Name: In-vivo Wirowanie zarodków Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-23T16:55:00.000+00:00
Duration: 13 min 54 s
Description: Poznaj metodę separacji organelli w żywych zarodkach Drosophila przez wirowanie w agarze. Technika umożliwia analizę lokalizacji białek i badania biochemiczne bez artefaktów związanych z uszkodzeniem komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy Susan Gerbi, Heidi Smith oraz Davidowi Lambertowi za dostarczenie materiału do testowania wirowania in-vivo odpowiednio na Sciara coprophila i Ilyanassa obsoleta. Dziękujemy członkom laboratorium Welte za uwagi dotyczące techniki i manuskryptu. Opracowanie i udoskonalenie testu wirowania in-vivo zostało wsparte grantem NIGMS GM64687 przyznanym MAW. Obrazy przedstawione na Rys. 1 oraz Rys. 5E,F zostały opublikowane wcześniej2 i są tutaj przedrukowane za zgodą autorów.

<ol><li>Roberts, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Looking+at+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila%3A+A+Practical+Approach%22%5BJournal%5D)">Looking at embryos.</a> Drosophila: A Practical Approach. , 2nd Edition, University Press. Oxford. 179-214 (1998).</li>
<li>Cermelli, S., Guo, Y., Gross, S. P., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lipid+droplet+proteome+reveals+that+droplets+are+a+protein+storage+depot%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The lipid droplet proteome reveals that droplets are a protein storage depot.</a> Curr Biol. 16, 1783-1795 (2006).</li>
<li>Kiehart, D. P., Crawford, J. M., Montague, R. A. Quantitative microinjection of Drosophila embryos. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKiehart%2C+DP+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 345-359 (2000).</li>
<li>LaJeunesse, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+new+Drosophila+markers+of+intracellular+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Three new Drosophila markers of intracellular membranes.</a> Biotechniques. 36 (784-788), 790-790 (2004).</li>
<li>Schuh, M., Lehner, C. F., Heidmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+Drosophila+CID%2FCENP-A+and+CENP-C+into+centromeres+during+early+embryonic+anaphase%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Incorporation of Drosophila CID/CENP-A and CENP-C into centromeres during early embryonic anaphase.</a> Curr Biol. 17, 237-243 (2007).</li>
<li>Clarkson, M., Saint, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+His2AvDGFP+fusion+gene+complements+a+lethal+His2AvD+mutant+allele+and+provides+an+in+vivo+marker+for+Drosophila+chromosome+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22DNA+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A His2AvDGFP fusion gene complements a lethal His2AvD mutant allele and provides an in vivo marker for Drosophila chromosome behavior.</a> DNA Cell Biol. 18, 457-462 (1999).</li>
<li>Welte, M. A., Gross, S. P., Postner, M., Block, S. M., Wieschaus, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+regulation+of+vesicle+transport+in+Drosophila+embryos%3A+forces+and+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Developmental regulation of vesicle transport in Drosophila embryos: forces and kinetics.</a> Cell. 92, 547-557 (1998).</li>
<li>Tran, S. L., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((unpublished+observations%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">unpublished observations.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+analysis+of+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Drosophila+Protocols%22%5BJournal%5D)">Fluorescent analysis of Drosophila embryos.</a> Drosophila Protocols. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. 141-157 (2000).</li>
<li>Guo, Y., Jangi, S., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle-specific+Control+of+Intracellular+Transport%3A+Distinctly+Targeted+Isoforms+of+the+Regulator+Klar%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Organelle-specific Control of Intracellular Transport: Distinctly Targeted Isoforms of the Regulator Klar.</a> Mol Biol Cell. 16, 1406-1416 (2005).</li>
<li>Meyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overlapping+Functions+of+Argonaute+Proteins+in+Patterning+and+Morphogenesis+of+Drosophila+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Overlapping Functions of Argonaute Proteins in Patterning and Morphogenesis of Drosophila Embryos.</a> PLoS Genet. 2, 1224-1239 (2006).</li>
<li>Shubeita, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consequences+of+motor+copy+number+on+the+intracellular+transport+of+kinesin-1-driven+lipid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Consequences of motor copy number on the intracellular transport of kinesin-1-driven lipid droplets.</a> Cell. 135, 1098-1107 (2008).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lipid-droplet+transport+by+the+Perilipin+homologue+LSD2%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of lipid-droplet transport by the Perilipin homologue LSD2.</a> Curr. Biol. 15, 1266-1275 (2005).</li>
<li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpublished+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unpublished Observations.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Phadnis, N., Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpublished+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unpublished Observations.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+XXII%3A+The+redistribution+of+the+visible+materials+of+the+egg+by+centrifuging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Embryology%22%5BJournal%5D)">Chapter XXII: The redistribution of the visible materials of the egg by centrifuging.</a> Experimental Embryology. , Columbia University Press. New York. (1927).</li>
<li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpublished+Observations%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unpublished Observations.</a> , Forthcoming.</li>
<li>Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+oogenesis+and+embryogenesis+resulting+from+centrifuging+Drosophila+melanogaster+females%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Abnormal oogenesis and embryogenesis resulting from centrifuging Drosophila melanogaster females.</a> J Embryol Exp Morphol. 40, 65-81 (1977).</li>
</ol>

Brak declared conflictów interesów.

