Drosophila Test kopania i tunelowania: metoda oceny niedotlenienia tkanek u larw much

- Aby ustawić klatkę do pobierania zarodków, użyj płytek agarowych z sokiem winogronowym uzupełnionych świeżą pastą drożdżową i umieść płytki na klatkach zawierających samce i samice much Drosophila o odpowiednim genotypie. Zapach drożdży i soku winogronowego jest atrakcyjny i sprzyja składaniu jaj przez samice. Pozwól na składanie jaj przez określony czas. Następnie usuń dorosłe osobniki i inkubuj płytki zarodkowe przez 24 godziny, aby uzyskać pierwsze larwy w stadium rozwojowym. Następnie delikatnie przenieś kilka pojedynczych larw z talerza z sokiem winogronowym na płytkę testową zawierającą tylko agar, na której wycięto otwór w agarze na środku płytki i wypełniono go pastą drożdżową.

Młode larwy muszą się żywić, aby przybrać na wadze, aby się rozwinąć, więc zakopują się w źródle pożywienia, paście drożdżowej. W miarę rozwoju larwy wchodzą w fazę wędrówki i drążą tunele z dala od pokarmu, aby znaleźć miejsce do przepoczwarzenia. Aby ocenić niedotlenienie, należy zbadać wzorce tunelowania, jakie larwy tworzą w podłożu. Brak lub niewystarczające tunelowanie jest oznaką niedoboru tlenu. W przykładowym protokole zobaczymy, jak skonfigurować test kopania i tunelowania.

- Skonfiguruj kontrolne i eksperymentalne krzyżówki genetyczne w naczyniach do składania jaj zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Trzymaj muchy w ciemności przez co najmniej dwa dni przed rozpoczęciem zbierania jaj o określonej porę. W celu zbierania jaj na czas przenieś dorosłe osobniki na nowe talerze z agarem winogronowym ozdobione świeżym rozmazem pasty drożdżowej wcześnie rano i pozwól dorosłym osobnikom złożyć jaja na talerzach przez cztery godziny. Po czterech godzinach przenieś dorosłe osobniki na świeże talerze z agarem winogronowym.

Następnie inkubuj czterogodzinne płytki zbiorcze przez noc w temperaturze 25 stopni Celsjusza. Do następnego popołudnia większość larw zdąży się wykluć. Zaplanuj, aby mieć co najmniej 50 osób w każdej grupie eksperymentalnej.

Dla pojedynczej serii testu należy przygotować co najmniej pięć płytek testowych na grupę doświadczalną. Dodaj 16 gramów agaru muchowego do 700 mililitrów wody dejonizowanej przez ogrzewanie. Przygotuj 17,5 mililitra Nipagen w 95% etanolu. Podgrzej roztwór agaru, aż prawie całkowicie się rozpuści. Następnie dodaj roztwór Nipagen do roztworu agaru i podgrzewaj, aż agar całkowicie się rozpuści. Krótko ostudzić roztwór agaru, a następnie załadować 10-centymetrowe płytki 15 mililitrami roztworu agaru. Gdy agar się zżeluje, nałóż pokrywki na płytki i pozostaw je do wyschnięcia w temperaturze pokojowej na kilka godzin lub na noc.

Utwardzony agar musi być twardy w dotyku i odporny na kruszenie się po wycięciu z niego kawałków. Gdy agar utwardzi się, użyj 1,5-centymetrowej świdra korkowego, aby zrobić centralny otwór w żelu agarowym na każdej płytce. Następnie starannie wypełnij otwory świeżą pastą drożdżową.

Aby przenieść larwy na płytkę testową, wykonaj proste narzędzie. Zegnij krzywą w końcówce plastikowej mikroszpatułki i zanurz końcówkę w paście drożdżowej, aby przykleiła się do larw. Teraz podnieś pojedynczo pierwsze larwy w stadium rozwojowym i umieść je na talerzu agarowym w pobliżu kopca żywności. Dla każdej grupy doświadczalnej przygotuj co najmniej pięć płytek, z których każda zawiera 10 larw.

Aby zapewnić odtwarzalność między powtórzeniami testów, bardzo ważne jest, aby na każdej płytce testowej umieścić tylko 10 larw. Pamiętaj, aby dokładnie sprawdzić płytkę testową, aby ustalić, że za każdym razem, gdy dostarczasz larwę za pomocą końcówki mikroszpatułki, przenoszona jest tylko jedna larwa.

Po załadowaniu talerza oznacz go, przykryj, a następnie umieść w ciemności pokrywką do góry w temperaturze pokojowej. Badaj każdą płytkę codziennie, aż wszystkie larwy obumrą lub przepoczwarzą się. Poniżej znajdują się przykłady płytek dla szczepu typu dzikiego od drugiego do ósmego dnia testu. Drugiego dnia larwy są zakopywane w pożywieniu i nie dochodzi do tunelowania. Drążenie tuneli rozpoczyna się trzeciego dnia i osiąga maksimum między piątym a ósmym dniem, gdy larwy przestają wędrować i przepoczwarzają się w swoich tunelach.

Ostrożnie przenieś poczwarki za pomocą wygiętej igły do drażnienia na talerz winogronowy i, jeśli chcesz, policz, ile poczwarek się zamyka. Zwróć uwagę na powstawanie poczwarek i oceń poczwarki pod kątem nieprawidłowości.