezpośrednio do przepływu soli fizjologicznej poprzez drugi port wlotowy, taki jak w komorze Warner RC20.</li>
<li> Obrazy analizuje się offline za pomocą IQ. Regiony zainteresowania (ROI) wyznacza się wokół każdej komórki (lub części komórki), a także wybiera obszar wolny od komórek (do automatycznego odjęcia tła przez oprogramowanie). Następnie sprawdza się serię obrazów w celu usunięcia komórek, które obumarły lub przeszły reakcję akrosomalną (która objawia się dużym i szybkim wzrostem fluorescencji, a następnie utratą barwnika cytoplazmatycznego) w trakcie eksperymentu oraz tych, które wykazały ruch na tyle duży, by spowodować artefakty podczas analizy w serii czasowej.</li>
<li> Następnie uzyskuje się serię intensywności fluorescencji w czasie dla każdego ROI, a dane te analizuje się offline w programie Excel. Początkowo fluorescencję normalizuje się do wartości średniej uzyskanej w okresie kontrolnym, korzystając z równania R = [ (F - Frest) / Frest] x 100%, gdzie R jest procentową zmianą fluorescencji w porównaniu z okresem kontrolnym, F to intensywność fluorescencji w czasie t, a Frest to średnia z co najmniej 30 pomiarów F uzyskanych w okresie kontrolnym.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
Rycina 1 przedstawia serię obrazów z eksperymentu, w którym komórki stymulowano 3 μM progesteronem. Górny rząd oraz film 1 prezentują obrazy fluorescencyjne w skali szarości, a te same obrazy przedstawione są poniżej (oraz w filmie 2) w pseudokolorach (tabela lookup '16_colors' w Image J), gdzie kolory „chłodne” wskazują niską intensywność fluorescencji, a kolory „ciepłe” wysoką intensywność fluorescencji. Komórki można obserwować w pseudokolorach podczas eksperymentu, korzystając z tabel lookup w IQ, jednak skala szarości jest zazwyczaj bardziej informatywna przy ocenie, czy komórki zostały prawidłowo oznakowane. Dwa pierwsze obrazy zostały zarejestrowane w 0 s i 100 s po rozpoczęciu rejestracji. Fluorescencja powinna być stabilna i zazwyczaj jest najsilniejsza w obszarze pozaakrozomalnym oraz w szyjce plemnika. Progesteron wprowadzono do komory obrazowania w około 175 s, a 3.rd i 4.th obrazy (180 s i 220 s) wykazują szybki wzrost [Ca2+]i (fluorescencji), rozpoczynający się w tylnej części głowy i obszarze szyjki komórki. Kolejne obrazy wykonano w 290, 360, 740, 990 i 1440 s, co pokazuje zanik początkowego przejściowego wzrostu [Ca2+]i oraz rozwój wtórnego, trwałego podwyższenia stężenia. Rycina 2 przedstawia analizę w arkuszu kalkulacyjnym, przekształcającą surowe wartości fluorescencji dla każdego ROI na znormalizowaną fluorescencję (% zmiany fluorescencji w porównaniu z okresem kontrolnym). Rycina 3 przedstawia wykresy fluorescencji znormalizowane w czasie dla 3 komórek, wykazujące „typowe” reakcje na 3 μM progesteronu.
<img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig1.jpg" alt="Sekwencja time-lapse z mikroskopii fluorescencyjnej pokazująca aktywność neuronów w skali szarości i w pseudokolorach." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Przykład danych z komórki stymulowanej progesteronem. Przedstawiono serię obrazów fluorescencyjnych w skali szarości (górny rząd) i w pseudokolorach (dolny rząd). Punkty czasowe to 0, 180, 220, 290, 360 i 990 s. 3 μM progesteronu wprowadzono do komory obrazowania w 175 s. ROI pokazano na pierwszym panelu. 
<img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig2.jpg" alt="Wykres w programie Excel z analizą danych przedstawiający trendy stężenia w funkcji czasu." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2. Analiza danych fluorescencji pojedynczych komórek w programie Excel. Wartości zaznaczone na czarno to serie czasowe danych fluorescencji, ułożone pionowo. Wartości zaznaczone na czerwono (poniżej) to dane znormalizowane, uzyskane przy użyciu równania podanego w tekście. Wykres przedstawia znormalizowany przebieg fluorescencji w czasie dla komórki 64 w tym doświadczeniu, która po stymulacji wykazuje przejściowy wzrost fluorescencji, po którym następuje powolny wzrost oraz seria niewielkich oscylacji. 
<img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig3.jpg" alt="Wykres przedstawiający widma absorpcji przejściowej; pomiar wzbudzenia optycznego w czasie 2 min." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 3"> Rycina 3. Przebiegi fluorescencji w czasie dla 3 pojedynczych komórek, wyrażone jako % zmiany względem wartości kontrolnej. W czasie wskazanym przez strzałkę dodano 3 μM progesteronu. Linia przerywana przedstawia średnią fluorescencję kontrolną.

