Techniki obrazowania sygnalizacji Ca2+ w ludzkich plemnikach
16 czerwca 2010
Oceniono sygnały [Ca2+]i wywołane bodźcem w pojedynczych ludzkich plemnikach. Ruchome komórki obciążono fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na Ca2+ (metodą estru AM) i unieruchomiono w komorze przepływowej. Obrazowanie komórek przeprowadzono za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej, a stymulację wykonano poprzez medium perfuzyjne. Odpowiedzi pojedynczych komórek (lub obszarów) przeanalizowano offline przy użyciu programu Excel.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie serii obrazów unieruchomionych plemników ludzkich znakowanych fluorescencyjnym barwnikiem reporterowym wapnia. Komórki ruchliwe są izolowane z plazmy nasiennej poprzez ich wypłynięcie do medium inkubacyjnego. Po kapacytacji komórki są znakowane fluorescencyjnym wskaźnikiem wapnia, a następnie przenoszone do szczelnej komory obrazującej, która jest zamontowana na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym.
Reakcje stężenia jonów wapnia są rejestrowane jako seria obrazów poklatkowych i analizowane w celu wyodrębnienia odpowiedzi pojedynczych komórek. Cześć, jestem Edwin Andres Morales Garcia z laboratorium dr. Stevena J. Public Cova w School of Biosciences na University of Birmingham w Wielkiej Brytanii. Jestem Katherine Nash, również z Public Overlap.
Jestem Jennifer Morris z Public Overlap. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę obrazowania wewnątrzkomórkowych odpowiedzi wapniowych w pojedynczych ludzkich plemnikach. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania regulacji aktywności plemników przy użyciu bodźców pochodzących z komórki jajowej oraz dróg rodnych kobiety.
Przejdźmy zatem do rozpoczęcia procedury. Próbki nasienia należy przechowywać w temperaturze 37 °C nie dłużej niż przez 30 minut od momentu pobrania, aby wyizolować komórki ruchliwe z plazmy nasiennej. Odmierzyć 1 ml zrównoważonego roztworu soli L'S uzupełnionego o 0,3% BSA, w skrócie S-E-B-S-S, do serii polistyrenowych probówek o okrągłym dnie o pojemności 5 ml. Delikatnie nałożyć 0,3 ml nasienia na warstwę S-E-B-S-S w każdej probówce i lekko zakręcić probówkę.
Inkubuj probówki pod kątem 45 stopni przez jedną godzinę w temperaturze 37°C i 6% dwutlenku węgla. Aby umożliwić ruchomym komórkom przedostanie się do S-E-B-S-S, delikatnie odpipetuj górne 0,7 ml roztworu i przenieś roztwór ze wszystkich probówek do czystej, 15 ml polistyrenowej probówki wirówki. Wstrząśnij delikatnie w celu wymieszania, a następnie policz komórki unieruchomione formaliną w nowej komorze liczącej Bowela.
Dostosuj stężenie do 6 milionów komórek na mililitr w S-E-B-S-S i podziel plemniki na 200 µl aliquoty w polistyrenowych probówkach o okrągłym dnie o pojemności pięciu mililitrów. Przykryj luźno zakrętkami. Jeśli badana jest odpowiedź komórek poddanych kapacytacji, inkubuj probówki od pięciu do sześciu godzin w temperaturze 37 °C i 6% carbon dioxide, aby umożliwić kapacytację. Na środku szkiełka 22 x 50 mm nanieś 10 µl 10% polylysine w formie kilku małych kropel.
Numer jeden szkiełko nakrywki i poczekaj, aż całkowicie wyschnie. Użyj smaru próżniowego, aby przymocować szkiełko nakrywki stroną potraktowaną do góry do komory obrazowania, zbudowanej w tym celu.
Dla każdego eksperymentu obrazowania wybierz jedną probówkę z komórkami o nabytym potencjale do zapłodnienia i dodaj 1,2 µL Calcium dependent organ green o stężeniu 2,5 mg/mL rozpuszczonego w DMSO, aby uzyskać stężenie końcowe 10 µM. Inkubuj probówkę przez 40 minut w temperaturze 37 °C i 6% CO2.
Używając pipety 200 µL z końcówką P 200, całkowicie usuń cały roztwór z probówki. Napełnij komorę, delikatnie wstrzykując płyn do portu dopływowego. Przechyl komorę tak, aby pęcherzyki powietrza uciekły przez port odpływowy.
Umieść całą komorę w inkubatorze i inkubuj przez kolejne 20 minut w temperaturze 37°C i 6% dwutlenku węgla, aby umożliwić przyleganie plemników do poli-D-lizyny. Zamocuj komorę do odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego i podłącz ją do aparatury perfuzyjnej.
Pozostaw preparat w ciemności przez co najmniej 10 minut, aby odprowadzić resztki perfuzji. Luźne komórki i macierz zewnątrzkomórkową obserwuj w kontraście fazowym przy powiększeniu 40x lub 60x; wybierz pole widzenia, w którym odstępy między komórkami są wystarczające, aby umożliwić oddzielną ocenę fluorescencji każdej komórki. Komórki powinny być odpowiednio przytwierdzone, ale najlepiej wykazujące wyraźną aktywność tworzenia wypustek (fledger activity).
