Techniki obrazowania sygnalizacji Ca2+ w plemnikach ludzkich
16 czerwca 2010
Oceniane są sygnały [Ca2+]i wywołane bodźcem przez poszczególne plemniki ludzkie. Komórki ruchome są ładowane wrażliwym na Ca2+ barwnikiem fluorescencyjnym (metoda estrowa AM) i unieruchamiane w komorze perfuzyjnej. Komórki są obrazowane za pomocą poklatkowej mikroskopii fluorescencyjnej i stymulowane za pomocą pożywki perfuzyjnej. Odpowiedzi pojedynczych komórek (lub regionów) są analizowane w trybie offline za pomocą programu Excel.
Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie serii obrazów z unieruchomionych plemników ludzkich znakowanych fluorescencyjnym reporterem wapniowym jako pierwszym. Komórki ruchome izoluje się z osocza nasienia poprzez zanurzenie ich w pożywce inkubacyjnej. Po kapacytacji komórki są znakowane fluorescencyjnym wskaźnikiem wapnia, a następnie przenoszone do topliwej komory obrazowania, która jest montowana na odwróconym mikroskopie fluorescencyjnym.
Reakcje na stężenie jonów wapnia są rejestrowane jako seria obrazów poklatkowych i analizowane w celu wyodrębnienia odpowiedzi pojedynczych komórek. Cześć, nazywam się Edwin Andres Morales Garcia i pracuję w laboratorium dr Stevena J. Public Cova w Szkole Nauk Biologicznych na Uniwersytecie w Birmingham w Wielkiej Brytanii. Nazywam się Katherine Nash i również pochodzę z Public Overlap.
Nazywam się Jennifer Morris i pracuję w Public Overlap. Dzisiaj pokażemy Twoją procedurę obrazowania wewnątrzkomórkowych odpowiedzi wapnia w indywidualnej glebie perato człowieka. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania regulacji aktywności plemników za pomocą bodźców pochodzących z komórki jajowej i pułapki na samicę.
Więc zacznijmy. Przechowuj próbki nasienia w temperaturze 37 stopni Celsjusza nie dłużej niż 30 minut od momentu pobrania, aby wyizolować komórki motoryczne z PET osocza nasienia jeden mililitr roztworów soli bilansowej L'S uzupełnionych 0,3% BSA, w skrócie S-E-B-S-S w szeregu pięciomililitrowych probówek z okrągłym dnem z polistyrenu. Delikatnie podłóż S-E-B-S-S w każdej probówce 0,3 mililitra nasienia i luźno zakryj probówkę.
Inkubuj probówki pod kątem 45 stopni przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 6% dwutlenku węgla. Aby umożliwić ruchliwym komórkom przepłynięcie do S-E-B-S-S, delikatnie odciśnij nam 0,7 mililitra roztworu i wyciągnij roztwór ze wszystkich probówek do czystej 15-mililitrowej probówki wirówkowej z polistyrenu. Delikatnie wstrząśnij, aby wymieszać komórki unieruchomione formaliną w nowej komorze do liczenia jelit.
Doprowadź stężenie do 6 milionów komórek na mililitr w S-E-B-S-S i podziel plemniki na 200 mikrolitrowych podwielokrotności w pięciomililitrowych probówkach z okrągłym dnem z polistyrenu. Czapka luźno. Jeśli badana jest odpowiedź komórek pojemnościowych, inkubuj probówki przez pięć do sześciu godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 6% dwutlenku węgla, aby umożliwić pojemność Nałóż 10 mikrolitrów 10% polilizyny jako liczbę małych kropli na środek 22 na 50 milimetrów.
Numer jeden szkiełko nakrywkowe i pozostaw do całkowitego wyschnięcia. Użyj smaru próżniowego, aby przymocować stronę pokrytą szkiełkiem nakrywkowym do zbudowanej topliwej komory obrazowania. W tym celu.