<ol><li>Haughland, R. P. Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , 9th Edition, Molecular Probes. Eugene, OR. (2002).</li>
<li>Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stroboscopic+illumination+using+light-emitting+diodes+reduces+phototoxicity+in+fluorescence+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging.</a> Biotechniques. 41, 191-197 (2006).</li>
</ol>

Nie zadeklarowano żadnych konfliktów interesów.

Prawidłowo przeprowadzona technika ta pozwala na rejestrację rozkładu i kinetyki spontanicznych oraz indukowanych sygnałów Ca2+ w ludzkich plemnikach. Odpowiedzi można uzyskać od dużej liczby komórek (do 200), co jest istotne, ponieważ ludzkie plemniki mogą wykazywać znaczną zmienność w zakresie spontanicznych i stymulowanych sygnałów Ca2+. Pomyślne znakowanie oraz przeżywalność komórek podczas rejestracji są w wysokim stopniu zależne od jakości próbki. Próbki słabej jakości skutkują niewłaściwym znakowaniem, słabymi odpowiedziami, a komórki mogą obumrzeć w trakcie rejestracji. Ludzkie plemniki są bardzo wrażliwe na uszkodzenia wywołane światłem, dlatego stosujemy minimalnie niezbędne oświetlenie (zarówno pod kątem natężenia, jak i czasu ekspozycji), aby zmaksymalizować przeżywalność komórek i zminimalizować artefakty wynikające z ich obumarcia. Dużą zaletą jest zastosowanie kamery o wysokiej czułości (umożliwiającej korzystanie z oświetlenia o niskim natężeniu), ponieważ pozwala ona na zarejestrowanie słabej fluorescencji. Szczególnie odpowiednie są kamery EM-CCD z podświetleniem tylnym, choć są one bardzo kosztowne. Oświetlenie LED (zamiast lampy ksenonowej lub rtęciowej z filtrem wzbudzenia) również poprawia przeżywalność komórek (Nishigaki et al, 2006). Nie używamy Fura-2, pomimo oczywistych zalet obrazowania ratiometrycznego, ponieważ Fura wymaga wzbudzenia światłem UV oraz konieczności wykonania dwóch obrazów dla każdego stosunku. W przypadku danych uzyskanych przy użyciu barwników widzialnego światła o pojedynczej długości fali, normalizacja intensywności fluorescencji w dużej mierze rekompensuje różnice w stopniu załadowania barwnika między komórkami, ale nie niweluje różnic w rozkładzie barwnika w obrębie pojedynczej komórki, co należy mieć na uwadze. Choć barwniki o pojedynczej długości fali mogą w zasadzie podlegać kalibracji, dokładność tej techniki jest niska, dlatego nie podejmujemy takiej próby. Podczas gdy dane dotyczące stosunku uzyskane za pomocą Fura-2 (lub barwnika emisyjnego indo), nawet bez kalibracji, dają akceptowalnie wierny obraz względnych zmian [Ca2+]i, intensywność fluorescencji barwników jednofalowych nie jest liniowo powiązana z [Ca2+]i. W najbardziej użytecznej części krzywej nasycenia zależność dla barwników jednofalowych zazwyczaj ma charakter zbliżony do logarytmicznego. Obecnie stosujemy Oregon Green BAPTA-1 (Rysunek 4), ponieważ jest on czuły na niewielkie zmiany [Ca2+]i bliskie poziomom spoczynkowym (50-100 nM). Gdy [Ca2+]i wzrośnie powyżej 1 μM, odpowiedzi będą niedoszacowane pod względem zmiany fluorescencji, a barwnik może ulec nasyceniu. Opcją ulepszenia techniki bez uciekania się do wzbudzania promieniami UV jest podwójne obciążenie komórek barwnikami takimi jak Fluo-3 i Fura red. Oba mogą być wzbudzane przy 488 nM, jednak ich jednoczesne odpowiedzi są bardzo odmienne. Rejestracja emisji przy 540 i 650 nM dostarcza stosunku, który może stanowić lepszą metodę dokładnego monitorowania [Ca2+]i (Haughland, 2002) i może mieć zastosowanie w przypadku plemników (Nisigaki et al, 2006). <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig4.jpg" alt="Wykres emisji fluorescencji w funkcji stężenia wapnia, porównujący dane odpowiedzi dla OGB1 i OGB2." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 4"> Rycina 4. Zależność między wolnym [Ca2+] (nM) a emisją fluorescencji przy maksymalnej długości fali (ok. 525 nm) dla Oregon Green BAPTA-1 i Oregon Green BAPTA-2. OGB1 wykazuje wyższą fluorescencję przy spoczynkowym [Ca2+], ale nasyca się przy niższych poziomach, przez co ma mniejszy zakres użyteczności. Dane do tych wykresów pobrano z podręcznika Molecular Probes (Haughland, 2002).