Kluczowe etapy
Należy upewnić się, że stężenie agaru jest odpowiednio wysokie. Jeśli będzie ono zbyt niskie, agar ulegnie dezintegracji podczas wirowania, a zarodki pękną lub zostaną rozłożone w sposób przypadkowy. Jeżeli stężenie agaru będzie tylko nieznacznie zbyt niskie lub jeśli agar będzie wilgotny (niedostatecznie wysuszony lub z niewystarczająco usuniętym nadmiarem TSS w kroku 4.3), zarodki wypłyną z otworów podczas wirowania i zostaną nieprawidłowo zorientowane. Jeśli agar zostanie nalany zbyt cienką warstwą, może on również zapaść się lub pęknąć podczas wirowania.
Należy upewnić się, że embriony nie przekroczyły stadium cellularizacji. W przeciwnym razie rozdzielenie organelli nie będzie skuteczne (Rys. 5C), ponieważ organelle zostaną uwięzione w tysiącach poszczególnych komórek. W młodszych embrionach na stadium jednej komórki organelle mogą swobodnie migrować na duże odległości i gromadzić się zgodnie ze swoją charakterystyczną gęstością. Aby uniknąć analizy zbyt starych embrionów, należy: (i) przeprowadzić wstępne zbieranie, aby samice zniosły stare jaja (krok 2.4), (ii) zbierać embriony przez maksymalnie 3 godziny (krok 2.5), (iii) wizualnie wybrać embriony przed stadium cellularizacji do zatopienia w agarze (krok 4.2), (iv) skrócić czas zatapiania, aby zapobiec rozwojowi do końca cellularizacji (krok 4.6) oraz (v) odrzucić embriony, które nie ułożyły się prawidłowo w warstwach (krok 5.6).
Nie należy skracać czasu wirowania. Chociaż w niektórych embrionach wyraźne warstwowanie będzie widoczne już po 10 minutach wirowania, stopień separacji jest niespójny w zależności od embrionu. Wirowanie przez 30 min zapewnia wysoce powtarzalne wyniki. Ponadto, im dłuższy czas wirowania, tym dłużej warstwy pozostają stabilne po zakończeniu procesu. Jest to istotne w przypadku zastosowań, w których dalsza obróbka embrionów przed użyciem zajmuje więcej czasu (np. jeśli muszą zostać przygotowane do eksperymentów z transplantacją lub zamontowane do analizy konfokalnej).
Możliwe modyfikacje
Zbiór jaj i usuwanie chorionuIstnieje wiele różnych protokołów dla kroków 2 i 3 1, 3, 9, które będą równie skuteczne jak opisane tutaj, pod warunkiem, że użyte embriony są młode, wydajność jaj jest wysoka, a odsetek embrionów o błędnie określonym stadium rozwoju jest zminimalizowany.
Wyrównanie w osi przednio-tylnej Protokół orientuje wszystkie embriony w taki sposób, aby koniec tylny był zatopiony w agarze, a koniec przedni skierowany ku górze (Rys. 3). Taka orientacja zapewnia spójność, dzięki czemu możliwe jest wykorzystanie mikropylu jako punktu orientacyjnego wskazującego, który koniec był skierowany do góry podczas wirowania (Rys. 1, 5). Jednak wraz z praktyką łatwo jest określić orientację wirowanych embrionów po charakterystycznym wyglądzie kropel lipidowych i warstw żółtka w mikroskopii w świetle przechodzącym. Dzięki temu możliwe staje się montowanie embrionów dowolnym końcem do góry; taka elastyczność przyspiesza proces montażu.
Wirowanie nieukierunkowane Najbardziej czasochłonnym i wymagającym technicznie etapem protokołu jest osadzanie embrionów w agarze (krok 4). Wymaga ono dwukrotnego dotknięcia każdego embrionu (raz w celu umieszczenia go w otworze i raz w celu jego odzyskania po wirowaniu). Alternatywnie, w kroku 4.1 embriony można przenieść do probówek do mikrocentryfugi wypełnionych TSS. Podczas wirowania tych probówek w mikrocentryfudze (13,000 rpm, 10-30 min), embriony zazwyczaj również ulegają wyraźnemu rozwarstwieniu 10-13. Ta modyfikacja pozwala na bardzo szybkie przetworzenie setek embrionów jednocześnie. Jednakże rozwarstwienie nie jest tak spójne; u części embrionów nie powstają wyraźne warstwy pomimo znacznie wyższych sił odśrodkowych (~16,000 g) niż stosowane w powyższym protokole. Bardziej problematycznym aspektem jest fakt, że orientacja embrionów jest zmienna i można zaobserwować separację pod różnymi kątami względem głównej osi embrionu. Ta zmienność wymaga od eksperymentatora ustalenia po wirowaniu, w jaki sposób dany embrion był ułożony w probówce wirówki. Przy wykorzystaniu autofluorescencji żółtka jako markera najgęstszej części embrionu jest to często możliwe, choć wymaga to wprawy i większej oceny w celu uzyskania wiarygodnych wyników. Jeśli w próbce znajduje się wystarczająca liczba embrionów, można wyselekcjonować te przypadki, w których embriony zostały ułożone analogicznie do Fig. 1.
