Name: Pierwotne kultury neuronalne z mózgów poczwarek Drosophila w późnym stadium (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 12 s
Description: Poznaj metodę przygotowania pierwotnych kultur neuronowych z mózgów poczwarek Drosophila w późnym stadium. Technika ta umożliwia obserwację wzrostu neurytów i badanie dynamiki wapnia w neuronach przy użyciu obrazowania Fura-2.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantu NIH NS27501 przyznanego DKOD. Dodatkowe wsparcie dla niniejszej pracy zapewnił grant dla UC Irvine wspierający DKOD w ramach Programu Profesorskiego HHMI.

Przygotowania przed dniem hodowli:
<ol>
<li>Przygotować sterylny roztwór do wycinania tkanek.</li>
<li>Przygotować sterylne podłoże DMEM i przechowywać w aliquotach po 10 ml w temperaturze 4°C przez 2 tygodnie.</li>
<li>Przygotować sterylne suplementy do podłoża DDM2 i zamrozić w aliquotach po 50 lub 100 µl na 1 miesiąc.</li>
<li>Przygotować mieszaninę ConA/laminina.</li>
<li>Pokryć szkiełka nakrywkowe.      Opcjonalnie: Przygotować sterylne CNBM i przechowywać w zamrażarce do 4 miesięcy. </li>
</ol>
W dniu hodowli
I.&nbsp; Przygotowanie roztworu enzymu (ES) w komorze z laminarnym przepływem powietrza
<ol>
<li>Do probówki do wirowania o pojemności 15 ml wlać 5 ml roztworu do sekcji (DS).</li>
<li>Odważyć 0,8 mg L-cysteiny do probówki eppendorf 0,6 ml i dodać 150 µl DS. Pipetować wielokrotnie do całkowitego rozpuszczenia kryształów.</li>
<li>Dodać 150 ml mieszaniny DS/cysteina do 5 ml DS i dokładnie wymieszać.</li>
<li>Dodać 50 U (jednostek) papainy.</li>
<li>Dodać 7 ml 0,1 N NaOH i dokładnie wymieszać. Po aktywacji roztwór stanie się klarowny w ciągu 30 min.&nbsp;</li>
<li>Przefiltrować roztwór enzymu przez filtr strzykawkowy 0,2 mm do sterylnej probówki do mikrowirowania z nakrętką o pojemności 1,5 ml &nbsp;    Papaina: Wymagane 50 U w 5 ml DS. Każda partia różni się nieco od siebie, dlatego należy obliczyć odpowiednią ilość:                                  37,3 mg/ml i 28,3 U/mg                                      37,3 x 28,3 = 1055,59 U/ml   (1000 ml)                                                              50 U&nbsp; = 47,4 ml </li>
</ol>
II. Przygotowanie pożywki DDM2
W dniu hodowli: dodać następujące suplementy w celu przygotowania pożywki DDM2
Do 10 ml DMEM należy dodać suplementy bezpośrednio przed hodowlą:
<ol>
<li>100µl transferyny</li>
<li>100µl putrescyny</li>
<li>100µl selenu</li>
<li>100µl progesteronu</li>
<li>50µl&nbsp; insuliny</li>
<li>10µl 20-hydroksyeckdyzonu</li>
</ol>
Uwaga: Przygotować wystarczającą ilość DDM2 dla wszystkich planowanych kultur (każdy mózg osadzony na pojedynczym szkiełku nakrywkowym w osobnej szalce Petriego 35 mm, 1,5 ml pożywki na kulturę)
Kroki III-VI można przeprowadzić na niesterylnym blacie laboratoryjnym i powinny one zająć 45 minut lub mniej.
III. Zbieranie poczwarek
<ol>
<li>Pod mikroskopem stereoskopowym pobierz 10-15 poczek ze ścianek fiolki.</li>
<li>Umieść poczki w pokrywce suchej szalki Petri o średnicy 35 mm.&nbsp;</li>
</ol>
Uwaga: Zazwyczaj wykorzystujemy mózgi poczwarek w przedziale od 55 do 78 godzin po utworzeniu puparium (APF). Wypreparowanie mózgu z młodszych poczwarek jest nieco trudniejsze, ponieważ torebki głowowe mają tendencję do zapadania się, natomiast ogólny poziom wzrostu neurytów jest nieco niższy u najstarszych poczwarek. W szczepie dzikim Canton-S stadia te rozpoznaje się po pigmentacji oczu, które mają kolor od jasnobrązowego do lekko czerwonawego, przy niewielkiej ilości pigmentu w pozostałych obszarach.
IV. Dekapitacja pod mikroskopem stereoskopowym
<ol>
<li>Nanieś dwie krople sterylnego roztworu do sekcji na pokrywkę szalki Petriego, obok poczwarek.</li>
<li>Ostrożnie utrzymaj pojedynczą poczwarkę za pomocą precyzyjnej pęsety w lewej ręce, a w prawej ręce użyj igły 27 G przymocowanej do strzykawki 1 cc, aby usunąć kutykulę z przedniego końca poczwarki.</li>
<li>Lekko ściśnij poczwarkę pęsetą i w momencie pojawienia się głowy użyj igły 27 G, aby przeciąć szyję.</li>
<li>Za pomocą czubka igły lub pęsety przenieś głowę do kropli roztworu do sekcji.</li>
<li>Powtarzaj czynność, aż w jednej kropli znajdzie się 10-15 głów.</li>
</ol>
V. Usunięcie mózgu z głowy pod mikroskopem dissectingowym
<ol>
<li>W każdej dłoni trzymaj strzykawkę 1 cc z igłą o rozmiarze 27 gauge.</li>
<li>Użyj ich do ustawienia głowy muchy w kropli roztworu do sekcji w taki sposób, aby trąba była skierowana w Twoją stronę, a powierzchnia grzbietowa głowy znajdowała się na górze.</li>
<li>Wprowadź lewą igłę w trąbę, aby unieruchomić głowę, a prawą igłą wykonaj nacięcie w prawym oku, biegnące od powierzchni brzusznej do grzbietowej.</li>