<table><tbody><tr><td>Kamera do niskich poziomów światła</td><td>QImaging</td><td>Rolera XR</td><td></td></tr><tr><td>Oregon Green BAPTA-1</td><td>Invitrogen</td><td>06807</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>Andor</td><td>IQ</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>National Institutes of Health</td><td>Image J</td><td>Oprogramowanie z domeny publicznej</td></tr><tr><td>System oświetlenia LED</td><td>Cairn Research</td><td>Opto LED</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (20% roztwór w DMSO)</td><td>Invitrogen</td><td>P3000MP</td><td></td></tr></tbody></table>

techniki obrazowania sygnalizacji ca2+ w ludzkich plemnikach

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Mikroskopia fluorescencyjna komórek obciążonych fluorescencyjnym wskaźnikiem Ca²⁺2+barwniki wrażliwe na jony Ca²⁺ są stosowane do pomiaru aspektów przestrzennych i czasowych Ca²⁺2+sygnalizacja w żywych komórkach. W niniejszym opracowaniu opisujemy metodę stosowaną w naszych laboratoriach do obciążania zawiesin plemników ludzkich wskaźnikiem Ca2+-barwniki raportujące i pomiar sygnału fluorescencji podczas stymulacji fizjologicznej. Komórki ruchliwe są izolowane metodą bezpośredniego wypływania (swim-up) i inkubowane w warunkach kapacytacji przez 0-24 h, w zależności od eksperymentu. Przenikająca przez błony komórkowe forma estrowa AM (estry acetoksymetylowe) Ca2+Następnie do aliquoty komórek dodaje się barwnik raportujący i pozostawia na 1 h w celu wniknięcia barwnika do cytoplazmy. Stosujemy barwniki o długości fali w zakresie światła widzialnego, aby zminimalizować fotouszkodzenia komórek, co jednak uniemożliwia rejestrację ratiometryczną. Omówiono zalety i wady tego podejścia. W czasie ładowania komórki wprowadza się do komory obrazowania i pozwala im przywrzeć do szkiełka podstawowego pokrytego poli-D-lizyną. Po zakończeniu okresu ładowania nadmiar barwnika oraz luźne komórki są usuwane poprzez podłączenie komory do aparatu perfuzyjnego. Komorę perfunduje się w sposób ciągły, a następnie do głowicy perfuzyjnej dodaje się bodźce i zmodyfikowane sole fizjologiczne. Eksperymenty są rejestrowane poprzez akwizycję obrazów fluorescencyjnych w trybie time-lapse i analizowane szczegółowo offline poprzez ręczne wyznaczanie obszarów zainteresowania. Dane są normalizowane do poziomów przedbodźcowych w taki sposób, aby dla każdej komórki (lub części komórki) uzyskać wykres przedstawiający Ca2+wynik w postaci procentowej zmiany fluorescencji jest otrzymywany.

Oceniono sygnały [Ca2+]i wywołane bodźcem w pojedynczych ludzkich plemnikach. Ruchome komórki obciążono fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na Ca2+ (metodą estru AM) i unieruchomiono w komorze przepływowej. Obrazowanie komórek przeprowadzono za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej, a stymulację wykonano poprzez medium perfuzyjne. Odpowiedzi pojedynczych komórek (lub obszarów) przeanalizowano offline przy użyciu programu Excel.