Wirowanie embrionów w skorupce jajowejMożliwe jest osadzenie embrionów w agarze do kroku 4 bez uprzedniego usuwania chorionu 2. W tym podejściu embriony na płytce zbierającej są pokryte olejem halowęglowym zamiast 50% wybielacza w kroku 3.2 (olej halowęglowy sprawia, że chorion staje się półprzezroczysty). Wybierane są embriony na odpowiednich stadiach rozwoju, które następnie przenosi się pęsetą na nową płytkę z agarem; aby uniknąć uszkodzenia samego embrionu, pęsetą chwyta się wyłącznie włókna jajowe. Embriony są osadzane zgodnie z krokami 4.4–4.8, tak aby przednie włókna jajowe wystawały z otworu w agarze. Skorupka jajowa jest usuwana poprzez traktowanie 50% wybielaczem po tym, jak embriony zostały odwirowane i wyjęte z agaru zgodnie z krokiem 5.4. Wirowanie w obecności skorupki jajowej może poprawić stopień dewitelinizacji po utrwaleniu (krok 6.2), jednak dobór odpowiednich stadiów do wirowania (krok 4.2) jest trudniejszy.
Zastosowania
Wirowanie zarodków jest szczególnie użyteczne w eksperymentach dotyczących kolokalizacji, t.j. w celu sprawdzenia, czy konkretne białko lokalizuje się w określonym głównym organellum. Na przykład białko Klar występuje w wczesnych embrionalnych kropelkach lipidowych, jednak wykazanie tej lokalizacji w nienaruszonych zarodkach jest trudne. Wynika to częściowo z faktu, że zarówno punkty Klar, jak i kropelki lipidowe są obficie rozmieszczone na obwodzie zarodka 10, co sprawia, że trudno wykluczyć pozorną kolokalizację. Wirowanie koncentruje jednak kropelki lipidowe w wyraźnej warstwie, dzięki czemu kolokalizacja z sygnałem Klar staje się oczywista 10.
Podobna analiza jednoznacznie wykazała lokalizację innych białek w kroplach lipidowych 8, 13-15, w tym zaskakujące przykłady, takie jak niektóre histony 2, a także przypadki, w których białko występuje powszechnie, ale jest wzbogacone w kroplach lipidowych 8. Ponieważ embriony można selekcjonować wizualnie według stadium rozwoju (krok 4.2), możliwe jest nawet wykrycie regulowanej rozwojowo rekrutacji białek do kropli lipidowych 8, 15. Badanie kolokalizacji z kroplami lipidowymi jest szczególnie łatwe, ponieważ krople lipidowe gromadzą się w wizualnie wyraźnej „czapeczce”, zatem do zidentyfikowania tej warstwy nie jest wymagany żaden dodatkowy marker ani barwienie. W rzeczywistości, ze względu na prostotę i potencjalnie uderzające wyniki wizualne (Ryc. 1, Ryc. 5 D, E), nasze laboratorium stosuje obecnie tę technikę rutynowo jako pierwszy test sprawdzający, czy kandydujące białko lokalizuje się w kroplach lipidowych. W zasadzie podobne badania kolokalizacji powinny sprawdzić się w przypadku innych organelli przedstawionych na Ryc. 1, a prawdopodobnie także innych (w tym pasożytów wewnątrzkomórkowych), których rozmieszczenie w odwirowanych embrionach nie zostało jeszcze udokumentowane.
Ponieważ wirowanie koncentruje organelle w wąskich pasmach, ułatwia ono izolację frakcji wzbogaconej w te organelle. Podejście to zostało już wykorzystane do odzyskiwania kropel lipidowych w celu ich transplantacji do embrionów dawców 2. Możliwa może być również analiza biochemiczna wzbogaconej frakcji (np. poprzez wycinanie warstw z embrionów po utrwaleniu 15).
Opisana tutaj metoda znajduje zastosowanie nie tylko w przypadku embrionów Drosophila, ponieważ wirowanie można wykorzystać do stratyfikacji jaj wielu różnych gatunków (w tym żab, nicieni, tunegatów, pierścienic, jeżowców, mięczaków i parzydełkowców) 16. W naszym laboratorium powyższy protokół zastosowaliśmy dla embrionów muchy domowej Musca domestica 2, a wirowanie nieorientowane wykorzystaliśmy w analizie embrionów ziemiórki Sciara coprophila 17 oraz ślimaka Ilyanassa obsoleta 17. Co więcej, metoda ta nie ogranicza się wyłącznie do embrionów: wirowanie może być również przydatne do stratyfikacji innych dużych komórek, takich jak oocyty (np. u Drosophila 2, 18 oraz pluskwiaka Oncopeltus fasciatus 17). Dla różnych okazów należy zoptymalizować dokładne warunki wirowania: na przykład 10 minut przy 3000 g jest wystarczające do efektywnej stratyfikacji embrionów Musca domestica 2, a przy znacznie dłuższym wirowaniu embriony mają tendencję do rozpadania się podczas fiksacji i immunobarwienia.