<li>Wprowadź prawą igłę obok lewej w okolicy trąby, a następnie za pomocą lewej igły delikatnie uciśnij kutykulę nad lewym okiem, przesuwając mózg w stronę nacięcia w prawym oku. Mózg powinien wysunąć się przez nacięcie po prawej stronie, będąc stosunkowo nienaruszonym, często z obydwoma płatami optycznymi, a niekiedy również z pigmentowaną tkanką oka.</li>
<li>Nasuń mózg na tylną część igły i przenieś go do kropli sterylnego soli fizjologicznej do sekcji w nowej sterylnej szalce Petriego o średnicy 35 mm.</li>
<li>Zebierz 10-15 mózgów dla każdego genotypu. </li>
</ol>
VI. Usunięcie płatów optycznych i obróbka enzymatyczna
<ol>
<li>W każdej dłoni trzymaj strzykawkę o pojemności 1 cc z igłą o rozmiarze 27 G i użyj ich, aby zebrać wszystkie mózgi w jednym małym obszarze kropli roztworu do sekcji</li>
<li>Użyj strzykawek jako narzędzi tnących, aby usunąć płaty optyczne z każdego mózgu, tak aby tkanka pozostała do hodowli w obrębie centralnego regionu mózgu.</li>
<li>Użyj pipety automatycznej 20 µl, ustawionej na 5 µl, aby przenieść wszystkie mózgi jednego genotypu do probówki Eppendorf zawierającej 1 ml sterylnego roztworu papainy.</li>
<li>Mózgi inkubuj w papainie przez 10-15 minut na rotatorze ustawionym na 60 rpm.</li>
<li>Odwiruj w wirówce przy 3000 rpm przez 3 minuty. </li>
</ol>
Wewnątrz sterylnej komory z laminarnym przepływem powietrza – wszystkie kolejne etapy, podczas których tkanka jest wystawiona na działanie powietrza, powinny być przeprowadzane w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
VII. Płukanie
<ol>
<li>Usunąć roztwór enzymu i zastąpić go sterylnym roztworem do mikrodissekcji.</li>
<li>Wirować przy 3000 rpm przez 3 minuty.</li>
<li>Przemyć sterylnym roztworem do mikrodissekcji łącznie 3 razy.</li>
<li>Usunąć sól fizjologiczną do mikrodissekcji i zastąpić ją DDM2.</li>
<li>Wirować i przemywać łącznie 2 razy za pomocą DDM2.</li>
<li>Przenieść mózgi wraz z medium do sterylnej szalki Petriego o średnicy 35 mm. </li>
</ol>
VIII. Trituracja i wysiew pod mikroskopem stereoskopowym
<ol>
<li>Nanieś 5 ul DDM2 na środek szkiełka podstawowego.</li>
<li>Przenieś 1 mózg do tej kropli DDM2 za pomocą żółtej końcówki.</li>
<li>Pod mikroskopem, używając igieł o rozmiarze 27 G, posiekaj mózg na małe kawałki (powinno to zająć &lt;1 minuta).</li>
<li>Pod kontrolą wzrokową odłam końcówkę&nbsp; szklana pipeta, której końcówkę zwężono do postaci cienkiego punktu, tak aby większe fragmenty można było delikatnie wessać do wnętrza końcówki pipety, a następnie wypuścić z powrotem do medium. Używamy gumowych końcówek do zasysania ustami, które standardowo towarzyszą szklanym kapilarom do hematokrytu o pojemności 100 µl. UwagaNależy zadbać o to, aby w medium nie powstały pęcherzyki powietrza; optymalny rozmiar pipety należy dobrać empirycznie. Odpowiednio dobrana pipeta pozwala na dysocjację mózgu w czasie około 30 sekund na jeden organ, w wyniku czego otrzymuje się zarówno pojedyncze komórki, jak i duże skupiska. Przy obserwacji przy większym powiększeniu około 10–20% neuronów powinno nadal posiadać wypustki, a w preparacie powinny być widoczne duże skupiska. Zbyt intensywna dysocjacja spowoduje, że wszystkie komórki staną się okrągłe i ulegną tak znacznym uszkodzeniom, że nie przeżyją. Etap ten wymaga wprawy i musi być przeprowadzony szybko, ponieważ ze względu na duży stosunek powierzchni do objętości osmolalność i pH kropli DDM2 mogą szybko ulec zmianie. Tkankę należy umieścić w CO2 do inkubatora tak szybko, jak to możliwe. </li>
<li>Na pokrywce szalki Petriego zapisz: „Genotyp, data i godzina”.</li>
<li>Umieść szalkę Petriego o średnicy 35 mm w szalce Petriego o średnicy 100 mm (z wilgotną chusteczką Kimwipe) i pozostaw do ustabilizowania w CO22 inkubować przez 30 min.</li>
<li>Zapełnij 35 mm szalkę 1,5 ml pożywki DDM2.</li>
<li>Przechowywać hodowle w inkubatorze przy 5% CO22 inkubator (23°C). UwagaJeśli nie masz dostępu do chłodzącego CO22 inkubator, należy użyć standardowego inkubatora do hodowli tkanek ssaków i albo umieścić go w chłodni i nagrzać do 23°C, albo umieścić w laboratorium, wyłączyć regulację temperatury i użyć lodu w tacy na dnie inkubatora, aby utrzymać temperaturę w pobliżu temperatury otoczenia. </li>
</ol>
IX. Dokarmianie komórek
<ol>
<li>W dniu 1. (następnego dnia) dodać 0,5 ml CNBM/B27 (pożywka warunkowana), aby uzyskać stosunek DDM2:CNBM/B27 w proporcji 3:1.</li>
<li>W dniu 5. wymienić 1 ml pożywki na 3:1 DDM2:CNBM/B27.</li>
<li>Kontynuować dokarmianie komórek pożywką 3:1 DDM2:CNBM/B27 co 4-5 dni. Uwaga: Kultury można hodować bez nie-neuronalnej pożywki warunkowanej, jednak neurony wydają się wówczas nieco bardziej delikatne i trudniejsze do wykorzystania w eksperymentach elektrofizjologicznych.</li>
</ol>