Do każdego eksperymentu obrazowania wybierz pojedynczą probówkę z pojemnymi ogniwami i dodaj 1,2 mikrolitra po 2,5 miligrama na mililitr. Zielony narząd zależny od wapnia rozpuszczony w DMSO do końcowego stężenia 10 mikromolowych. Inkubuj probówkę przez 40 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 6% dwutlenku węgla.
Używając Pepto o pojemności 200 mikrolitrów z końcówką P 200, całkowicie usuń cały roztwór z tubki. Napełnij komorę, delikatnie wstrzykując do portu dopływowego. Przechyl komorę tak, aby bąbelki wydostały się przez odpływ.
Umieść całą komorę w inkubatorze i inkubuj przez kolejne 20 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 6% dwutlenku węgla. Aby plemniki mogły przylegać do poli D lizyny. Zamontuj komorę do odwróconego mikroskopu fluorescencyjnego i podłącz ją do aparatu perfuzyjnego.
Pozostaw preparat w ciemności na co najmniej 10 minut, aby perfuzja zniknęła. Luźne komórki i zewnątrzkomórkowe umierają pod wpływem kontrastu fazowego przy powiększeniu 40x lub 60x, wybierz pole widzenia, w którym odstępy między komórkami są wystarczające, aby umożliwić ocenę fluorescencji z każdej komórki osobno. Komórki powinny być odpowiednio przyczepione, ale najlepiej wykazujące wyraźną aktywność raczkującą rośliny.
Przełącz mikroskop na zielony kanał fluorescencyjny. Utrzymuj czasy naświetlania na minimalnym poziomie wymaganym do uzyskania wyraźnego obrazu fluorescencyjnego. Aby zmniejszyć fotowybielanie w oprogramowaniu IQ.
Aktywuj akwizycję obrazu szeregów czasowych. Rejestruj obrazy z częstotliwością 0,1 Hz i używaj migawki sterowanej programowo, aby ograniczyć oświetlenie. Początkowo rejestrując przez okres kontrolny trwający od trzech do pięciu minut, manipuluj stężeniem wapnia w soli fizjologicznej i stosuj leki, zmieniając sól fizjologiczną w głowicy systemu perfuzyjnego.
Zwróć uwagę na czas, w którym każdy bodziec jest dodawany do nagłówka i oblicz czas jego przybycia do komory zgodnie z opisem w pisemnej części niniejszego protokołu. Aby analizować obrazy w trybie offline, użyj jednego z narzędzi do rysowania, aby obrysować obszar zainteresowania lub ROI wokół każdej komórki lub części komórki tutaj, tylnej głowy plemnika, ponieważ wapń jest przechowywany w miarę mobilizacji w tym obszarze. Przewiń suwakiem, aby sprawdzić serię obrazów.
Zidentyfikuj i usuń komórki, które nie pozostają w pełni w obszarze ROI, nakładają się na inne komórki lub wykazały duży i szybki wzrost, po którym nastąpił gwałtowny spadek intensywności fluorescencji charakterystyczny dla śmierci komórki. Użyj funkcji analizy, aby wygenerować serię intensywności fluorescencji w czasie dla każdego ROI. Dane można następnie wyeksportować i przeanalizować w arkuszu arkusza kalkulacyjnego.
Obrazy te pochodzą z serii uzyskanej podczas stymulacji trzema mikromolowymi progesteronami. Dolny rząd został pokryty pseudo kolorem. Aby lepiej zilustrować względne zmiany intensywności, progesteron wszedł do tej komory. Tu.
Wyniki te są animowane w filmie poklatkowym. Zwróć uwagę na szybki wzrost intensywności fluorescencji, po którym następuje powolny wzrost, wskazujący na odpowiednie zmiany w wewnątrzkomórkowym poziomie wapnia. Dane te są tutaj określone ilościowo na podstawie średnich intensywności tylnej głowy trzech komórek.