<table><tbody><tr><td>Szalki Petriego 60x15 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>#35-1007</td><td>Od Falcon</td></tr><tr><td>Sito z drutu</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>CX-0150</td><td>stal nierdzewna typ 304; rozmiar oczka #150 x150, średnica drutu: 0.0026 inches</td></tr><tr><td>Igły wolframowe</td><td>Fine Science Tools</td><td>10130-10</td><td>0.25 mm</td></tr><tr><td>Niklowany uchwyt do pinów/igieł Moria</td><td>Fine Science Tools</td><td>26016-12</td><td></td></tr><tr><td>Klatki dla muszek</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-100 lub 59-101</td><td>Odpowiednio do szalek Petriego o średnicy 65 mm lub 100 mm</td></tr><tr><td>Olej Halocarbon 27</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8773</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vivo wirowanie zarodków drosophila

In-vivo Centrifugation of Drosophila Embryos

Główną strategią oczyszczania i izolacji różnych typów organelli wewnątrzkomórkowych jest ich rozdzielanie na podstawie różnic w gęstości wyporności. Jednakże, gdy komórki zostaną rozbite przed wirowaniem, białka i organelle w tym nienatywnym środowisku często niewłaściwie przylegają do siebie. W niniejszej pracy opisujemy metodę rozdzielania organelli według gęstości w nienaruszonych, żywych embrionach Drosophila. Wczesne embriony przed cellularizacją są pobierane z klatek populacyjnych, a ich zewnętrzne skorupki jaj są usuwane poprzez traktowanie 50% wybielaczem. Następnie embriony są przenoszone na małą płytkę agarową i wstawiane, końcem tylnym do przodu, do małych pionowych otworów w agarze. Płytki z osadzonymi embrionami są wirowane przez 30 min przy 3000g. Agar podtrzymuje embriony i utrzymuje je w określonej orientacji. Następnie embriony są wydobywane z agaru za pomocą tępej igły. Wirowanie rozdziela główne organella na oddzielne warstwy, tworząc stratyfikację łatwo widoczną w mikroskopii w świetle przechodzącym. Dostępnych jest wiele markerów fluorescencyjnych, które pozwalają potwierdzić prawidłową stratyfikację w żywych embrionach. Białka związane z określonymi organellami będą wzbogacone w konkretnej warstwie, co wykaże kolokalizację. Poszczególne warstwy można odzyskać do analizy biochemicznej lub transplantacji do jaj donorów. Technika ta znajduje zastosowanie w separacji organelli w innych dużych komórkach, w tym w jajach i oocytach różnych gatunków.

Opisujemy metodę rozdzielania organelli według gęstości w żywych embrionach Drosophila. Embriony są zatapiane w agarze i poddawane wirowaniu. Technika ta pozwala na powtarzalne rozdzielenie głównych organelli wzdłuż osi przednio-tylnej embrionu. Metoda ta ułatwia przeprowadzanie eksperymentów kolokalizacyjnych i pozwala na uzyskanie frakcji organelli do analizy biochemicznej oraz eksperymentów z transplantacją.

In-vivo wirowanie zarodków Drosophila

Główną strategią oczyszczania i izolowania różnych rodzajów organelli wewnątrzkomórkowych jest ich rozdzielanie na podstawie różnic w ...

