Name: Wielkoskalowe badania przesiewowe bibliotek metagenomicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 5 s
Description: Poznaj metodę automatycznego inokulowania bibliotek metagenomicznych na membrany nylonowe przy użyciu robotyki. Technika ta umożliwia precyzyjne rozmieszczenie 10 000 kolonii, zwiększając dokładność i odtwarzalność badań genomowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Procedura hybrydyzacji
Jedna probówka do hybrydyzacji pomieści 1 lub 2 membrany (o rozmiarze 22 by 22 cm). Na każdą probówkę do hybrydyzacji należy użyć 50 ml mieszaniny do hybrydyzacji i 0,5 mg sondy DNA (stężenie końcowe 10 ng/ml). Dla uzyskania najlepszych wyników jako sondę należy zastosować DNA oczyszczone w żelu. W przypadku zwiększania skali przygotowania sondy, należy zwiększyć liczbę probówek, a nie ilość odczynników w jednej probówce.
Przygotowanie sondy (0,5 mg DNA):
<ol>
<li>Rozcieńczyć 15 μl roztworu łącznika (cross-linkera) w 60 μl wody.</li>
<li>Rozcieńczyć DNA wodą do stężenia 10 ng/μl, osiągając całkowitą objętość 50 μl w mikroprobtce z nakrętką.</li>
<li>Denaturować DNA przez 5 min w wrzącej wodzie.</li>
<li>Szybko przenieść na lód i schłodzić przez 5 min. Krótko wirować.</li>
<li>Dodać 50 μl buforu reakcyjnego i delikatnie wymieszać.</li>
<li>Dodać 10 μl odczynnika znakującego i delikatnie wymieszać.</li>
<li>Dodać 50 μl rozcieńczonego roztworu łącznika z kroku 1 i delikatnie wymieszać. Delikatnie wymieszać na wortexie i krótko wirować.</li>
<li>Inkubować w temperaturze 37°C przez 30 min.</li>
<li>Przechowywać na lodzie do 2 h lub dodać równą objętość 100% glicerolu i przechowywać w temperaturze -20°C. Uwaga: Należy używać wody dostarczonej w zestawie. Wszystkie odczynniki należy przechowywać na lodzie, chyba że wskazano inaczej.</li>
</ol>
Przygotowanie membrany i hybrydyzacja
<ol>
<li>Podgrzać 50 ml buforu do hybrydyzacji oraz probówkę do hybrydyzacji do temperatury 60°C.</li>
<li>Dodać bufor do hybrydyzacji do probówki do hybrydyzacji. Zwinąć membranę(y) i umieścić w probówce do hybrydyzacji. (W przypadku dodawania 2 membran do jednej probówki, najpierw całkowicie zwinąć jedną membranę, a następnie zwinąć drugą membranę na wierzchu w tym samym kierunku).</li>
<li>Inkubować probówkę do hybrydyzacji w temperaturze 60°C przez co najmniej ½ h. (Należy upewnić się, że membrana(y) zostały całkowicie nasączone).</li>
<li>Przenieść za pomocą długiej pipety około 1 ml buforu do hybrydyzacji z probówki do hybrydyzacji do probówki zawierającej znakowaną sondę. Delikatnie wymieszać na wirówce (vortex) i krótko odwirować. Przenieść mieszaninę z powrotem do probówki do hybrydyzacji.</li>
<li>Inkubować w temperaturze 60°C przez noc. Uwaga: Podczas pracy z membranami należy używać pęsety i rękawiczek. Zawartość probówek do hybrydyzacji należy mieszać delikatnie, ponieważ zbyt silne wytrząsanie spowoduje trwałe powstanie niepożądanej piany. Membrany powinny być dodawane w stanie wilgotnym; w razie potrzeby namoczyć je w buforze do hybrydyzacji lub wodzie i odlać nadmiar cieczy przed dodaniem.</li>
</ol>
2. Procedura detekcji
Przemywanie membran
<ol>
<li>Podgrzać główny bufor płuczący do 60°C. (Użyć kuchenki mikrofalowej i/lub płyty grzewczej).</li>
<li>Jeśli w jednej probówce do hybrydyzacji znajdują się 2 membrany, przenieść jedną membranę do czystej, podgrzanej, pustej probówki do hybrydyzacji.</li>