Trzy mikromolowe progesterony dodano w czasie oznaczonym strzałką. Linia przerywana pokazuje średnią fluorescencję kontrolną. Dzisiaj właśnie pokazaliśmy, jak wyizolować dobrej jakości komórki, obciążyć je barwnikiem wrażliwym na wapń i monitorować reakcję poszczególnych komórek na stymulację.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać, aby użyć najlepszej możliwej populacji komórek, a także zminimalizować oświetlenie komórek, aby uniknąć uszkodzeń fotograficznych i wybrać barwnik, który najlepiej pasuje do odpowiedzi, na które patrzysz. Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Przegląd
Niniejsze badanie ocenia sygnały stężenia jonów wapnia wywołane bodźcem w poszczególnych plemnikach ludzkich z wykorzystaniem mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse. Ruchome komórki plemników są obciążone fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na wapń i unieruchomione w celu obrazowania oraz analizy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórki
- Biologia rozrodu
Wprowadzenie
- Sygnalizacja wapniowa odgrywa kluczową rolę w funkcjonowaniu plemników i zapłodnieniu.
- Zrozumienie dynamiki wapnia może dostarczyć cennych informacji na temat regulacji i aktywności plemników.
- Do wizualizacji wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia powszechnie stosuje się barwniki fluorescencyjne.
- Obrazowanie poklatkowe umożliwia obserwację dynamicznych odpowiedzi komórkowych.
Cel badania
- Wyizolowanie ruchomych plemników ludzkich oraz ocena ich odpowiedzi wapniowej na bodźce.
- Opracowanie metody obrazowania i analizy dynamiki wapnia w pojedynczych komórkach plemników.
- Pogłębienie wiedzy na temat zachowania plemników w odpowiedzi na bodźce pochodzące z komórki jajowej.
Zastosowane metody
- Izolacja ruchliwych plemników z osocza nasiennego przy użyciu techniki swim-up.
- Obciążanie plemników fluorescencyjnym barwnikiem wrażliwym na wapń.
- Unieruchomienie plemników w przepływowej komorze obrazowej.
- Mikroskopia fluorescencyjna time-lapse w celu zarejestrowania zmian stężenia jonów wapnia.
Główne wyniki
- Pomyślnie zarejestrowano odpowiedzi wapniowe pojedynczych komórek plemników.
- Stymulacja progesteronem spowodowała obserwowalne skoki intensywności fluorescencji.
- Analiza danych wykazała istotne zmiany w wewnątrzkomórkowym poziomie wapnia.
- W celu zapewnienia przejrzystości wyniki przedstawiono w formacie wideo time-lapse.
Wnioski
- Metoda ta zapewnia niezawodne podejście do badania sygnalizacji wapniowej w ludzkich plemnikach.
- Zrozumienie dynamiki wapnia może dostarczyć cennych informacji dla biologii rozrodu i badań nad płodnością.
- Przyszłe badania mogą obejmować analizę różnych bodźców oraz ich wpływu na funkcje plemników.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Obrazowanie wewnątrzkomórkowej sygnalizacji wapniowej w ludzkich plemnikach dostarcza funkcjonalnych wyników służących do oceny ruchliwości plemników i potencjału zapłodnienia, które są kluczowymi punktami końcowymi w diagnostyce męskiej niepłodności oraz opracowywaniu środków antykoncepcyjnych. Metoda ta umożliwia mechanistyczną ocenę ryzyka związanego z związkami celującymi w specyficzne dla plemników kanały jonowe lub szlaki sygnalizacyjne poprzez bezpośredni pomiar odpowiedzi fizjologicznych w systemie istotnym dla danej jednostki chorobowej. Podejście to wspiera walidację celu oraz opracowywanie testów w programach zdrowia reprodukcyjnego, dostarczając ilościowych danych na poziomie pojedynczych komórek dotyczących indukowanego bodźcem przepływu wapnia.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie hipotez terapeutycznych związanych z modulacją kanałów jonowych plemników oraz wewnątrzkomórkowych szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez potwierdzenie funkcjonalnego oddziaływania na cel w ludzkich plemnikach w warunkach kapacytacji.
