Wielkoskalowe przesiewanie bibliotek metagenomicznych

Naszym celem jest zaszczepienie kolonii z niektórych z tych bibliotek metagenomicznych na filtry membranowe, przy czym każdy z tych filtrów może pomieścić 10 000 kolonii. Obecnie kładę ten filtr nylonowy na bloku i go wyrównuję. Filtr znajduje się w niewielkiej ilości cieczy, którą jest pożywka wzrostowa Luria broth.

Następnie przeniesie on tę nawilżoną membranę do robota, który automatycznie zaszczepi na niej 10 000 kolonii. Robotyka jest niezbędna w tego rodzaju procedurach, ponieważ żaden człowiek nie posiada rzeczywistej cierpliwości ani precyzji, aby nanieść 10 000 kolonii na jedną z takich membran. Roboty są jednym z czynników, które realnie rozwinęły naukę o genomach, umożliwiając wykonywanie bardzo powtarzalnych operacji w niewielkiej skali przestrzennej z wysoką dokładnością.

W tej chwili konfigurujemy robota do zasilania tymi trzema płytkami 84-dołkowymi; każda studzienka w tych trzech płytkach 84-dołkowych zawiera pojedynczą kolonię z biblioteki metagenomicznej. Obecnie robot sterylizuje igły szczepielne, których będzie używał do nanoszenia próbek na membranę. Przechodzą one przez kilka różnych roztworów, z których jednym jest 70% etanol w celu sterylizacji, a następnie igły szczepielne zostaną zanurzone w płytce 84-dołkowej zawierającej wszystkie kolonie.

Obecnie próbki są sterylizowane i suszone za pomocą światła. Po wysuszeniu igieł szczepiących robot wprowadzi płytkę. Każda z tych kolonii jest w rzeczywistości odciskana i powielana, co służy jako kontrola.

W rzeczywistości poszukujemy dwóch identycznych kolonii, które wykażą sygnał w wyniku hybrydyzacji. Po naniesieniu wszystkich tych kolonii na filtr, zostaje on ponownie przyłożony do szalki z agarem, którą tutaj widzicie, a następnie inkubowany w temperaturze 37 °C przez noc.

W wyniku tego procesu każda z kolonii urośnie, a w tym układzie widać 10 000 kolonii na filtrze. Oczywiście każda z tych kolonii zawiera wiele, wiele kopii rekombinowanego DNA, w tym przypadku DNA metagenomicznego. Pochodzi ono z próbek pobranych z centralnej części północnego Oceanu Spokojnego, które przygotowaliśmy.

W następnym kroku Saltram przeniesie tę membranę do serii roztworów. Pierwszym roztworem, do którego zostanie ona przeniesiona, jest zasadowy roztwór wodorotlenku sodu, który spowoduje lizę kolonii. Powoduje on w zasadzie rozpuszczenie ścian komórkowych i uwolnienie DNA, dzięki czemu DNA może nawiązać kontakt z filtrem.

W ten sposób wszystkie ściany komórkowe bakterii w tych koloniach ulegają rozpuszczeniu, a DNA zostaje uwolnione. Po pięciu minutach w wodorotlenku sodu filtry zostają przeniesione. Jest to jedynie miejsce, w którym zostaną odłożone, ponieważ w następnym kroku trafią one do wrzącej pary.

To jest druga część etapu lizy. Najpierw komórki zostały poddane działaniu silnie zasadowego roztworu wodorotlenku sodu i detergentu, siarczanu dodecylu sodu. Teraz kolonie te są poddawane działaniu wysokiej temperatury, pary wodnej o temperaturze 100 °C.

Połączenie tej zasady i detergentu z wysoką temperaturą spowoduje całkowitą lizę komórek, a DNA zostanie uwolnione na filtrze. Po pięciu minutach w łaźni parowej filtr zostanie przeniesiony do roztworu neutralizującego. Roztwór neutralizujący w zasadzie neutralizuje całą zasadę, a następnie filtr zostanie wysuszony.