Separacja głównych organelli wewnątrz jaj muszki owocowej na podstawie gęstości rozpoczyna się od zbioru embrionów w wieku poniżej trzech godzin. Następnie, po dekoracji, skorupki jaj są usuwane poprzez inkubację w 50% bleach. Embriony na określonych etapach rozwoju są osadzane w agarze.W ostatnim kroku zarodki poddaje się wirowaniu i odzyskiwaniu, a następnie bada je w świetle przechodzącym oraz fluorescencyjnym. Mikroskopia pozwala określić lokalizację konkretnych białek w określonych organellach. Główną strategią oczyszczania i izolowania organelli wewnątrzkomórkowych jest oddzielanie ich od pozostałych składników komórkowych na podstawie gęstości, jednak wyzwaniem jest fakt, że podczas rozbijania komórek przed wirowaniem białka i organelle, które zazwyczaj są rozdzielone, mogą ulec zmieszaniu.W tych nienatywnych warunkach in vitro niektóre białka mogą do siebie przywierać. Z kolei inne białka mogą odrywać się od struktur, z którymi zazwyczaj się wiążą. Główną zaletą techniki, którą zamierzamy opisać, jest to, że umożliwia ona rozdzielanie według gęstości in vivo.Dzięki temu uniknięto konieczności rozbijania komórek oraz towarzyszących temu artefaktów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki. Znacznie ułatwia ona przeprowadzanie eksperymentów z kolokalizacji oraz umożliwia izolację specyficznych frakcji organellowych do eksperymentów z transplantacją oraz do analiz biochemicznych.W niniejszej procedurze przygotowano podłoże agarowe o wysokim stężeniu zawierające sok jabłkowy i wylano je na płytki zgodnie ze szczegółami opisanymi w towarzyszącym protokole pisemnym. Płytki są wykorzystywane zarówno na etapie składania jaj, jak i podczas późniejszego zatapiania oraz wirowania embrionów. Procedura rozpoczyna się od zainicjowania procesu zbierania jaj.Najpierw przygotuj pastę drożdżową, mieszając suche drożdże z wodą do uzyskania konsystencji masła orzechowego. Następnie pokryj część świeżej płytki z agarem z sokiem jabłkowym pastą drożdżową. Dorosłe muchy utrzymuje się w klatkach, do których w dolnej części przymocowane są płytki z agarem.Aby usunąć aktualną płytkę, odwróć klatkę z muchami i uderz nią o blat stołu. Po kilku uderzeniach muchy spadną na dno i zostaną na krótką chwilę zdezorientowane. Szybko zastąp starą płytkę agarową nową płytką z nałożoną pastą drożdżową.Drożdże zapewniają odżywienie niezbędne do produkcji jaj i wraz z sokiem jabłkowym w agarze indukują ich składanie. Należy odrzucić jaja zebrane w ciągu pierwszych 30 do 60 minut. Zawierają one dużą frakcję embrionów o nieprawidłowym stadium rozwoju, ponieważ były one przetrzymywane przez samice po zapłodnieniu.Kolejne zbiory jaj mają tendencję do dominacji jaj zdeponowanych krótko po zapłodnieniu. Zbieraj jaja przez maksymalnie trzy godziny, ponieważ najbardziej spójne ułożenie warstw uzyskuje się w przypadku młodych embrionów. Preferowany jest krótszy czas zbioru, wynoszący jedną godzinę lub mniej.W przypadku rutynowych eksperymentów należy użyć pęsety, aby usunąć wszystkie muchy przyklejone do drożdży lub do powierzchni płytki z agarem. Po zebraniu jaj należy usunąć skorupkę, umieścić płytkę z agarem pod mikroskopem stereoskopowym i obserwować embriony metodą oświetlenia przechodzącego. Należy zidentyfikować nitki jajowe, aby usunąć skorupkę jaja z embrionów.Wstrzyknij 50% wybielacz pod płytkę z agarem, aby przykryć zarodki, i inkubuj przez kilka minut. Okazyjnie potrząśnij płytką z agarem, aby zarodki obracały się w wybielaczu. Ponownie zbadaj jaja pod mikroskopem.Gdy filamenty jajek przestaną być widoczne, oznacza to, że chorion został pomyślnie usunięty. Zazwyczaj wymaga to od trzech do pięciu minut inkubacji w roztworze wybielacza. Następnie należy użyć koszyka z drucianej siatki jako sita, aby oddzielić embriony od wybielacza.Koszyk przygotowuje się z kwadratowego płata siatki drucianej o wymiarach dwóch centymetrów na dwa centymetry, wgniecionego w środku. Chwyć druciany koszyk pęsetą i przytrzymaj go nad odwróconą pokrywką szalki z agarem. Przelej zawiesinę z zarodków i wybielacza z szalki z agarem przez siatkę drucianą, tak aby spłynęła do pokrywki szalki.Jeśli embriony pozostały na płytce z agarem, należy spryskać płytkę wodą destylowaną, aby je odczepić, a następnie przelać wodę destylowaną wraz z zawiesiną embrionów przez drucianą siatkę. Przystaw dno siatki do ręcznika papierowego, aby odssać nadmiar cieczy. Następnie spryskaj wodą destylowaną obwód koszyka drucianego, aby wypłukać pozostałości wybielacza, minimalizując jednocześnie utratę embrionów.Często