<ol><li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Culturing+Nerve+Cells%22">Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. (1991).</li>
<li>Rohrbough, J., O'Dowd, D. K., Baines, R. A., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+bases+of+behavioral+plasticity%3A+Establishing+and+Modifying+synaptic+circuits+in+the+Drosophila+Genetic+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Cellular bases of behavioral plasticity: Establishing and Modifying synaptic circuits in the Drosophila Genetic System.</a> J. Neurobiol. 54, 254-271 (2003).</li>
<li>O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+currents+and+firing+properties+of+embryonic+Drosophila+neurons+grown+in+a+chemically+defined+medium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated currents and firing properties of embryonic Drosophila neurons grown in a chemically defined medium.</a> J. Neurobiol. 27, 113-126 (1995).</li>
<li>Lee, D., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+excitatory+synaptic+transmission+mediated+by+nAChR+in+cultured+Drosophila+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast excitatory synaptic transmission mediated by nAChR in cultured Drosophila neurons.</a> J. Neurosci. 19, 5311-5321 (1999).</li>
<li>Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+synaptic+currents+in+Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+are+mediated+by+alpha-bungarotoxin-sensitive+nAChRs+and+picrotoxin-sensitive+GABA+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast synaptic currents in Drosophila mushroom body Kenyon cells are mediated by alpha-bungarotoxin-sensitive nAChRs and picrotoxin-sensitive GABA receptors.</a> J. Neurosci. 23, 9246-9253 (2003).</li>
<li>Jiang, S. A., Campusano, J. M., Su, H., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+mushroom+body+Kenyon+cells+generate+spontaneous+calcium+transients+mediated+by+PLTX-sensitive+calcium+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Drosophila mushroom body Kenyon cells generate spontaneous calcium transients mediated by PLTX-sensitive calcium channels.</a> J. Neurophysiol. 94, 491-500 (2005).</li>
<li>Campusano, J. M., Su, H., Jiang, S. A., Sicaeros, B., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((nAChR-mediated+calcium+responses+and+plasticity+in+Drosophila+Kenyon+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">nAChR-mediated calcium responses and plasticity in Drosophila Kenyon cells.</a> Develop Neurobiol. 67, 1520-1532 (2007).</li>
<li>Oh, H. -W., Campusano, J. M., Hilgenberg, L. G. W., Sun, X., Smith, M. A., O'Dowd, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+analysis+of+chemical+synapses+and+gap+junctions+between+Drosophila+brain+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Develop+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural analysis of chemical synapses and gap junctions between Drosophila brain neurons in culture.</a> Develop Neurobiol. , (2007).</li>
</ol>

Neurony pozyskane z mózgów embrionalnych lub postnatalnych gryzoni mogą być hodowane w pierwotnych kulturach komórkowych, w których wydłużają neuryty i tworzą funkcjonalne połączenia synaptyczne. Metody przygotowywania takich kultur są dobrze ugruntowane, a badania na kulturach neuronalnych gryzoni odegrały kluczową rolę w identyfikacji genów i czynników środowiskowych zaangażowanych w regulację tworzenia i funkcjonowania synaps (Banker and Goslin, 1991). Choć neurony owadów z różnych gatunków również mogą być hodowane i...