Techniki obrazowania sygnalizacji Ca2+ w ludzkich plemnikach

Mikroskopia fluorescencyjna komórek obciążonych fluorescencyjnymi barwnikami wrażliwymi na jony Ca2+ jest wykorzystywana do pomiaru przestrzennych i czasowych aspektów sygnalizacji Ca2+ w ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie serii obrazów unieruchomionych plemników ludzkich znakowanych fluorescencyjnym barwnikiem reporterowym wapnia. Komórki ruchliwe są izolowane z plazmy nasiennej poprzez ich wypłynięcie do medium inkubacyjnego. Po kapacytacji komórki są znakowane fluorescencyjnym wskaźnikiem wapnia, a następnie przenoszone do szczelnej komory obrazującej, która jest zamontowana na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym.Reakcje stężenia jonów wapnia są rejestrowane jako seria obrazów poklatkowych i analizowane w celu wyodrębnienia odpowiedzi pojedynczych komórek. Cześć, jestem Edwin Andres Morales Garcia z laboratorium dr. Stevena J. Public Cova w School of Biosciences na University of Birmingham w Wielkiej Brytanii. Jestem Katherine Nash, również z Public Overlap.Jestem Jennifer Morris z Public Overlap. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę obrazowania wewnątrzkomórkowych odpowiedzi wapniowych w pojedynczych ludzkich plemnikach. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania regulacji aktywności plemników przy użyciu bodźców pochodzących z komórki jajowej oraz dróg rodnych kobiety.Przejdźmy zatem do rozpoczęcia procedury. Próbki nasienia należy przechowywać w temperaturze 37 °C nie dłużej niż przez 30 minut od momentu pobrania, aby wyizolować komórki ruchliwe z plazmy nasiennej. Odmierzyć 1 ml zrównoważonego roztworu soli L'S uzupełnionego o 0,3% BSA, w skrócie S-E-B-S-S, do serii polistyrenowych probówek o okrągłym dnie o pojemności 5 ml. Delikatnie nałożyć 0,3 ml nasienia na warstwę S-E-B-S-S w każdej probówce i lekko zakręcić probówkę.Inkubuj probówki pod kątem 45 stopni przez jedną godzinę w temperaturze 37°C i 6% dwutlenku węgla. Aby umożliwić ruchomym komórkom przedostanie się do S-E-B-S-S, delikatnie odpipetuj górne 0,7 ml roztworu i przenieś roztwór ze wszystkich probówek do czystej, 15 ml polistyrenowej probówki wirówki. Wstrząśnij delikatnie w celu wymieszania, a następnie policz komórki unieruchomione formaliną w nowej komorze liczącej Bowela.Dostosuj stężenie do 6 milionów komórek na mililitr w S-E-B-S-S i podziel plemniki na 200 µl aliquoty w polistyrenowych probówkach o okrągłym dnie o pojemności pięciu mililitrów. Przykryj luźno zakrętkami. Jeśli badana jest odpowiedź komórek poddanych kapacytacji, inkubuj probówki od pięciu do sześciu godzin w temperaturze 37 °C i 6% carbon dioxide, aby umożliwić kapacytację. Na środku szkiełka 22 x 50 mm nanieś 10 µl 10% polylysine w formie kilku małych kropel.Numer jeden szkiełko nakrywki i poczekaj, aż całkowicie wyschnie. Użyj smaru próżniowego, aby przymocować szkiełko nakrywki stroną potraktowaną do góry do komory obrazowania, zbudowanej w tym celu.Dla każdego eksperymentu obrazowania wybierz jedną probówkę z komórkami o nabytym potencjale do zapłodnienia i dodaj 1,2 µL Calcium dependent organ green o stężeniu 2,5 mg/mL rozpuszczonego w DMSO, aby uzyskać stężenie końcowe 10 µM. Inkubuj probówkę przez 40 minut w temperaturze 37 °C i 6% CO2.Używając pipety 200 µL z końcówką P 200, całkowicie usuń cały roztwór z probówki. Napełnij komorę, delikatnie wstrzykując płyn do portu dopływowego. Przechyl komorę tak, aby pęcherzyki