<li>Krótko wypłukać probówkę do hybrydyzacji około 50 ml głównego buforu płuczącego.</li>
<li>Dodać około 100 ml głównego buforu płuczącego do probówki do hybrydyzacji i inkubować w temperaturze 60°C przez 10&nbsp;min.</li>
<li>Powtórzyć kroki 3 i 4.</li>
<li>Przenieść membranę do pojemnika do płukania i inkubować w co najmniej 250 ml wtórnego buforu płuczącego w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
<li>Powtórzyć krok 6. Uwaga: Membrany można przechowywać we wtórnym buforze płuczącym w temperaturze pokojowej do ½ h przed generowaniem sygnału.</li>
</ol>
Generowanie i detekcja sygnału (procedura dla jednej błony)
<ol>
<li>Przyklej dwa kawałki folii spożywczej (SaranWrap) na płasko do blatu stołu (jeden dla kroku 2, a drugi dla kroku 4).</li>
<li>Ostrożnie usuń nadmiar buforu z membrany, dotykając jej rogów o ściankę pojemnika, a następnie przenieś membranę na folię spożywczą (stroną z próbką do góry).</li>
<li>Wlej 6-7 ml odczynnika ECF na membranę i złóż folię spożywczą tak, aby przykryła membranę. Ostrożnie rozprowadź odczynnik ECF po całej powierzchni membrany, delikatnie przesuwając chusteczką Kimwipe po folii spożywczej. Inkubuj przez 5 min.</li>
<li>Usuń nadmiar odczynnika ECF z membrany i przenieś ją na nową folię spożywczą, złóż folię nad membraną i zaklej krawędzie taśmą. Przykryj membranę folią aluminiową. Inkubuj przez 1-2 h.</li>
<li>Przygotuj szklaną płytę skanera, rozprowadzając na niej 1-2 ml odczynnika ECF. Następnie przenieś membranę na płytę szklaną (stroną z próbką do dołu) i rozprowadź kolejne 1-2 ml odczynnika ECF na membranie. Przykryj całość folią spożywczą i ostrożnie usuń wszystkie pęcherzyki powietrza z obszaru membrany. (Na folii spożywczej można położyć sztywną płytkę, aby utrzymać membranę dociśniętą do szklanej płyty).</li>
<li>Użyj skanera fluorescencyjnego Fuji FLA-5100 (tryb „1 laser 1 image”) z następującymi ustawieniami: wzbudzenie 473 nm, filtr detekcyjny LPB (510 nm), rozdzielczość 50 μm, 16-bitowa gradacja sygnału, CH1 400 V. (Skanowanie trwa około 15-20 min dla membrany o rozmiarze 22 na 22 cm). Opcjonalnie: </li>
<li>Pozostaw na 2-4 h (lub dłużej).</li>
<li>Powtórz skanowanie zgodnie z krokiem 6.</li>
</ol>
3. Procedura płukania i przechowywania (wersja NUF)
<ol>
<li>Przenieść membranę do 100% etanolu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min przy delikatnym mieszaniu.</li>
<li>Wymienić na świeży 100% etanol i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej. (Membrana może pozostać w etanolu przez kilka dni).</li>
<li>Zastąpić etanol wodą destylowaną i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
<li>Do probówki do hybrydyzacji dodać 100 ml wody i 5 ml 10% SDS (stężenie końcowe 0,5% SDS), a następnie delikatnie wymieszać. Dodać membranę.</li>
<li>Inkubować w temperaturze 80°C przez 1 h.</li>
<li>Przenieść membranę do czystego, pustego pojemnika.</li>
<li>Do zlewki dodać 500 ml wody i 5 ml 10% SDS (stężenie końcowe 0,1% SDS), a następnie doprowadzić do gwałtownego wrzenia w kuchence mikrofalowej.</li>
<li>Wylać prawie wrzący roztwór 0,1% SDS na membranę i delikatnie mieszać przez kilka minut. Pozostawić do ochłodzenia do temperatury pokojowej.</li>
<li>Płukać w co najmniej 250 ml sterylnego 100 mM Tris pH 8 przez co najmniej 10 min.</li>
<li>Zawiń membranę w folię SaranWrap i starannie zaklej brzegi taśmą. Przechowywać w temperaturze 4°C. (Membrany nigdy nie mogą wyschnąć).</li>
</ol>