<table><tbody><tr><td>Konkanawalina A</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-2010</td><td>Do 2,5 mL DS dodać 25 mg konkanawaliny A z fiolki. Otrzymane stężenie wynosi 10 mg/ml. Przygotować aliquoty po 90 µl i przechowywać w temperaturze -20 &amp;deg;C nie dłużej niż przez 3 miesiące.</td></tr><tr><td>Laminina</td><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-2020</td><td>Do fiolki zawierającej 1 mg lamininy dodać 1 mL DS. Otrzymane stężenie wynosi 0,5 mg/mL. Przygotować aliquoty po 10 &amp;mu;L i przechowywać w temperaturze -20 &amp;deg;C nie dłużej niż przez 3 miesiące.</td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td></td><td>Bellco Glass</td><td>1943-00012</td><td>Szklane szkiełka nakrywkowe 12 mm</td></tr><tr><td>Roztwór ConA + lamininy</td><td></td><td></td><td></td><td>Roztwór zapasowy do powlekania szkiełek nakrywkowych, przygotowany z zapasów Con A i lamininy: do 5 mL DS dodać 83,5 &amp;mu;L ConA (167 &amp;mu;g/mL) oraz 8,35 &amp;mu;uL lamininy (0,835 &amp;mu;g/mL). Wymieszać. Przygotować aliquoty po 100 &amp;mu;L i przechowywać w temperaturze -20 &amp;deg;C nie dłużej niż przez miesiąc.</td></tr><tr><td>Roztwór do sekcji (DS)</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>Na 500 ml: 400 ml wody ultrafiltrowanej + 25 ml roztworu zapasowego A + 14 ml roztworu zapasowego B + 3,0 g (33,3 mM) D (+)-glukozy (Sigma G-8270) + 7,5 g (43,8 mM) sacharozy (Sigma S-0389). Dostosować pH do 7,4 za pomocą 1N NaOH (około 2 ml). Dopełnić objętość końcową do 500 ml wodą ultrafiltrowaną. Przelać do czystej szklanej butelki i autoklawować. Oznaczyć jako &quot;Roztwór do sekcji&quot; i przechowywać w 4°C.</td></tr><tr><td>Roztwór do sekcji (DS)</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>Na 500 ml: 400 ml wody ultrafiltrowanej + 25 ml roztworu zapasowego A + 14 ml roztworu zapasowego B + 3,0 g (33,3 mM) D (+)-glukozy (Sigma G-8270) + 7,5 g (43,8 mM) sacharozy (Sigma S-0389). Dostosować pH do 7,4 za pomocą 1N NaOH (około 2 ml). Dopełnić objętość końcową do 500 ml wodą ultrafiltrowaną. Przelać do czystej szklanej butelki i autoklawować. Oznaczyć jako &quot;Roztwór do sekcji&quot; i przechowywać w 4°C.</td></tr><tr><td>Roztwór B: HEPES</td><td>Bufor</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-3375</td><td>20,97 g (9,9 mM). Dodać wodę ultrafiltrowaną do objętości 200 ml. Mieszać do rozpuszczenia i dopełnić objętość końcową do 250 ml. Przenieść do czystej butelki i autoklawować. Oznaczyć jako &quot;Roztwór B&quot; i przechowywać w 4°C.</td></tr><tr><td>Roztwór A</td><td>Bufor</td><td></td><td></td><td>Na 500 ml: 80,0 g (137 mM) NaCl (Sigma S-9625) + 4,0 g (5,4 mM) KCl (Sigma P-4504) + 0,24 g (0,17 mM) Na2HPO4 (Sigma S-0876) + 0,3 g (0,22 mM) KH2PO4 (Sigma P-5379). Odważyć wszystkie składniki i mieszać do rozpuszczenia w 400 ml wody ultrafiltrowanej. Dopełnić objętość końcową do 500 ml. Przenieść do czystej butelki i autoklawować. Oznaczyć jako &quot;Roztwór A&quot; i przechowywać w 4&amp;deg;C.</td></tr><tr><td colspan="5">Powlekanie szkiełek nakrywkowych: Umieścić autoklawowane szkiełka nakrywkowe w 60-milimetrowej szalce Petriego. Nanieść pipetą 5 µl mieszaniny Con A/lamininy na środek każdego szkiełka. Inkubować w 37°C przez 2 godziny. Przepłukać szkiełka 3 razy, używając za każdym razem 100 µl autoklawowanej wody. Użyć próżni podłączonej do sterylnej pipety Pasteura. Podczas ostatniego płukania podnieść szkiełko pęsetą i osuszyć obie strony. Przenieść szkiełko do 35-milimetrowej szalki Petriego. Przechowywać w temperaturze pokojowej do miesiąca.</td></tr></tbody></table>

pierwotne kultury neuronalne z mózgów poczwarki drosophila w późnym stadium rozwoju