Przełącz mikroskop na zielony kanał fluorescencji. Ustaw czasy ekspozycji na minimum niezbędne do uzyskania wyraźnego obrazu fluorescencyjnego, aby ograniczyć fotoblaknięcie w oprogramowaniu IQ.
Uruchom akwizycję obrazów w serii czasowej. Pobieraj obrazy z częstotliwością 0,1 Hz, korzystając z sterowanej programowo migawki w celu ograniczenia oświetlenia. Po początkowym nagraniu w okresie kontrolnym trwającym od trzech do pięciu minut, zmień stężenie wapnia w soli fizjologicznej i podaj leki, wymieniając roztwór soli w głowicy systemu perfuzyjnego.
Zanotuj czas dodania każdego bodźca w nagłówku i oblicz czas jego dotarcia do komory, zgodnie z opisem w pisemnej części niniejszego protokołu. Aby przeanalizować obrazy w trybie offline, użyj jednego z narzędzi rysunkowych, aby obrysować obszar zainteresowania lub ROI wokół każdej komórki lub części komórki – w tym przypadku tylnej części głowy plemnika, ponieważ w tym obszarze mobilizowany jest zmagazynowany wapń. Przewijaj pasek suwaka, aby sprawdzić serię obrazów.
Zidentyfikuj i usuń komórki, które nie pozostają w pełni w obrębie obszaru ROI, nakładają się na inne komórki lub wykazały gwałtowny wzrost, a następnie gwałtowny spadek intensywności fluorescencji, co jest charakterystyczne dla śmierci komórkowej. Użyj funkcji analizy, aby wygenerować szeregi czasowe intensywności fluorescencji dla każdego ROI. Następnie dane można wyeksportować i przeanalizować w arkuszu kalkulacyjnym.
Obrazy te pochodzą z serii uzyskanej podczas stymulacji trzymikromolarnym progesteronem. Dolny rząd został pokryty pseudokolorem. Aby lepiej zilustrować względne zmiany intensywności, w tym miejscu do komory wprowadzono progesteron.
Wyniki te zostały przedstawione w formie animowanego filmu poklatkowego. Zauważ gwałtowny wzrost intensywności fluorescencji, po którym następuje powolny wzrost, co wskazuje na odpowiadające temu zmiany poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego. Przedstawione tutaj dane zostały ilościowo określone na podstawie średnich intensywności w tylnej części głowy trzech komórek.
W momencie wskazanym strzałką dodano trzy mikromolarną dawkę progesteronu. Linia przerywana przedstawia średnią fluorescencję kontrolną. W dzisiejszym materiale pokazaliśmy, jak izolować komórki wysokiej jakości, ładować je barwnikiem wrażliwym na wapń oraz monitorować odpowiedź poszczególnych komórek na stymulację.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zastosowaniu jak najlepszej populacji komórek, zminimalizowaniu naświetlania komórek w celu uniknięcia fotouszkodzeń oraz wyborze barwnika, który najlepiej odpowiada analizowanym reakcjom. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.
Przegląd
Niniejsze badanie ocenia sygnały stężenia jonów wapnia wywołane bodźcem w poszczególnych plemnikach ludzkich z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse. Ruchome komórki plemników są obciążone fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na wapń i unieruchomione w celu obrazowania oraz analizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórki
- Biologia rozrodu
Wprowadzenie
- Sygnalizacja wapniowa odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu plemników i zapłodnieniu.
- Zrozumienie dynamiki wapnia może dostarczyć cennych informacji na temat regulacji i aktywności plemników.
- Do wizualizacji wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia powszechnie stosuje się barwniki fluorescencyjne.
- Obrazowanie poklatkowe umożliwia obserwację dynamicznych odpowiedzi komórkowych.
Cel badania
- Wyizolowanie ruchomych plemników ludzkich oraz ocena ich odpowiedzi wapniowej na bodźce.
- Opracowanie metody obrazowania i analizy dynamiki wapnia w pojedynczych komórkach plemników.
- Pogłębienie wiedzy na temat zachowania plemników w odpowiedzi na bodźce pochodzące z komórki jajowej.
Zastosowane metody
- Izolacja ruchliwych plemników z osocza nasiennego przy użyciu techniki swim-up.
- Obciążanie plemników fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na wapń.
- Unieruchomienie plemników w przepływowej komorze obrazowej.
- Mikroskopia fluorescencyjna time-lapse w celu zarejestrowania zmian stężenia jonów wapnia.
Główne wyniki
- Pomyślnie zarejestrowano odpowiedzi wapniowe pojedynczych komórek plemników.
- Stymulacja progesteronem spowodowała obserwowalne skoki intensywności fluorescencji.
- Analiza danych wykazała istotne zmiany w wewnątrzkomórkowym poziomie wapnia.