powietrza uciekły przez port odpływowy.Umieść całą komorę w inkubatorze i inkubuj przez kolejne 20 minut w temperaturze 37°C i 6% dwutlenku węgla, aby umożliwić przyleganie plemników do poli-D-lizyny. Zamocuj komorę do odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego i podłącz ją do aparatury perfuzyjnej.Pozostaw preparat w ciemności przez co najmniej 10 minut, aby odprowadzić resztki perfuzji. Luźne komórki i macierz zewnątrzkomórkową obserwuj w kontraście fazowym przy powiększeniu 40x lub 60x; wybierz pole widzenia, w którym odstępy między komórkami są wystarczające, aby umożliwić oddzielną ocenę fluorescencji każdej komórki. Komórki powinny być odpowiednio przytwierdzone, ale najlepiej wykazujące wyraźną aktywność tworzenia wypustek (fledger activity).Przełącz mikroskop na zielony kanał fluorescencji. Ustaw czasy ekspozycji na minimum niezbędne do uzyskania wyraźnego obrazu fluorescencyjnego, aby ograniczyć fotoblaknięcie w oprogramowaniu IQ.Uruchom akwizycję obrazów w serii czasowej. Pobieraj obrazy z częstotliwością 0,1 Hz, korzystając z sterowanej programowo migawki w celu ograniczenia oświetlenia. Po początkowym nagraniu w okresie kontrolnym trwającym od trzech do pięciu minut, zmień stężenie wapnia w soli fizjologicznej i podaj leki, wymieniając roztwór soli w głowicy systemu perfuzyjnego.Zanotuj czas dodania każdego bodźca w nagłówku i oblicz czas jego dotarcia do komory, zgodnie z opisem w pisemnej części niniejszego protokołu. Aby przeanalizować obrazy w trybie offline, użyj jednego z narzędzi rysunkowych, aby obrysować obszar zainteresowania lub ROI wokół każdej komórki lub części komórki – w tym przypadku tylnej części głowy plemnika, ponieważ w tym obszarze mobilizowany jest zmagazynowany wapń. Przewijaj pasek suwaka, aby sprawdzić serię obrazów.Zidentyfikuj i usuń komórki, które nie pozostają w pełni w obrębie obszaru ROI, nakładają się na inne komórki lub wykazały gwałtowny wzrost, a następnie gwałtowny spadek intensywności fluorescencji, co jest charakterystyczne dla śmierci komórkowej. Użyj funkcji analizy, aby wygenerować szeregi czasowe intensywności fluorescencji dla każdego ROI. Następnie dane można wyeksportować i przeanalizować w arkuszu kalkulacyjnym.Obrazy te pochodzą z serii uzyskanej podczas stymulacji trzymikromolarnym progesteronem. Dolny rząd został pokryty pseudokolorem. Aby lepiej zilustrować względne zmiany intensywności, w tym miejscu do komory wprowadzono progesteron.Wyniki te zostały przedstawione w formie animowanego filmu poklatkowego. Zauważ gwałtowny wzrost intensywności fluorescencji, po którym następuje powolny wzrost, co wskazuje na odpowiadające temu zmiany poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego. Przedstawione tutaj dane zostały ilościowo określone na podstawie średnich intensywności w tylnej części głowy trzech komórek.W momencie wskazanym strzałką dodano trzy mikromolarną dawkę progesteronu. Linia przerywana przedstawia średnią fluorescencję kontrolną. W dzisiejszym materiale pokazaliśmy, jak izolować komórki wysokiej jakości, ładować je barwnikiem wrażliwym na wapń oraz monitorować odpowiedź poszczególnych komórek na stymulację.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zastosowaniu jak najlepszej populacji komórek, zminimalizowaniu naświetlania komórek w celu uniknięcia fotouszkodzeń oraz wyborze barwnika, który najlepiej odpowiada analizowanym reakcjom. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