Primary Neuronal Cultures from the Brains of Late Stage Drosophila Pupae

W niniejszym filmie prezentujemy metodę przygotowania pierwotnych kultur neuronalnych z mózgów poczwarki Drosophila w późnym stadium rozwoju. Procedura rozpoczyna się od wyjęcia mózgów z osobników w 70–78 godzinie po uformowaniu puparium. Przedstawiono wyizolowane mózgi po krótkiej inkubacji w papainie, a następnie po kilku etapach przemywania w bezserowym medium wzrostowym. Zilustrowano proces mechanicznej dysocjacji każdego mózgu w 5 μl kropli medium na szkiełku nakrywkowym. Aksony i dendryty neuronów pomitotycznych zostają odcięte w pobliżu somy podczas dysocjacji, jednak neurony zaczynają regenerować wypustki w ciągu kilku godzin od wysiania. Obrazy pokazują żywe kultury w drugim dniu. Neurony kontynuują tworzenie wypustek podczas pierwszego tygodnia hodowli. Specyficzne populacje neuronalne można zidentyfikować w kulturze, wykorzystując linie GAL4 do tkankowo specyficznej ekspresji markerów fluorescencyjnych, takich jak GFP lub RFP. Rejestracje typu whole-cell wykazały, że hodowane neurony tworzą funkcjonalne, spontanicznie aktywne synapsy cholinergiczne i GABAergiczne. Krótki fragment filmu ilustruje dynamikę wapnia w hodowanych neuronach przy użyciu Fura-2 jako barwnika wskaźnikowego wapnia w celu monitorowania spontanicznych przejściowych wzrostów stężenia wapnia oraz odpowiedzi wapniowych wywołanych nikotyną w naczyniu z hodowlą neuronów. Kultury mózgów poczwarki stanowią użyteczny system modelowy, w którym narzędzia genetyczne i farmakologiczne mogą być wykorzystane do identyfikacji czynników wewnętrznych i zewnętrznych wpływających na formowanie się i funkcjonowanie synaps ośrodkowych.

Niniejszy film prezentuje przygotowanie pierwotnych kultur neuronalnych z mózgów poczwarki Drosophila w późnym stadium rozwoju. Obrazy żywych kultur pokazują wypustki neurytów oraz obrazowanie poziomu wapnia z wykorzystaniem Fura-2.

Pierwotne kultury neuronalne z mózgów poczwarki Drosophila w późnym stadium rozwoju

W niniejszym filmie prezentujemy przygotowanie pierwotnych kultur neuronów z mózgów poczwarek Drosophila w późnym stadium rozwoju. Procedura rozpoczyna się od...