- W celu zapewnienia przejrzystości wyniki przedstawiono w formacie wideo time-lapse.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia niezawodne podejście do badania sygnalizacji wapniowej w ludzkich plemnikach.
- Zrozumienie dynamiki wapnia może dostarczyć cennych informacji dla biologii rozrodu i badań nad płodnością.
- Przyszłe badania mogą obejmować analizę różnych bodźców oraz ich wpływu na funkcje plemników.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie wewnątrzkomórkowej sygnalizacji wapniowej w ludzkich plemnikach dostarcza funkcjonalnych wyników służących do oceny ruchliwości plemników i potencjału zapłodnienia, które są kluczowymi punktami końcowymi w diagnostyce męskiej niepłodności oraz opracowywaniu środków antykoncepcyjnych. Metoda ta umożliwia mechanistyczną ocenę ryzyka związanego z związkami celującymi w specyficzne dla plemników kanały jonowe lub szlaki sygnalizacyjne poprzez bezpośredni pomiar odpowiedzi fizjologicznych w systemie istotnym dla danej jednostki chorobowej. Podejście to wspiera walidację celu oraz opracowywanie testów w programach zdrowia reprodukcyjnego, dostarczając ilościowych danych na poziomie pojedynczych komórek dotyczących indukowanego bodźcem przepływu wapnia.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych związanych z modulacją kanałów jonowych plemników oraz wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez potwierdzenie funkcjonalnego oddziaływania na cel w ludzkich plemnikach w warunkach kapacytacji.
- Wartość prognostyczna: Generuje dane dotyczące zależności dawka-odpowiedź, które pomagają w identyfikacji i priorytetyzacji związków wiodących na podstawie modulacji przepływu jonów wapnia.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Pozwala na otrzymanie zwalidowanych, załadowanych barwnikiem zawiesin ludzkich plemników, odpowiednich do wysokoprzepustowego przesiewu fluorescencyjnego.
- Wyniki ilościowe: Dostarcza pomiary intensywności fluorescencji w odstępach czasu, które umożliwiają obliczenie % zmiany względem wartości bazowej w celu porównawczej oceny związków.
- Powtarzalność: Zestandaryzowane protokoły ładowania i perfuzji zapewniają spójne generowanie danych pomiędzy eksperymentami i laboratoriami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Wykorzystuje ludzkie plemniki jako bezpośredni model translacyjny do badania mechanizmów niepłodności oraz działania środków antykoncepcyjnych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Łączy ekspozycję na związek z funkcjonalnymi odpowiedziami wapniowymi, co zmniejsza niejednoznaczność w określaniu mechanizmu działania.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki in vitro z efektami fizjologicznymi poprzez pomiar sygnalizacji w czasie rzeczywistym w ruchomych, poddanych kapacytacji plemnikach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu po optymalizację wiodącego związku, szczególnie w programach skoncentrowanych na celach w obrębie dróg rozrodczych, gdzie funkcjonalne testy plemników pozwalają przewidzieć skuteczność in vivo.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących celów specyficznych dla plemników poprzez powiązanie ekspozycji na ligand z wewnątrzkomórkową dynamiką wapnia.
- Przesiewanie: Pozwala na standaryzację analizy dzięki kontrolowanemu ładowaniu barwnika, perfuzji i warunkom obrazowania, co zapewnia powtarzalne odczyty fluorescencji.
- Analityka: Dostarcza rozdzielczych w czasie danych o przepływie wapnia na poziomie pojedynczych komórek, co pozwala na porównanie warunków stymulacji i efektów działania związków.
- Badania translacyjne: Wykorzystuje ludzkie plemniki w celu zachowania istotności fizjologicznej, co wspiera ciągłość przejścia od wglądu w mechanizmy do walidacji przedklinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny wpływu związków na funkcje plemników w ramach wielu projektów i obszarów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie modulacji celu, dostarczając bezpośrednich dowodów na zmiany w sygnałowaniu wapniowym w ludzkich komórkach.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki ustandaryzowanym procedurom izolacji komórek, ładowania barwnika oraz perfuzji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie danych funkcjonalnych, które ograniczają zależność od biomarkerów zastępczych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wykazane efekty w obrębie sygnałowania wapniowego w plemnikach.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu pracy z plemnikami, mikroskopii fluorescencyjnej oraz analizy obrazu w celu zapewnienia jakości danych.
- Metoda jest zależna od systemów perfuzyjnych i mikroskopów odwróconych umożliwiających akwizycję time-lapse przy minimalnej fototoksyczności.
- Niezbędna jest standaryzacja w ramach zespołów w zakresie przygotowania komórek, stężenia barwnika i czasu stymulacji, aby zapewnić porównywalność wyników.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać optymalizacji warunków adhezji oraz protokołów wprowadzania barwnika.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wydajność wprowadzania barwnika oraz ryzyko fotobleachingu, które są ograniczane poprzez zastosowanie barwników o długości fali w zakresie widzialnym oraz kontrolowanego oświetlenia.