odsączaj nadmiar płynu. Powtórz etap płukania od 5 do 10 razy, aż do całkowitego usunięcia wybielacza. Jeśli koszyk druciany nadal wydziela zapach wybielacza, kontynuuj płukanie embrionów.Po odpowiednim wypłukaniu embrionów można je zamocować w agarze. Wypłucz embriony z koszyka drucianego. Po przelaniu TSS do pustej szalki Petriego embrion powinien opaść na dno.Pod stereomikroskopem obserwuj zarodki przy użyciu oświetlenia przechodzącego. Poszczególne stadia można łatwo rozpoznać wizualnie. Za pomocą pipety P 200 wybierz zarodki o pożądanych stadiach i przenieś je na małą płytkę agarową.Pracuj sprawnie, ponieważ embriony starzeją się, a przedłużone zanurzenie w TSS powyżej 30 minut może wpłynąć na ich rozwój. Za pomocą pipety usuń większość TSS, pozostawiając je na chusteczce Kim wipe.Powierzchnia agaru powinna być lekko wilgotna, co ułatwia przesuwanie embrionów. Nie powinno jednak pozostać żadnych kałuż cieczy na płytce, ponieważ nadmiar płynu podczas wirowania spowoduje wysunięcie się embrionów z otworów. Najtrudniejszym elementem tej procedury jest montaż embrionów oraz świdra.Jest to szczególnie trudne, ponieważ zarodki są delikatne i mogą zostać łatwo zniszczone przy zbyt gwałtownym obchodzeniu się z nimi. Aby temu zapobiec, igłę należy przesuwać powoli, rozważnie i w niewielkich przyrostach. Praktyka jest najlepszym sposobem na poznanie tego, jakiej sile dotyku i nacisku zarodek jest w stanie wytrzymać. Zamocuj pęsetę i igłę odwrotnie w uchwycie do igieł, tak aby podczas obserwacji wystawał tępy koniec.Pod mikroskopem należy użyć igły do wykonania pionowych otworów w agarze obok każdego zarodka; podczas nakłuwania agaru igłę trzyma się pod kątem, co pozwala na jednoczesną obserwację pod mikroskopem. Z tego powodu trudno jest wykonać otwory idealnie pionowo. Jednakże niewielkie nachylenie igły tworzy lekkie wgłębienie lub rowek po jednej stronie otworu, dzięki czemu zarodek łatwo wsuwa się wzdłuż niego i wpada do otworu.Następnie należy zidentyfikować końce przedni i tylny wydłużonych embrionów, ponieważ embriony powinny być wprowadzane do otworów w jednolitej orientacji. Zazwyczaj z końcem przednim skierowanym do góry, błona jajowa na końcu przednim charakteryzuje się wyspecjalizowaną strukturą: mikropylem. Używając tępego końca igły, należy popchnąć embrion, aby przesunąć go po agarze oraz zorientować i skierować jego koniec tylny w stronę wykonanego otworu.Następnie przesuń przedni koniec w stronę otworu. Embrion powinien z łatwością wsunąć się do otworu wzdłuż niewielkiego wgłębienia powstałego podczas nakłuwania. Gdy embrion zacznie się przechylać do góry, dociśnij go głębiej do otworu.Agar jest wystarczająco miękki, aby po częściowym włożeniu zarodka do wykonanego otworu można go było przesunąć głębiej bez powodowania uszkodzeń. Po pełnym wsunięciu zarodek zazwyczaj znajduje się już w pozycji niemal pionowej. Jeśli nie, należy ustawić włożony zarodek bardziej pionowo, naciskając go z boku.Jeśli otwór nie jest zbyt duży, agar będzie stabilnie utrzymywał embrion w określonej pozycji podczas wirowania. Dzięki wprawie możliwe jest osadzenie od 100 do 250 embrionów na jednej płytce. Liczba wymaganych embrionów zależy od planowanych dalszych zastosowań.Należy maksymalnie skrócić czas montowania. Ponieważ embriony nadal rozwijają się podczas montowania, w przypadku chęci uzyskania wąskiego stadium rozwojowego, należy usunąć pozostałe nieużyte embriony za pomocą wilgotnego pędzla. Następnie embriony zamontowane w agarze należy poddać wirowaniu.Przenieś płytki z zarodkami much do koszyków wirówki, kładąc je stroną z agarem do dołu. Upewnij się, że wirówka jest odpowiednio zrównoważona, a następnie wiruj płytki z prędkością 4 000 obr./min przez 30 minut w temperaturze od 4 do 10 °C. Po wirowaniu umieść płytkę z agarem pod mikroskopem stereologicznym i pokryj ją warstwą TSS, używając tępego końca igły.Wyjmij zarodki z otworów. Zarodki unoszą się w TSS, lecz pozostają zanurzone. Zarodki wykazują wyraźne warstwowanie: brązową czapeczkę na końcu przednim, przezroczysty region środkowy oraz ciemnoszarą strefę na końcu tylnym.Zutylizuj embriony, które nie wykazują wyraźnego warstwowania podczas bezpośredniej obserwacji za pomocą mikroskopii w świetle przechodzącym lub epi-fluorescencyjnej. Użyj pipety P 200, aby przenieść prawidłowo uwarstwione embriony w TSS do probówki do mikrocentryfugi. Następnie przenieś embriony w buforze na szkiełko przedmiotowe i zamocuj je zgodnie z opisem w towarzyszącym protokole pisemnym.Jeśli zarodki mają zostać utrwalone, należy