Name: Wielkoskalowe badania przesiewowe bibliotek metagenomicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-05-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 5 s
Description: Poznaj metodę automatycznego inokulowania bibliotek metagenomicznych na membrany nylonowe przy użyciu robotyki. Technika ta umożliwia precyzyjne rozmieszczenie 10 000 kolonii, zwiększając dokładność i odtwarzalność badań genomowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Procedura hybrydyzacji
Jedna probówka do hybrydyzacji pomieści 1 lub 2 membrany (o rozmiarze 22 by 22 cm). Na każdą probówkę do hybrydyzacji należy użyć 50 ml mieszaniny do hybrydyzacji i 0,5 mg sondy DNA (stężenie końcowe 10 ng/ml). Dla uzyskania najlepszych wyników jako sondę należy zastosować DNA oczyszczone w żelu. W przypadku zwiększania skali przygotowania sondy, należy zwiększyć liczbę probówek, a nie ilość odczynników w jednej probówce.
Przygotowanie sondy (0,5 mg DNA):
<ol>
<li>Rozcieńczyć 15 μl roztworu łącznika (cross-linkera) w 60 μl wody.</li>
<li>Rozcieńczyć DNA wodą do stężenia 10 ng/μl, osiągając całkowitą objętość 50 μl w mikroprobtce z nakrętką.</li>
<li>Denaturować DNA przez 5 min w wrzącej wodzie.</li>
<li>Szybko przenieść na lód i schłodzić przez 5 min. Krótko wirować.</li>
<li>Dodać 50 μl buforu reakcyjnego i delikatnie wymieszać.</li>
<li>Dodać 10 μl odczynnika znakującego i delikatnie wymieszać.</li>
<li>Dodać 50 μl rozcieńczonego roztworu łącznika z kroku 1 i delikatnie wymieszać. Delikatnie wymieszać na wortexie i krótko wirować.</li>
<li>Inkubować w temperaturze 37°C przez 30 min.</li>
<li>Przechowywać na lodzie do 2 h lub dodać równą objętość 100% glicerolu i przechowywać w temperaturze -20°C. Uwaga: Należy używać wody dostarczonej w zestawie. Wszystkie odczynniki należy przechowywać na lodzie, chyba że wskazano inaczej.</li>
</ol>
Przygotowanie membrany i hybrydyzacja
<ol>
<li>Podgrzać 50 ml buforu do hybrydyzacji oraz probówkę do hybrydyzacji do temperatury 60°C.</li>
<li>Dodać bufor do hybrydyzacji do probówki do hybrydyzacji. Zwinąć membranę(y) i umieścić w probówce do hybrydyzacji. (W przypadku dodawania 2 membran do jednej probówki, najpierw całkowicie zwinąć jedną membranę, a następnie zwinąć drugą membranę na wierzchu w tym samym kierunku).</li>
<li>Inkubować probówkę do hybrydyzacji w temperaturze 60°C przez co najmniej ½ h. (Należy upewnić się, że membrana(y) zostały całkowicie nasączone).</li>
<li>Przenieść za pomocą długiej pipety około 1 ml buforu do hybrydyzacji z probówki do hybrydyzacji do probówki zawierającej znakowaną sondę. Delikatnie wymieszać na wirówce (vortex) i krótko odwirować. Przenieść mieszaninę z powrotem do probówki do hybrydyzacji.</li>
<li>Inkubować w temperaturze 60°C przez noc. Uwaga: Podczas pracy z membranami należy używać pęsety i rękawiczek. Zawartość probówek do hybrydyzacji należy mieszać delikatnie, ponieważ zbyt silne wytrząsanie spowoduje trwałe powstanie niepożądanej piany. Membrany powinny być dodawane w stanie wilgotnym; w razie potrzeby namoczyć je w buforze do hybrydyzacji lub wodzie i odlać nadmiar cieczy przed dodaniem.</li>
</ol>
2. Procedura detekcji
Przemywanie membran
<ol>
<li>Podgrzać główny bufor płuczący do 60°C. (Użyć kuchenki mikrofalowej i/lub płyty grzewczej).</li>
<li>Jeśli w jednej probówce do hybrydyzacji znajdują się 2 membrany, przenieść jedną membranę do czystej, podgrzanej, pustej probówki do hybrydyzacji.</li>
<li>Krótko wypłukać probówkę do hybrydyzacji około 50 ml głównego buforu płuczącego.</li>
<li>Dodać około 100 ml głównego buforu płuczącego do probówki do hybrydyzacji i inkubować w temperaturze 60°C przez 10&nbsp;min.</li>
<li>Powtórzyć kroki 3 i 4.</li>
<li>Przenieść membranę do pojemnika do płukania i inkubować w co najmniej 250 ml wtórnego buforu płuczącego w temperaturze pokojowej przez 5 min.</li>
<li>Powtórzyć krok 6. Uwaga: Membrany można przechowywać we wtórnym buforze płuczącym w temperaturze pokojowej do ½ h przed generowaniem sygnału.</li>
</ol>
Generowanie i detekcja sygnału (procedura dla jednej błony)
<ol>
<li>Przyklej dwa kawałki folii spożywczej (SaranWrap) na płasko do blatu stołu (jeden dla kroku 2, a drugi dla kroku 4).</li>