Procedura strippingu nie została zoptymalizowana. Jednakże procedura strippingu podana w instrukcji producenta (po 2 płukania przez 10 min w 100% etanolu, 1 płukanie przez 1 h w 60°C w 0,5% SDS) jest niewystarczająca. Aby rozpuścić produkt reakcji ECF, konieczna jest inkubacja w 100% etanolu przez co najmniej jedną noc; wydaje się, że kilkudniowa inkubacja w 100% etanolu nie wpływa negatywnie na możliwość ponownego badania membrany. Obróbka SDS zalecana przez producenta również wydaje się niewystarczająca. NUF z sukcesem...

<table><tbody><tr><td>Odczynniki do bezpośredniego znakowania AlkPhos</td><td>zestaw</td><td>Amersham</td><td>RPN3680</td><td>Zawiera odczynnik do znakowania, roztwór łącznika krzyżującego, bufor reakcyjny, wodę, kontrolne DNA, bufor do hybrydyzacji, odczynnik blokujący. Bufor do hybrydyzacji i odczynnik blokujący przechowywać w temperaturze pokojowej, pozostałe odczynniki w temperaturze 2-8&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Podłoże ECF</td><td>zestaw</td><td>Amersham</td><td>RPN3685</td><td>Zawiera podłoże ECF, bufor do rozcieńczania podłoża ECF. Uwaga: Opakowanie zawiera łącznie 60 ml odczynnika; należy podzielić na próbki po 10 ml w probówkach Falcon i przechowywać w temperaturze 20&amp;deg;C. Zużycie wynosi około 10 ml na membranę (rozmiar 22 na 22 cm).</td></tr><tr><td>20x bufor do płukania wtórnego</td><td>bufor</td><td></td><td></td><td>121 g Tris (stężenie końcowe 1 M), 117 g NaCl (stężenie końcowe 2 M). Dostosować pH do 10. Dopełnić wodą do 1 L. Przechowywać w temperaturze 2-8&amp;deg;C do 4 miesięcy.</td></tr><tr><td>Bufor 0,5 M NaH2PO4 pH 7</td><td>bufor</td><td></td><td></td><td>69 g NaH2PO4.H2O. Dostosować pH do 7 za pomocą NaOH. Dopełnić wodą do 1 L. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td></td><td></td><td></td><td>50,8 g MgCl2.6H2O. Dopełnić wodą do 250 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>10% (w/v) SDS</td><td></td><td></td><td></td><td>20 g SDS. Dopełnić wodą do 200 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td colspan="5">Zestaw kombinowany RPN3692 = RPN3680 + RPN3685</td></tr></tbody></table>

wielkoskalowe przesiewanie bibliotek metagenomicznych

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Biblioteki metagenomiczne archiwizują duże fragmenty ciągłych sekwencji genomicznych mikroorganizmów bez konieczności ich wcześniejszej hodowli. Opracowanie usprawnionej procedury tworzenia i przesiewania bibliotek metagenomicznych jest zatem przydatne dla efektywnych, wysokoprzepustowych badań nad właściwościami genetycznymi i metabolicznymi niehodowlanych zbiorowisk drobnoustrojów. W niniejszym materiale w formie wideo przedstawiono kluczowe protokoły, co w naszej ocenie jest najużyteczniejszym formatem do precyzyjnego opisania długotrwałego procesu, który naprzemiennie opiera się na instrumentacji robotycznej i interwencjach manualnych. W pierwszej kolejności wykorzystano robotykę do naniesienia klonów z biblioteki na membrany makromacierzy o wysokiej gęstości, z których każda może zawierać powielone kolonie z dwudziestu czterech 384-dołkowych płytek bibliotecznych. Automatyzacja jest niezbędna w tej procedurze nie tylko ze względu na dokładność i szybkość, ale także ze względu na miniaturyzację skali, która jest wymagana, aby pomieścić dużą liczbę klonów bibliotecznych w bardzo gęstych układach przestrzennych. Po ich przygotowaniu zademonstrowano, w jaki sposób membrany makromacierzy mogą być przesiewane pod kątem poszukiwanych genów przy użyciu zmodyfikowanych wersji standardowych protokołów znakowania sond, hybrydyzacji membran i detekcji sygnału. Wizualną prezentację tych procedur uzupełniono szczegółowymi opisami pisemnymi poszczególnych etapów oraz listą wymaganych materiałów, które są dostępne online wraz z filmem.

Wielkoskalowe przesiewanie bibliotek metagenomicznych

Biblioteki metagenomiczne archiwizują duże fragmenty ciągłych sekwencji genomowych mikroorganizmów bez konieczności ich wcześniejszej hodowli. Tworzenie...