użyć pipety P 200 do przeniesienia warstwowo ułożonych zarodków w TSS do fiolki scyntylacyjnej. Zarodki utrwala się stosując standardowe techniki utrwalania. W przypadku zarodków centryfugowanych wydajność etapu dewitalizacji jest niska.Zacznij z taką liczbą embrionów, która jest praktyczna. Jeśli embriony mają zostać wykorzystane w eksperymentach z transplantacją, przenieś je na płytki agarowe i zamocuj na szkiełkach nakrywkowych. Skorzystaj ze standardowych procedur postępowania z embrionami; odwołania do takich procedur znajdują się w protokole pisemnym.Warstwowanie wywołane wirowaniem jest stabilne przez kilkadziesiąt minut. Przedstawiono tutaj obrazy w jasnym polu żywych embrionów oph przed wirowaniem, z końcem przednim po lewej stronie i końcem tylnym po prawej stronie po stronie grzbietowej. Embriony w stadium podziału pojawiają się jednolicie: góra i strona brzuszna na dole.Zarodki w brązowym stadium, takie jak ten, są idealne do wirowania in vivo. Zarodki blaster-derm posiadają wyraźny brzeg, który wygląda podobnie z każdej strony. Ta przeźroczysta peryferia powiększa się aż do niemal końca procesu ization.Zarodki można nadal pomyślnie stratyfikować poprzez wirowanie aż do końca procesu izacji. Warstwowanie żółtka i jąder nie jest tak spójne jak w fazach podziałów. Po pojawieniu się asymetrii w zarodkach komórkowych wyraźne stają się strony grzbietowa i brzuszna, a następnie rozwijają się poszczególne fałdy.Przedstawiony zarodek znajduje się we wczesnej fazie wydłużania prążka zarodkowego. Na tych etapach wirowanie nie jest już skuteczne w warstwowaniu głównych organelli. Embrionogeneza jest procesem ciągłym.W związku z tym etapy te nie są oddzielnymi jednostkami, lecz płynnie przechodzą jeden w drugi w miarę postępu rozwoju. Ten film poklatkowy przedstawia cztery godziny embriogenezy, począwszy od etapów podziałów. Proces wydłużania pasma zarodkowego został przyspieszony 720-krotnie.Poniżej przedstawiono obrazy zarodków po wirowaniu, wykonane przy użyciu oświetlenia przechodzącego. Zarodek po lewej stronie uległ prawidłowej stratyfikacji. Krople lipidów o niskiej gęstości tworzą tzw. czapeczkę lipidową na samym przednim końcu.Pojazdy żółtka o wysokiej gęstości gromadzą się w postaci ciemnoszarej strefy na biegunie tylnym. Te dwie warstwy są oddzielone szerokim, przejasnionym obszarem, który reprezentuje pozostałe organelle i cytoplazmę. Embrion po prawej stronie został poddany wirowaniu po izacji.Nakładanie się warstw jest minimalne, jeśli dostępny jest mikroskop fluorescencyjny epifluorescencyjny. Te żywe, wirowane zarodki można badać przy wzbudzeniu UV, podczas którego żółtko wykazuje intensywną niebieską autofluorescencję wody. Zwarta warstwa materiału autofluorescencyjnego na biegunie tylnym świadczy o prawidłowym wirowaniu i służy jako marker końca tylnego.Wygląd warstw zmienia się drastycznie, jeśli embriony zostaną utrwalone. Krople lipidów stają się półprzezroczyste, a warstwa lipidowa w świetle mikroskopu optycznego wydaje się biało-puchata, a nie ciemnobrązowa. Fluorescencja Yo corso zostaje częściowo lub całkowicie zniszczona w wyniku utrwalania, stając się znacznie mniej intensywną lub nawet niewykrywalną.Na tym obrazie organelle są znakowane markerami fluorescencyjnymi, a markery gromadzą się w charakterystycznych pozycjach wzdłuż osi przednio-tylnej. Niektóre białka fuzyjne histonów lokalizują się zarówno w kroplach lipidowych, jak i w jądrach komórkowych, dzięki czemu mogą być używane do znakowania tych przedziałów komórkowych, a także do monitorowania stadium rozwoju embrionu na podstawie liczby znakowanych jąder. Jak przed chwilą zauważono, jednym z najtrudniejszych aspektów tej procedury jest osadzenie embrionów w świdrze.Jednak dzięki praktyce będą Państwo w stanie wykonywać tę czynność szybko i sprawnie. Po opanowaniu tej techniki, eksperymenty dotyczące kolokalizacji, które w innym przypadku byłyby nużące, stają się bardzo proste.Na przykład w naszym laboratorium rutynowo stosujemy tę technikę, aby za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej sprawdzić, czy interesujące nas białko lokalizuje się w konkretnym głównym organellum. Ponadto poszczególne warstwy można odzyskać z wirówek z embrionami w celu przeprowadzenia analizy biochemicznej lub eksperymentów z transplantacją. Technika ta jest przydatna nie tylko w przypadku embrionów muszki owocowej.Wirowanie pozwala również na rozdzielanie organelli ze względu na gęstość w jajach innych gatunków oraz w innych dużych typach komórek, takich jak cyty.