To jest roztwór neutralizujący; filtr pozostaje w nim przez kolejne pięć minut. Następnie filtr przenosi się na papier filtracyjny i pozostawia do wyschnięcia, zazwyczaj na noc. Po wysuszeniu błon z lizowanymi komórkami przez noc, umieszcza się je w roztworze Tris-EDTA i proteazy K; proteaza K służy do usunięcia wszystkich białek znajdujących się na błonie.

Widać, że próbka została odwrócona, aby upewnić się, że wszystkie kolonie zostały pokryte proteinazą K. Pozwoli to na strawienie znacznej ilości obcego materiału komórkowego oraz białek. Po półgodzinnej inkubacji w proteinazie K w temperaturze 37 °C, membrany wyjmuje się z roztworu i suszy na papierze filtracyjnym przez noc. Następnie są one gotowe do kolejnego etapu, którym jest hybrydyzacja.

Nazywam się Vin fm. Jestem pracownikiem postdoktoralnym w laboratorium delong's. W MIT wykorzystuję technologię makromacierzy do przesiewania markerów filogenetycznych oraz genów funkcjonalnych.

Zaprezentowano sposób przygotowania bibliotek makromacierzy. Teraz przeprowadzę Państwa przez pozostałą część procedury dotyczącej przeprowadzania przesiewu. Oto makromacierz; zanim będziemy mogli przejść dalej, musimy przymocować DNA do samej membrany poprzez sieciowanie promieniowaniem UV.

Wykonujemy to za pomocą łącznika UV strata, umieszczamy go w urządzeniu, ustawiamy opcję automatycznego sieciowania i uruchamiamy proces. Po zakończeniu sieciowania preferuję rozciąć membrany na dwie połowy. Robię to, ponieważ membrany będą hybrydyzowane w probówkach do hybrydyzacji, a przecięcie ich na pół pozwala na pełną ekspozycję całej wewnętrznej powierzchni membrany na roztwór hybrydyzacyjny.

Widać, że membrana idealnie przylega do wnętrza probówki, nie zwijając się. W ten sposób membrana została prawidłowo umieszczona w probówce do hybrydyzacji. W następnym kroku dodam do niej bufor do hybrydyzacji.

Zawierająca sondę, którą mam w tej drugiej probówce, podgrzanej wcześniej do 60°C. Jest to moja preferowana temperatura hybrydyzacji. Zanim to zrobię, a właściwie w trakcie tego procesu, wyjaśnię, że bufor do hybrydyzacji został przesłany do nas wraz z zestawem detekcyjnym od producenta.

Jest to bufor do hybrydyzacji, który uzupełniamy odczynnikiem blokującym. W skład wchodzą również bufor fosforanowy, SDS, chlorek magnezu i chlorek sodu, a także niewielka ilość mocznika. Świetnie. Kolejnym krokiem jest umieszczenie tej probówki z membraną w buforze do hybrydyzacji oraz sondą w piecu do hybrydyzacji, który ustawiłem na 60°C, i pozostawienie jej na inkubację przez noc.

Po inkubacji, która w idealnych warunkach powinna trwać całą noc, należy wyprać membrany, aby usunąć niezwiązaną sondę. Przygotowanie buforu do hybrydyzacji oraz sondy nie wiąże się z użyciem materiałów niebezpiecznych, więc można je bezpiecznie wylać do zlewu.

Pobiorę teraz główny bufor do płukania, który również jest ogrzewany do 60 °C. Jest on podgrzewany w tej samej temperaturze, w której membrany ulegały hybrydyzacji przez noc. Płukanie również zostanie przeprowadzone w tej samej temperaturze.

Zazwyczaj wykonuję trzy płukania buforem do płukania pierwotnego, z każdym etapem inkubacji trwającym mniej więcej od 5 do 10 minut. Ponownie, bufor do płukania nie jest radioaktywny ani nie zawiera znanych substancji niebezpiecznych; po każdym cyklu płukania można go po prostu wylać do zlewu. Wykonano trzy płukania buforem do płukania pierwotnego w temperaturze 60 °C.

