16 czerwca 2010
Oceniono sygnały [Ca2+]i wywołane bodźcem w pojedynczych ludzkich plemnikach. Ruchome komórki obciążono fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na Ca2+ (metodą estru AM) i unieruchomiono w komorze przepływowej. Obrazowanie komórek przeprowadzono za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej, a stymulację wykonano poprzez medium perfuzyjne. Odpowiedzi pojedynczych komórek (lub obszarów) przeanalizowano offline przy użyciu programu Excel.
Ogólnym celem niniejszej procedury jest uzyskanie serii obrazów unieruchomionych plemników ludzkich znakowanych fluorescencyjnym barwnikiem reporterowym wapnia. Komórki ruchliwe są izolowane z plazmy nasiennej poprzez ich wypłynięcie do medium inkubacyjnego. Po kapacytacji komórki są znakowane fluorescencyjnym wskaźnikiem wapnia, a następnie przenoszone do szczelnej komory obrazującej, która jest zamontowana na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym.
Reakcje stężenia jonów wapnia są rejestrowane jako seria obrazów poklatkowych i analizowane w celu wyodrębnienia odpowiedzi pojedynczych komórek. Cześć, jestem Edwin Andres Morales Garcia z laboratorium dr. Stevena J. Public Cova w School of Biosciences na University of Birmingham w Wielkiej Brytanii. Jestem Katherine Nash, również z Public Overlap.
Jestem Jennifer Morris z Public Overlap. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę obrazowania wewnątrzkomórkowych odpowiedzi wapniowych w pojedynczych ludzkich plemnikach. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania regulacji aktywności plemników przy użyciu bodźców pochodzących z komórki jajowej oraz dróg rodnych kobiety.
Przejdźmy zatem do rozpoczęcia procedury. Próbki nasienia należy przechowywać w temperaturze 37 °C nie dłużej niż przez 30 minut od momentu pobrania, aby wyizolować komórki ruchliwe z plazmy nasiennej. Odmierzyć 1 ml zrównoważonego roztworu soli L'S uzupełnionego o 0,3% BSA, w skrócie S-E-B-S-S, do serii polistyrenowych probówek o okrągłym dnie o pojemności 5 ml. Delikatnie nałożyć 0,3 ml nasienia na warstwę S-E-B-S-S w każdej probówce i lekko zakręcić probówkę.
Inkubuj probówki pod kątem 45 stopni przez jedną godzinę w temperaturze 37°C i 6% dwutlenku węgla. Aby umożliwić ruchomym komórkom przedostanie się do S-E-B-S-S, delikatnie odpipetuj górne 0,7 ml roztworu i przenieś roztwór ze wszystkich probówek do czystej, 15 ml polistyrenowej probówki wirówki. Wstrząśnij delikatnie w celu wymieszania, a następnie policz komórki unieruchomione formaliną w nowej komorze liczącej Bowela.
Dostosuj stężenie do 6 milionów komórek na mililitr w S-E-B-S-S i podziel plemniki na 200 µl aliquoty w polistyrenowych probówkach o okrągłym dnie o pojemności pięciu mililitrów. Przykryj luźno zakrętkami. Jeśli badana jest odpowiedź komórek poddanych kapacytacji, inkubuj probówki od pięciu do sześciu godzin w temperaturze 37 °C i 6% carbon dioxide, aby umożliwić kapacytację. Na środku szkiełka 22 x 50 mm nanieś 10 µl 10% polylysine w formie kilku małych kropel.
Numer jeden szkiełko nakrywki i poczekaj, aż całkowicie wyschnie. Użyj smaru próżniowego, aby przymocować szkiełko nakrywki stroną potraktowaną do góry do komory obrazowania, zbudowanej w tym celu.
Dla każdego eksperymentu obrazowania wybierz jedną probówkę z komórkami o nabytym potencjale do zapłodnienia i dodaj 1,2 µL Calcium dependent organ green o stężeniu 2,5 mg/mL rozpuszczonego w DMSO, aby uzyskać stężenie końcowe 10 µM. Inkubuj probówkę przez 40 minut w temperaturze 37 °C i 6% CO2.
Używając pipety 200 µL z końcówką P 200, całkowicie usuń cały roztwór z probówki. Napełnij komorę, delikatnie wstrzykując płyn do portu dopływowego. Przechyl komorę tak, aby pęcherzyki powietrza uciekły przez port odpływowy.
Umieść całą komorę w inkubatorze i inkubuj przez kolejne 20 minut w temperaturze 37°C i 6% dwutlenku węgla, aby umożliwić przyleganie plemników do poli-D-lizyny. Zamocuj komorę do odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego i podłącz ją do aparatury perfuzyjnej.