Nazywam się Diana Dowd i jestem profesorem w departamentach Anatomii i Neurobiologii oraz Biologii Rozwojowej i Komórkowej na UC Irvine. Dzisiaj opowiem Państwu o przygotowaniu kultur neuronalnych z poczwarek Drosophila. Proces ten polega na usunięciu mózgu z poczwarek w późnym stadium rozwoju; zazwyczaj hodujemy jedynie obszar mózgu centralnego.Na tym etapie uformowane są już główne struktury anatomiczne obecne w mózgu dorosłego osobnika. Należą do nich płaty antenowe, w których znajdują się neurony projekcyjne przesyłające swoje aksony aż do obszaru ciała grzybowego, oraz neurony ciała grzybowego — komórki Kenyonа, które przesłały swoje aksony do neuronów docelowych poprzez płaty alfa, beta i gamma. W dniu hodowli pierwszą czynnością jest przejście do komory z laminarnym przepływem powietrza i przygotowanie sterylnego roztworu enzymu, którego użyjemy do dysocjacji tkanki.Przygotowujemy również pożywkę, której będziemy używać do hodowli komórek. Jest ona sporządzona z zapasów przygotowanych wcześniej. Następnym krokiem jest zebranie poczwerek, które zostaną wykorzystane do dysocjacji lub sekcji.Zostaje to wykonane poza komorą z laminarnym przepływem powietrza, ponieważ osobniki te są hodowane w fiolkach zawierających drożdże i różnorodne inne substancje. Dlatego początkowe etapy sekcji przeprowadzamy poza komorą. Są to osobniki, które właśnie zdjęłam z boków fiolki; w lewym rzędzie znajdują się zwierzęta z czerwonymi oczami, które są na odpowiednim etapie do hodowli.Te są nieco młodsze, te PPP tutaj są nieco młodsze. Mają pomarańczowe lub żółte oczy i jest to odpowiednia linia 1 0 7. Ich oczy są nieco jaśniejsze niż u regularnych typów dzikich, gdzie kolor na tych etapach byłby nieco bardziej brązowy.Wszystkie te etapy są odpowiednie do hodowli, w celu przygotowania hodowli mózgów ludzkich. Dobrze, pierwszym krokiem jest tutaj naniesienie kilku kropli roztworu do sekcji bezpośrednio obok wyprowadzonych i ułożonych w rzędzie w szalce Petriego pni. Używamy do tego pokrywek szalek Petriego o średnicy 35 mm.Następnie biorę do lewej ręki pęsetę nr 5 oraz strzykawkę insulinową o pojemności 1 CC z igłą o rozmiarze 27 G. Są to moje dwa narzędzia do sekcji. Aby usunąć głowę z osłonki poczwarki lub z poczwarki, trzymam poczwarkę pęsetą w lewej ręce, a następnie za pomocą igły w prawej ręce usuwam przednią część osłonki poczwarki.Następnie przesuwam z powrotem pokrywę kutykuli, przez co głowa wysuwa się z przodu. Używam wtedy igły, aby przeciąć zwierzę w okolicy szyi, po czym pobieram głowę i umieszczam ją w kropli soli fizjologicznej do sekcji. Powtórzę tę procedurę od 10 do 15 razy, ponieważ aby uzyskać dobrą kulturę, preferuję posiadanie od 10 do 15 osobników każdego genotypu.W porządku, teraz usunę mózg z głowy zwierzęcia. W tym celu użyję dwóch strzykawek tuberkulinowych, z których każda posiada igłę o rozmiarze 27 G. Lewą igłę wbijam bezpośrednio przez psucie zwierzęcia, aby przytwierdzić głowę do dna szalki Petriego.Następnie prawą igłą wykonuję nacięcie po prawej stronie; to właśnie tędy będę wypychać mózg. Dobrze, kolejnym krokiem jest umieszczenie lewej igły nad lewym okiem. Teraz po prostu nacisnę, a mózg powinien zostać wypchnięty prawą stroną przez nacięcie.Oto i ono. Jest widoczne po prawej stronie, więc teraz mogę użyć prawej igły, aby oddzielić je od reszty torebki głowowej i oczu. Dobrze. Teraz, przed wykonaniem końcowej dyssekcji, która polega na usunięciu płatów wzrokowych, przenoszę mózg do czystej kropli soli fizjologicznej.Mogę do tego celu użyć pipety, pobierając materiał samą końcówką pipety o objętości 20 µL ustawionej na 5 µL, lub mogę przenieść go również za pomocą igieł. Jest to ostatni etap procedury sekcji. Odbywa się ona w świeżej kropli soli fizjologicznej, a zazwyczaj znajduje się tutaj od 10 do 15 mózgów.Następnie usuwam płaty optyczne z każdego mózgu, używając igieł o rozmiarze 27G jako narzędzi tnących; odcinam najpierw lewy płat optyczny, a następnie prawy płat optyczny w każdym mózgu. Na tym etapie wszystkie mózgi przetworzone w ten sposób są przenoszone do probówki zawierającej roztwór enzymu, który zostanie wykorzystany do dysocjacji enzymatycznej. Wszystkie mózgi jednego genotypu umieszcza się w jednej probówce typu Eppendorf z nakrętką, zawierającej 1 mL roztworu enzymu.Następnie umieszczamy je w statywie do probówek i wstawiamy na rotator, gdzie pozostają przez 10 do 15 minut w temperaturze pokojowej. Jest to właściwy czas dysocjacji. Aby zakończyć etap dysocjacji enzymatycznej, musimy teraz usunąć enzym.Następnie przenosimy probówki do wirówki EOR, umieszczamy je w urządzeniu i wirujemy przez trzy minuty przy prędkości 3000 RPM. Po odwirowaniu tkanek mózgowych przenosimy je do komory z laminarnym przepływem powietrza. W tym miejscu rozpoczyna się sterylna część procedury.Obecnie nie otwieramy probówki, chyba że znajdujemy się w komorze z laminarnym przepływem powietrza; teraz usuniemy roztwór enzymu. Zastąpimy go roztworem do dyssekcji, a następnie przeprowadzimy wirowanie i wielokrotne