in-vivo-centrifugation-of-drosophila-embryos

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In-vivo centryfugacja zarodków Drosophila

Przedstawiamy szczegółowy protokół przygotowania pierwotnych komórek wydzielonych z embrionów Drosophila. Zdolność do przeprowadzania skutecznej perturbacji RNAi, wraz z innymi molekularnymi, biochemicznymi i obrazowymi metodami analizy komórek, pozwoli na rozstrzygnięcie wielu kwestii badawczych w pierwotnych komórkach Drosophila.

Podstawowe hodowle komórkowe z embrionów Drosophila w stadium gastruli

Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji aktywnej, pełnowymiarowej kinezyny z embrionów Drosophila do biofizycznych badań pojedynczych cząsteczek. Przedstawiamy sposób zbierania embrionów, przygotowania lizatu embrionalnego, a następnie polimeryzacji mikrotubul (MT). Kinezynę oczyszcza się poprzez jej unieruchomienie na mikrotubulach, odwirowanie kompleksów kinezyna-MT, a następnie uwolnienie kinezyny z mikrotubul poprzez dodanie ATP.

Izolacja i oczyszczanie kinezyny z embrionów Drosophila

Kinetochor jest miejscem, w którym SAC inicjuje swój sygnał monitorujący segregację mitotyczną siostrzanych chromatyd. Opisano metodę wizualizacji rekrutacji i wymiany jednego z białek kinetochoru oraz jej koordynacji z ruchem chromosomów w embrionach Drosophila przy użyciu laserowego skanującego systemu konfokalnego Leica.

Badanie punktu kontrolnego mitozy poprzez obrazowanie dynamicznego zachowania białek kinetochorowych i ruchu chromosomów w żywych zarodkach syncytialnych Drosophila

Tutaj opisujemy protokół hybrydyzacji in situ (FISH) do określania właściwości ekspresji i lokalizacji RNA wyrażanych podczas embriogenezy u muszki owocowej, Drosophila melanogaster.

Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ zarodków Drosophila z całą górą RNA

Wieloskładnikowe kompleksy białkowe odgrywają kluczową rolę podczas funkcjonowania i rozwoju komórek. W tym miejscu opisujemy metodę stosowaną do izolowania natywnych kompleksów białkowych z zarodków Drosophila po sieciowaniu in vivo, a następnie oczyszczeniu usieciowanych kompleksów w celu późniejszej analizy strukturalno-funkcjonalnej.<br...

Sieciowanie in vivo w celu wyizolowania kompleksów białkowych z zarodków Drosophila

Celem tego protokołu jest zapewnienie prostego i taniego podejścia do zbierania zarodków Drosophila na średnią skalę (0,5-1 g) i przygotowywania ekstraktów białkowych, które mogą być używane w dalszych zastosowaniach proteomicznych, takich jak spektrometria mas z oczyszczaniem powinowactwa (AP-MS).

Przygotowanie na średnią skalę ekstraktów z zarodków Drosophila do eksperymentów proteomicznych

Ta praca opisuje protokół generowania bibliotek Hi-C o wysokiej rozdzielczości in situ z ciasno zaszczepionych zarodków Drosophila melanogaster przed gastrulacją.

Generowanie bibliotek wychwytywania konformacji chromatyny w całym genomie z ciasno zainscenizowanych wczesnych zarodków Drosophila

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji i jednoczesnego obrazowania wielu zarodków Drosophila podczas rozwoju embrionalnego za pomocą obrazowania o wysokiej zawartości na płytce.

Przygotowanie zarodków Drosophila i mikroiniekcja do mikroskopii żywych komórek wykonana przy użyciu automatycznego analizatora o wysokiej zawartości

Tutaj udostępniamy protokół sekcji wymagany do zobrazowania na żywo późnej embrionalnej męskiej gonady Drosophila. Protokół ten pozwoli na obserwację dynamicznych procesów komórkowych w normalnych warunkach lub po manipulacji transgenicznej lub farmakologicznej.

Sekcja i obrazowanie na żywo późnej embrionalnej gonady Drosophila

Tutaj przedstawiono protokół implementacji mikroskopii ekspansywnej we wczesnych zarodkach Drosophila w celu uzyskania obrazowania w superrozdzielczości przy użyciu konwencjonalnego laserowo-skaningowego mikroskopu konfokalnego.

Wykorzystanie mikroskopii ekspansywnej do fizycznego powiększenia całych zarodków Drosophila w celu obrazowania w superrozdzielczości

Ten artykuł bierze za przykład transgenezę za pośrednictwem integrazy phiC31 u Drosophila i przedstawia zoptymalizowany protokół mikroiniekcji zarodka, kluczowy krok do tworzenia transgenicznych muszek.

Mikroiniekcja zarodka w celu transgenezy u Drosophila

Poznaj metodę separacji organelli w żywych zarodkach Drosophila przez wirowanie w agarze. Technika umożliwia analizę lokalizacji białek i badania biochemiczne bez artefaktów związanych z uszkodzeniem komórek.

In-vivo wirowanie zarodków Drosophila

Przeglądaj więcej filmów