Pozostaw preparat w ciemności przez co najmniej 10 minut, aby odprowadzić resztki perfuzji. Luźne komórki i macierz zewnątrzkomórkową obserwuj w kontraście fazowym przy powiększeniu 40x lub 60x; wybierz pole widzenia, w którym odstępy między komórkami są wystarczające, aby umożliwić oddzielną ocenę fluorescencji każdej komórki. Komórki powinny być odpowiednio przytwierdzone, ale najlepiej wykazujące wyraźną aktywność tworzenia wypustek (fledger activity).
Przełącz mikroskop na zielony kanał fluorescencji. Ustaw czasy ekspozycji na minimum niezbędne do uzyskania wyraźnego obrazu fluorescencyjnego, aby ograniczyć fotoblaknięcie w oprogramowaniu IQ.
Uruchom akwizycję obrazów w serii czasowej. Pobieraj obrazy z częstotliwością 0,1 Hz, korzystając z sterowanej programowo migawki w celu ograniczenia oświetlenia. Po początkowym nagraniu w okresie kontrolnym trwającym od trzech do pięciu minut, zmień stężenie wapnia w soli fizjologicznej i podaj leki, wymieniając roztwór soli w głowicy systemu perfuzyjnego.
Zanotuj czas dodania każdego bodźca w nagłówku i oblicz czas jego dotarcia do komory, zgodnie z opisem w pisemnej części niniejszego protokołu. Aby przeanalizować obrazy w trybie offline, użyj jednego z narzędzi rysunkowych, aby obrysować obszar zainteresowania lub ROI wokół każdej komórki lub części komórki – w tym przypadku tylnej części głowy plemnika, ponieważ w tym obszarze mobilizowany jest zmagazynowany wapń. Przewijaj pasek suwaka, aby sprawdzić serię obrazów.
Zidentyfikuj i usuń komórki, które nie pozostają w pełni w obrębie obszaru ROI, nakładają się na inne komórki lub wykazały gwałtowny wzrost, a następnie gwałtowny spadek intensywności fluorescencji, co jest charakterystyczne dla śmierci komórkowej. Użyj funkcji analizy, aby wygenerować szeregi czasowe intensywności fluorescencji dla każdego ROI. Następnie dane można wyeksportować i przeanalizować w arkuszu kalkulacyjnym.
Obrazy te pochodzą z serii uzyskanej podczas stymulacji trzymikromolarnym progesteronem. Dolny rząd został pokryty pseudokolorem. Aby lepiej zilustrować względne zmiany intensywności, w tym miejscu do komory wprowadzono progesteron.
Wyniki te zostały przedstawione w formie animowanego filmu poklatkowego. Zauważ gwałtowny wzrost intensywności fluorescencji, po którym następuje powolny wzrost, co wskazuje na odpowiadające temu zmiany poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego. Przedstawione tutaj dane zostały ilościowo określone na podstawie średnich intensywności w tylnej części głowy trzech komórek.
W momencie wskazanym strzałką dodano trzy mikromolarną dawkę progesteronu. Linia przerywana przedstawia średnią fluorescencję kontrolną. W dzisiejszym materiale pokazaliśmy, jak izolować komórki wysokiej jakości, ładować je barwnikiem wrażliwym na wapń oraz monitorować odpowiedź poszczególnych komórek na stymulację.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o zastosowaniu jak najlepszej populacji komórek, zminimalizowaniu naświetlania komórek w celu uniknięcia fotouszkodzeń oraz wyborze barwnika, który najlepiej odpowiada analizowanym reakcjom. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.
Niniejsze badanie ocenia sygnały stężenia jonów wapnia wywołane bodźcem w poszczególnych plemnikach ludzkich z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse. Ruchome komórki plemników są obciążone fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na wapń i unieruchomione w celu obrazowania oraz analizy.
Obrazowanie wewnątrzkomórkowej sygnalizacji wapniowej w ludzkich plemnikach dostarcza funkcjonalnych wyników służących do oceny ruchliwości plemników i potencjału zapłodnienia, które są kluczowymi punktami końcowymi w diagnostyce męskiej niepłodności oraz opracowywaniu środków antykoncepcyjnych. Metoda ta umożliwia mechanistyczną ocenę ryzyka związanego z związkami celującymi w specyficzne dla plemników kanały jonowe lub szlaki sygnalizacyjne poprzez bezpośredni pomiar odpowiedzi fizjologicznych w systemie istotnym dla danej jednostki chorobowej. Podejście to wspiera walidację celu oraz opracowywanie testów w programach zdrowia reprodukcyjnego, dostarczając ilościowych danych na poziomie pojedynczych komórek dotyczących indukowanego bodźcem przepływu wapnia.
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu po optymalizację wiodącego związku, szczególnie w programach skoncentrowanych na celach w obrębie dróg rozrodczych, gdzie funkcjonalne testy plemników pozwalają przewidzieć skuteczność in vivo.