przemywanie, najpierw roztworem do dyssekcji, a na koniec medium Defined, w którym hodujemy komórki. Dobrze.W pierwszej kolejności muszę nanieść kroplę 5 µL soli fizjologicznej na każde z ciekiełek znajdujących się w tych szalkach Petriego. W każdej szalce znajduje się jedna ciekiełka, która została pokryta lamininą, więc nakładam kroplę 5 µL dokładnie na środek ciekiełka. To właśnie tam znajduje się moja kropla lamininy.Jest to bardzo ważne, ponieważ chcemy skoncentrować komórki dokładnie na środku pola widzenia, gdyż z jednego mózgu otrzymujemy około 10 000 komórek i właśnie z takiej ilości tworzymy jedną hodowlę. Dobrze, teraz patrząc przez mikroskop, widzimy tutaj dziewięć mózgów, które przeszły już procedurę dysocjacji enzymatycznej. Widać, że są one wciąż w dużej mierze nienaruszone.Nie posiadają one płatów optycznych. Zostały one usunięte, więc mamy tylko centralną część mózgu; teraz pobiorę pipetą pojedynczy mózg i przeniosę go do kropli o objętości 5 µL na szkiełku nakrywnym. Powtórzę tę czynność cztery razy.Biorę dwie strzykawki o pojemności 1 cc i zakładam igły o rozmiarze 27 G. Ponownie warto zaznaczyć, że są to bardzo tanie i jednorazowe narzędzia sekcyjne, dzięki czemu studenci mogą przeprowadzać tę procedurę bez obaw o budżet. Dobrze, mam teraz dwie igły i przystępuję do wstępnej dysocjacji mechanicznej, która polega na pocięciu mózgu na kilka części; pozwoli mi to za chwilę wciągnąć te fragmenty szklaną pipetą w celu przeprowadzenia końcowej dysocjacji.Podczas wykonywania tej czynności nie rozdrabniam tkanek na bardzo małe kawałki; chcę jedynie zmniejszyć ich całkowitą wielkość, aby pipeta podczas dysocjacji pobierała fragmenty nieco mniejsze niż cały mózg. Chcę również przeprowadzić ten proces stosunkowo szybko, ponieważ, jak widać, krople pożywki są małe. Oznacza to, że mamy wysoki stosunek powierzchni do objętości, a pH oraz osmolarność roztworu mogą ulec zmianie, jeśli pozostawię go na dłuższy czas.Kiedy zaczynałam to robić, przygotowywałam tylko dwa mózgi i dwie hodowle jednocześnie. Teraz zazwyczaj robię cztery i teraz zaraz zepsuję pipetę, ale nie mogę o tym mówić ani nic takiego, prawda? Tę właśnie skończyłam.Dysocjacja, rozmiar pipety był odpowiedni. Mogłam zassać tkankę i kilkakrotnie ją przepompować; widać pojedyncze komórki, choć wciąż występują skupiska, ale to dopuszczalne. Zostaną one wypłukane.Kultury, niezwłocznie po wysianiu, umieszcza się w drugiej płytce Petriego, a następnie w ciągu kilku minut przenosi do inkubatora z CO2, aby zapewnić utrzymanie pH oraz osmolarności na poziomie sprzyjającym ich przeżyciu. Pozostawiamy je tam na 30 minut przed zalaniem płytki. Kultury te zostały przygotowane z mózgów poczwarek w późnym stadium rozwoju.Kultura była hodowana przez dwa dni w inkubatorze CO2 i można dostrzec poszczególne komórki z wydłużonymi wypustkami. Stopień rozwoju wypustek jest mniejszy niż ten, który obserwuje się w piątym dniu, i większy niż w pierwszym dniu. Nazywam się Jorge Ano.Pracuję w laboratorium Doubts. Pokażę wam teraz, w jaki sposób przeprowadzamy eksperyment obrazowania wapnia w kulturach komórek, które właśnie przygotowaliśmy. Jest to film z eksperymentu obrazowania wapnia, na którym widać niebieskie komórki wskazujące niski poziom wapnia oraz czerwone komórki wskazujące wysoki poziom wapnia.Zauważymy, że niektóre komórki zmieniają kolor na czerwony, co wskazuje na wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia. Zjawiska te są spontaniczne i przejściowe. Z czasem poziom wapnia powraca do wartości bazalnych, a po pewnym czasie podamy lek, w tym przypadku nikotynę, i zaobserwujemy wzrost wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia w komórkach.Podajemy nikotynę przez 100 sekund, następnie ją wypłukujemy, po czym poziom wapnia w komórkach powraca do wartości podstawowych. Główną zaletą tego systemu hodowli jest możliwość tworzenia kultur z linii much transgenicznych i mutantów, w których różne subpopulacje neuronów są znakowane za pomocą GFP. Jest to mózg jednej z wykorzystanych przez nas linii, w której GFP jest ekspresowane w ciałkach grzybowych, konkretnie w komórkach Kenyon&#8230; neuronach zaangażowanych w pośredniczenie w złożonych zachowaniach, w tym w uczeniu się i pamięci.Ciała komórek znajdują się w grzbietowej części mózgu, w okolicy wskazanej czerwonymi strzałkami. Te struktury w kształcie litery L, wykazujące pozytywny sygnał GFP, są w rzeczywistości projekcjami aksonalnymi tych komórek ciał grzybowych. Po dysocjacji tej tkanki mózgowej.Neurony regenerują swoje wypustki w hodowli, co pozwala na łatwą identyfikację komórek Kenyan pozytywnych pod kątem GFP w tym przypadku. Są one dostępne zarówno dla standardowych rejestracji elektrofizjologicznych, jak i badań obrazowania wapnia. W związku z tym hodowle te stanowią niezwykle użyteczne narzędzia do badania czynników genetycznych i środowiskowych, które są istotne w regulacji funkcji neuronów, o których wiadomo, że odgrywają kluczową rolę w pośredniczeniu w złożonych zachowaniach u dorosłego zwierzęcia.