Naszym celem jest zaszczepienie kolonii z niektórych z tych bibliotek metagenomicznych na filtry membranowe, przy czym każdy z tych filtrów może pomieścić 10 000 kolonii. Obecnie kładę ten filtr nylonowy na bloku i go wyrównuję. Filtr znajduje się w niewielkiej ilości cieczy, którą jest pożywka wzrostowa Luria broth.Następnie przeniesie on tę nawilżoną membranę do robota, który automatycznie zaszczepi na niej 10 000 kolonii. Robotyka jest niezbędna w tego rodzaju procedurach, ponieważ żaden człowiek nie posiada rzeczywistej cierpliwości ani precyzji, aby nanieść 10 000 kolonii na jedną z takich membran. Roboty są jednym z czynników, które realnie rozwinęły naukę o genomach, umożliwiając wykonywanie bardzo powtarzalnych operacji w niewielkiej skali przestrzennej z wysoką dokładnością.W tej chwili konfigurujemy robota do zasilania tymi trzema płytkami 84-dołkowymi; każda studzienka w tych trzech płytkach 84-dołkowych zawiera pojedynczą kolonię z biblioteki metagenomicznej. Obecnie robot sterylizuje igły szczepielne, których będzie używał do nanoszenia próbek na membranę. Przechodzą one przez kilka różnych roztworów, z których jednym jest 70% etanol w celu sterylizacji, a następnie ig

large-scale-screens-of-metagenomic-libraries

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Duże skale ekranowania bibliotek metagenomowych

Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowy screening aktywności celulolitycznej z biblioteki metagenomicznej eksprymowanej w Escherichia coli. Screening opiera się na analizie w roztworze, jest wysoce zautomatyzowany i wykorzystuje chemię jednopojemnikową w mikropłytkach 384-dołkowych, z końcowym odczytem w postaci pomiaru absorbancji.

Wysokoprzepustowy screening aktywności celulazy w procesie biominingu z bibliotek metagenomicznych

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Źródło: Kim, H. i in., Wieloenzymowe przesiewowe badanie z użyciem wysokoprzepustowego systemu przesiewowe enzymów genetycznych. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje metodę przesiewania genetycznego do wykrywania ekspresji enzymów z wykorzystaniem metagenomowych bibliotek fosmidów i chromogenicznych substratów. Cytometria przepływowa identyfikuje i izoluje pojedyncze komórki produkujące produkty kolorowe, umożliwiając wysokoprzepustowy selekcję aktywnych komórek ekspresujących enzymy.

Wykrywanie ekspresji docelowych enzymów w genetycznie modyfikowanych komórkach bakteryjnych

Ten manuskrypt opisuje zautomatyzowane podejście do wyboru rozmiaru żelu do oczyszczania fragmentów DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Technologia Ranger zapewnia pełną automatyzację całego procesu ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości i wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji.

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Ta praca przedstawia metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu uniwersalnego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych, który teoretycznie można zastosować do ponad 200 enzymów. W tym przypadku pojedynczy system przesiewowy identyfikuje trzy różne enzymy (lipazę, celulazę i fosfatazę alkaliczną), po prostu zmieniając zastosowany substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu).

Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych

Metagenomics została wykorzystana do zbadania mikrobiomu paszy dla bydła na kiszonkę. Analizę przeprowadzono za pomocą sekwencjonowania typu shotgun. Podejście to wykorzystano do scharakteryzowania składu zbiorowiska mikrobiologicznego w paszy dla bydła.

Analiza metagenomiczna kiszonki

Identyfikacja fizycznych interakcji między genami a elementami regulatorowymi jest trudna, ale została ułatwiona dzięki metodom wychwytywania konformacji chromosomów. Ta modyfikacja protokołu 4C-seq łagodzi stronniczość PCR, minimalizując nadmierną amplifikację matryc PCR i maksymalizując mapowalność odczytów poprzez włączenie etapu trawienia enzymu ograniczającego dodawanie.

Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq)

Technologia CRISPR-Cas9 zapewnia efektywną metodę precyzyjnej edycji genomu ssaków w dowolnym typie komórki i stanowi nowatorski sposób przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych całego genomu. Szczegółowy protokół omawiający kroki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia zbiorczych badań przesiewowych CRISPR-Cas9 dla całego genomu znajduje się tutaj.

Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków

Ten manuskrypt opisuje metodę badań przesiewowych na skalę genomu opartą na komórkach w celu identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy.

Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Poznaj metodę automatycznego inokulowania bibliotek metagenomicznych na membrany nylonowe przy użyciu robotyki. Technika ta umożliwia precyzyjne rozmieszczenie 10 000 kolonii, zwiększając dokładność i odtwarzalność badań genomowych.

Wielkoskalowe przesiewanie bibliotek metagenomicznych

Przeglądaj więcej filmów