techniques-for-imaging-ca2-signaling-in-human-sperm

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Techniki obrazowania sygnalizacji Ca2+ w plemnikach ludzkich

Wewnątrzkomórkowa dynamika Ca2+ jest bardzo ważna w fizjologii plemników, a barwniki fluorescencyjne wrażliwe na Ca2+ stanowią wszechstronne narzędzie do ich badania. Eksperymenty populacyjne (fluorometria i fluorometria zatrzymanego przepływu) oraz eksperymenty z pojedynczymi komórkami (cytometria przepływowa i obrazowanie pojedynczych komórek) są wykorzystywane do śledzenia zmian czasoprzestrzennych [Ca2+] w plemnikach ludzkich.

Pomiar wewnątrzkomórkowych zmian Ca2+ w ludzkich plemnikach przy użyciu czterech technik: fluorometrii konwencjonalnej, fluorometrii zatrzymanego przepływu, cytometrii przepływowej i obrazowania pojedynczych komórek

Tutaj prezentujemy metodologie oceny integralności błony plemników, cechy komórkowej związanej z kompetencją zapłodnienia plemników. Opisujemy trzy techniki fluorymetrycznej oceny błon plemników: jednoczesne barwienie za pomocą specyficznych sond fluorescencyjnych, mikroskopię fluorescencyjną oraz zaawansowaną cytometrię przepływową dedykowaną plemnikom. Przedstawiono również przykłady łączenia metodyk.

Techniki fluorymetryczne do oceny błon plemników

Tutaj opisane są dwa średnioprzepustowe testy do oceny wpływu na sygnalizację Ca2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich. Testy te można wykorzystać do szybkiego i łatwego badania przesiewowego dużych ilości związków pod kątem wpływu na sygnalizację Ca2 + i reakcję akrosomów w ludzkich plemnikach.

Średnioprzepustowe testy przesiewowe do oceny wpływu na sygnalizacjęCa2+ i reakcję akrosomów w plemnikach ludzkich

Protokół ten opisuje, jak przeprowadzać rejestracje elektryczne z komórek plemników ssaków w konfiguracji całej komórki, z celem bezpośredniego rejestrowania aktywności kanałów jonowych. Metoda ta odegrała kluczową rolę w opisie elektrofizjologicznych profili kilku kanałów jonowych plemników i pomogła ujawnić ich tożsamość molekularną oraz regulację.

Rejestrowanie prądów elektrycznych przez błonę plazmatyczną plemników ssaków

Obecny protokół dostarcza praktycznego rozwiązania, które pozwala na pomiar apoptozy, potencjału błony mitochondrialnej i uszkodzeń DNA w plemnikach ludzkich za pomocą pojedynczego cytometru.

Analiza cytometryczna przepływowa biomarkerów do wykrywania wad funkcjonalnych plemników ludzkich

Opisany tutaj model myszy AcroSensE i metody obrazowania żywych komórek dostarczają nowego podejścia do badania dynamiki wapnia w subkomórkowym przedziale akrosomu plemnika i jak regulują one etapy pośrednie prowadzące do fuzji błony i egzocytozy akrosomów.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym akrosomalnej dynamiki wapnia i egzocytozy w żywych plemnikach myszy

Niniejszy artykuł wideo przedstawia krok po kroku sposób przetwarzania próbki nasienia w celu uzyskania wysokiej jakości hybrydyzacji fluorescencyjnej in situ na ludzkich plemnikach. Otrzymane preparaty mogą być wykorzystywane do przesiewowego badania aneuploidii w ramach diagnostyki klinicznej.<br...

Protokół fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) w ludzkich plemnikach

Prąd jonowy kanałów BK rejestruje się przy użyciu technik patch clamp. Kanały BK są eksprymowane w oocytach Xenopus poprzez wstrzykiwanie mRNA. Roztwór wewnątrzkomórkowy podczas pomiarów patch clamp jest kontrolowany przez system perfuzyjny.

Techniki patch clamp i perfuzji do badania kanałów jonowych ekspresowanych w oocytach Xenopus

Opisano wydajną metodę pozwalającą na wizualizację indukcji sygnalizacji Ca2+ w komórkach śródbłonka wywołanej przez pochodne parakrynne ROS. Metoda ta wykorzystuje pomiar mobilizacji Ca2+ wyzwalanej przez pochodne parakrynne ROS w komórkach śródbłonka naczyniowego w modelu kokultury.

Wizualizacja sygnalizacji wazkularnego Ca2+ wywołanej przez ROS pochodzenia parakrynnego

Opisujemy izolację ludzkich miocytów przedsionkowych, które mogą być używane do wewnątrzkomórkowych pomiarów Ca2+ w połączeniu z elektrofizjologicznymi badaniami patch-clamp.

Izolacja ludzkich miocytów przedsionkowych do jednoczesnych pomiarów stanów nieustalonych Ca2+ i prądów błonowych

Poznaj techniki obrazowania sygnałów wapniowych w plemnikach ludzkich przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej time-lapse. Ta metoda pozwala badać dynamikę jonów Ca²⁺ w pojedynczych komórkach.

Techniki obrazowania sygnalizacji Ca²⁺ w ludzkich plemnikach

Przeglądaj więcej filmów