- Wartość prognostyczna: Generuje dane dotyczące zależności dawka-odpowiedź, które pomagają w identyfikacji i priorytetyzacji związków wiodących na podstawie modulacji przepływu jonów wapnia.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Pozwala na otrzymanie zwalidowanych, załadowanych barwnikiem zawiesin ludzkich plemników, odpowiednich do wysokoprzepustowego przesiewu fluorescencyjnego.
- Wyniki ilościowe: Dostarcza pomiary intensywności fluorescencji w odstępach czasu, które umożliwiają obliczenie % zmiany względem wartości bazowej w celu porównawczej oceny związków.
- Powtarzalność: Zestandaryzowane protokoły ładowania i perfuzji zapewniają spójne generowanie danych pomiędzy eksperymentami i laboratoriami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Wykorzystuje ludzkie plemniki jako bezpośredni model translacyjny do badania mechanizmów niepłodności oraz działania środków antykoncepcyjnych.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Łączy ekspozycję na związek z funkcjonalnymi odpowiedziami wapniowymi, co zmniejsza niejednoznaczność w określaniu mechanizmu działania.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki in vitro z efektami fizjologicznymi poprzez pomiar sygnalizacji w czasie rzeczywistym w ruchomych, poddanych kapacytacji plemnikach.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od walidacji celu po optymalizację wiodącego związku, szczególnie w programach skoncentrowanych na celach w obrębie dróg rozrodczych, gdzie funkcjonalne testy plemników pozwalają przewidzieć skuteczność in vivo.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących celów specyficznych dla plemników poprzez powiązanie ekspozycji na ligand z wewnątrzkomórkową dynamiką wapnia.
- Przesiewanie: Pozwala na standaryzację analizy dzięki kontrolowanemu ładowaniu barwnika, perfuzji i warunkom obrazowania, co zapewnia powtarzalne odczyty fluorescencji.
- Analityka: Dostarcza rozdzielczych w czasie danych o przepływie wapnia na poziomie pojedynczych komórek, co pozwala na porównanie warunków stymulacji i efektów działania związków.
- Badania translacyjne: Wykorzystuje ludzkie plemniki w celu zachowania istotności fizjologicznej, co wspiera ciągłość przejścia od wglądu w mechanizmy do walidacji przedklinicznej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny wpływu związków na funkcje plemników w ramach wielu projektów i obszarów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie modulacji celu, dostarczając bezpośrednich dowodów na zmiany w sygnałowaniu wapniowym w ludzkich komórkach.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki ustandaryzowanym procedurom izolacji komórek, ładowania barwnika oraz perfuzji.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez dostarczanie danych funkcjonalnych, które ograniczają zależność od biomarkerów zastępczych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o wykazane efekty w obrębie sygnałowania wapniowego w plemnikach.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu pracy z plemnikami, mikroskopii fluorescencyjnej oraz analizy obrazu w celu zapewnienia jakości danych.
- Metoda jest zależna od systemów perfuzyjnych i mikroskopów odwróconych umożliwiających akwizycję time-lapse przy minimalnej fototoksyczności.
- Niezbędna jest standaryzacja w ramach zespołów w zakresie przygotowania komórek, stężenia barwnika i czasu stymulacji, aby zapewnić porównywalność wyników.
- Adaptacja do innych systemów modelowych może wymagać optymalizacji warunków adhezji oraz protokołów wprowadzania barwnika.
- Ograniczenia praktyczne obejmują wydajność wprowadzania barwnika oraz ryzyko fotobleachingu, które są ograniczane poprzez zastosowanie barwników o długości fali w zakresie widzialnym oraz kontrolowanego oświetlenia.