primary-neuronal-cultures-from-brains-late-stage-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kultury Neuronów Pierwotnych z Mózgu Poźnych Stadialarnych Larwy Drosophila

Niniejszy film demonstruje przygotowanie pierwotnych kultur neuronalnych z embrionów Drosophila w stadium środkowej gastruli. Widoki żywych kultur przedstawiają komórki 1 godzinę po wysianiu oraz zróżnicowane neurony po 2 dniach wzrostu w zdefiniowanym medium opartym na wodorowęglanach. Neurony te są elektrycznie pobudliwe i tworzą połączenia synaptyczne.

Przygotowanie kultur neuronalnych z zarodków Drosophila w stadium środkowej gastruli

Niniejszy artykuł opisuje metodę, za pomocą której można naśladować in vivo opracowanie Muszka owocówka ciało grzybowate w ex vivo system...

Hodowla ex vivo całych, rozwijających się mózgów Drosophila

Ten film demonstruje protokół do identyfikacji czynników egzogennych, które inicjują reaktywację nerwowych komórek macierzystych mózgu Drosophila ze stanu spoczynku. Świeżo wyklute larwy są preparowane w celu wyizolowania ich mózgów, które są następnie hodowane w pożywce z lub bez hormonu testowego w celu oceny potencjału hormonu do indukowania reaktywacji i proliferacji nerwowych komórek macierzystych.

Analiza reaktywacji nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila

Opisano paradygmat uszkodzeń wykorzystujący brzuszny rdzeń nerwowy larw Drosophila do badania regeneracji i naprawy ośrodkowego układu nerwowego. Dźganie, a następnie laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna w próbkach poklatkowych i utrwalonych, w połączeniu z analizą ilościową za pomocą celowo opracowanego oprogramowania i genetyki, są wykorzystywane do badania molekularnych mechanizmów regeneracji i naprawy OUN.

Paradygmat urazów do badania naprawy ośrodkowego układu nerwowego u Drosophila

Komórki S2 Drosophila i hodowane neurony są świetnymi systemami do obrazowania transportu organelli napędzanych motorycznie in vivo. Tutaj opisujemy szczegółowe protokoły hodowli obu typów komórek, ich obrazowania i analizy transportu.

Transport organelli w hodowanych komórkach Drosophila: linia komórkowa S2 i neurony pierwotne.

Barwienie immunologiczne jest skuteczną techniką wizualizacji określonych typów komórek i białek w tkankach. Wykorzystując sonikację, opisany tutaj protokół łagodzi potrzebę preparowania tkanek Drosophila melanogaster z zarodków i larw w późnym stadium przed barwieniem immunologicznym. Zapewniamy skuteczną metodologię barwienia immunologicznego całych larw utrwalonych formaldehydem.

Wspomagane sonikacją barwienie immunofluorescencyjne tkanek drobnoustrojowych i larwalnych drobnoustrojowych i larwalnych Drosophila in situ

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Celem tego protokołu jest stworzenie ex vivo hodowli mózgu larw Drosophila zoptymalizowanej do monitorowania okołodobowych rytmów molekularnych za pomocą długoterminowego fluorescencyjnego obrazowania poklatkowego. Omówiono również zastosowanie tej metody do testów farmakologicznych.

Obrazowanie na żywo fluorescencji w rozdzielczości pojedynczej komórki zegarów okołodobowych Drosophila w hodowli mózgu larw

Ten artykuł zawiera szczegółowe protokoły zadawania penetrującego urazowego uszkodzenia mózgu (PTBI) dorosłym Drosophila i badania wynikającej z tego neurogenezy.

Stymulowanie i analiza neurogenezy dorosłych w centralnym mózgu Drosophila

Ustalono metodę reaktywacji uśpionych nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila. Za pomocą tej metody można oddzielić rolę sygnałów ogólnoustrojowych od sygnałów wewnętrznych w tkance w regulacji spoczynku, wejścia i wyjścia nerwowych komórek macierzystych.

Reaktywacja nerwowych komórek macierzystych w hodowanych eksplantatach mózgu Drosophila

Poznaj metodę przygotowania pierwotnych kultur neuronowych z mózgów poczwarek Drosophila w późnym stadium. Technika ta umożliwia obserwację wzrostu neurytów i badanie dynamiki wapnia w neuronach przy użyciu obrazowania Fura-2.

Pierwotne kultury neuronalne z mózgów poczwarki Drosophila w późnym stadium rozwoju

Przeglądaj więcej filmów