Membrany są teraz gotowe do drugiego płukania, które pozwala doprowadzić je do odpowiedniego pH przed ekspozycją na odczynniki detekcyjne ECF. W kolejnym kroku płuczemy membrany w buforze do drugiego płukania w temperaturze pokojowej. Można teraz użyć pęsety do wyjęcia membran lub, zachowując szczególną ostrożność, użyć dłoni w rękawiczce, trzymając membrany wyłącznie za tylną stronę lub krawędzie, aby nie zanieczyścić ich substancjami, które mogą znajdować się na dłoniach, nawet w rękawiczkach.

Należy przenieść membrany do pojemnika zawierającego bufor do drugiego płukania, który został wcześniej przygotowany i doprowadzony do temperatury pokojowej. Należy je rozłożyć starannie i płasko. Czasami membrany mogą na siebie nachodzić, jednak nie ma to większego znaczenia.

Należy pamiętać, że ten konkretny krok służy jedynie wyrównaniu pH dla membran. Następnie pozostawia się je do inkubacji. W razie potrzeby można zastosować lekkie wytrząsanie.

Nie stwierdziłem, aby miało to szczególnie korzystny lub szkodliwy wpływ. Dlatego ponownie pozostawiam go na blacie na 5 do 10 minut, a następnie powtarzam płukanie wtórne po raz drugi. Drugie płukanie w ramach etapu płukania wtórnego zostało zakończone.

Teraz czas na przygotowanie do detekcji, rozwińcie folię. Rozwijam kawałek folii spożywczej; membrany zostaną położone na folii, od strony odczynników detekcyjnych, a następnie zagięty zostanie fragment folii. W ten sposób powstanie niewielka kieszonka, która utrzyma odczynnik detekcyjny.

Oto nasze membrany. Odlewam nadmiar buforu do płukania na stos suchego ręcznika papierowego, a następnie rozkładam membrany na folii Theran. Należy przygotować wcześniej wymieszany zestaw do detekcji ECF.

Zazwyczaj można je przechowywać w zamrażarce przez kilka miesięcy; po prostu wlewam odczynniki na membranę. Pozostałą część zawijam w folię spożywczą.

Następnie tworzę niewielką kieszeń, podwijając końce lub krawędzie, i zabezpieczam cały proces detekcji folią aluminiową. Pozostawiam to w ten sposób na około 5 do 10 minut. Jest to czas na odprowadzenie odczynników detekcyjnych z pierwszej torby.

Zauważą Państwo, że przykleiłem część folii spożywczej do blatu. Często może okazać się to przydatne, aby zapobiec przywieraniu, które jest typowe dla folii spożywczej. Ponownie, pomocne jest osuszenie poprzez delikatne przykładanie do stosu ręczników papierowych, a następnie przełożenie do nowej, czystej folii, którą wcześniej przygotowano na blacie.

Zatem odmyto odczynniki detekcyjne, więc membrany są gotowe do około dwugodzinnej inkubacji w celu rozwinięcia sygnału. Minęły dwie godziny i jesteśmy gotowi do detekcji sygnału na naszych membranach. Robimy to, skanując membrany za pomocą skanera fluorescencyjnego, ponownie trzymając membrany wyłącznie za krawędzie.

Przydatne może być użycie pipety do usunięcia pęcherzyków powietrza, które utworzyły się między membraną a szkłem. Jesteśmy zatem gotowi do skanowania. Wyznacz obszar na płytce natkrywnej, który był pokryty naszymi membranami, a następnie wykonaj skanowanie przy 4 i 73 nanometrach.

Zatem po powiększeniu zakończonego skanowania otrzymamy obraz podobny do tego. Tutaj widać sygnał. Pojawienie się dwóch przeciwstawnych kropek jest oznaką sygnału dodatniego.

Oto pierwszy przykład, a tutaj drugi przykład. Gdy już wiadomo, która część membrany wykazuje sygnał, należy następnie prześledzić, której płytce i którym studniom odpowiada ten konkretny sygnał. Pozwoli to określić, który fo smidt niesie konkretny gen, który próbowano zidentyfikować podczas przesiewu.

Gdy już zidentyfikujesz smid, możesz go przeanalizować. Jednym ze sposobów jest sekwencjonowanie całego insertu smid i odnalezienie genu, który Cię interesuje.