<li>Ostrożnie usuń nadmiar buforu z membrany, dotykając jej rogów o ściankę pojemnika, a następnie przenieś membranę na folię spożywczą (stroną z próbką do góry).</li>
<li>Wlej 6-7 ml odczynnika ECF na membranę i złóż folię spożywczą tak, aby przykryła membranę. Ostrożnie rozprowadź odczynnik ECF po całej powierzchni membrany, delikatnie przesuwając chusteczką Kimwipe po folii spożywczej. Inkubuj przez 5 min.</li>
<li>Usuń nadmiar odczynnika ECF z membrany i przenieś ją na nową folię spożywczą, złóż folię nad membraną i zaklej krawędzie taśmą. Przykryj membranę folią aluminiową. Inkubuj przez 1-2 h.</li>
<li>Przygotuj szklaną płytę skanera, rozprowadzając na niej 1-2 ml odczynnika ECF. Następnie przenieś membranę na płytę szklaną (stroną z próbką do dołu) i rozprowadź kolejne 1-2 ml odczynnika ECF na membranie. Przykryj całość folią spożywczą i ostrożnie usuń wszystkie pęcherzyki powietrza z obszaru membrany. (Na folii spożywczej można położyć sztywną płytkę, aby utrzymać membranę dociśniętą do szklanej płyty).</li>
<li>Użyj skanera fluorescencyjnego Fuji FLA-5100 (tryb „1 laser 1 image”) z następującymi ustawieniami: wzbudzenie 473 nm, filtr detekcyjny LPB (510 nm), rozdzielczość 50 μm, 16-bitowa gradacja sygnału, CH1 400 V. (Skanowanie trwa około 15-20 min dla membrany o rozmiarze 22 na 22 cm). Opcjonalnie: </li>
<li>Pozostaw na 2-4 h (lub dłużej).</li>
<li>Powtórz skanowanie zgodnie z krokiem 6.</li>
</ol>
3. Procedura płukania i przechowywania (wersja NUF)
<ol>
<li>Przenieść membranę do 100% etanolu i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min przy delikatnym mieszaniu.</li>
<li>Wymienić na świeży 100% etanol i inkubować przez noc w temperaturze pokojowej. (Membrana może pozostać w etanolu przez kilka dni).</li>
<li>Zastąpić etanol wodą destylowaną i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 min.</li>
<li>Do probówki do hybrydyzacji dodać 100 ml wody i 5 ml 10% SDS (stężenie końcowe 0,5% SDS), a następnie delikatnie wymieszać. Dodać membranę.</li>
<li>Inkubować w temperaturze 80°C przez 1 h.</li>
<li>Przenieść membranę do czystego, pustego pojemnika.</li>
<li>Do zlewki dodać 500 ml wody i 5 ml 10% SDS (stężenie końcowe 0,1% SDS), a następnie doprowadzić do gwałtownego wrzenia w kuchence mikrofalowej.</li>
<li>Wylać prawie wrzący roztwór 0,1% SDS na membranę i delikatnie mieszać przez kilka minut. Pozostawić do ochłodzenia do temperatury pokojowej.</li>
<li>Płukać w co najmniej 250 ml sterylnego 100 mM Tris pH 8 przez co najmniej 10 min.</li>
<li>Zawiń membranę w folię SaranWrap i starannie zaklej brzegi taśmą. Przechowywać w temperaturze 4°C. (Membrany nigdy nie mogą wyschnąć).</li>
</ol>

Procedura strippingu nie została zoptymalizowana. Jednakże procedura strippingu podana w instrukcji producenta (po 2 płukania przez 10 min w 100% etanolu, 1 płukanie przez 1 h w 60°C w 0,5% SDS) jest niewystarczająca. Aby rozpuścić produkt reakcji ECF, konieczna jest inkubacja w 100% etanolu przez co najmniej jedną noc; wydaje się, że kilkudniowa inkubacja w 100% etanolu nie wpływa negatywnie na możliwość ponownego badania membrany. Obróbka SDS zalecana przez producenta również wydaje się niewystarczająca. NUF z sukcesem...

<table><tbody><tr><td>Odczynniki do bezpośredniego znakowania AlkPhos</td><td>zestaw</td><td>Amersham</td><td>RPN3680</td><td>Zawiera odczynnik do znakowania, roztwór łącznika krzyżującego, bufor reakcyjny, wodę, kontrolne DNA, bufor do hybrydyzacji, odczynnik blokujący. Bufor do hybrydyzacji i odczynnik blokujący przechowywać w temperaturze pokojowej, pozostałe odczynniki w temperaturze 2-8&amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Podłoże ECF</td><td>zestaw</td><td>Amersham</td><td>RPN3685</td><td>Zawiera podłoże ECF, bufor do rozcieńczania podłoża ECF. Uwaga: Opakowanie zawiera łącznie 60 ml odczynnika; należy podzielić na próbki po 10 ml w probówkach Falcon i przechowywać w temperaturze 20&amp;deg;C. Zużycie wynosi około 10 ml na membranę (rozmiar 22 na 22 cm).</td></tr><tr><td>20x bufor do płukania wtórnego</td><td>bufor</td><td></td><td></td><td>121 g Tris (stężenie końcowe 1 M), 117 g NaCl (stężenie końcowe 2 M). Dostosować pH do 10. Dopełnić wodą do 1 L. Przechowywać w temperaturze 2-8&amp;deg;C do 4 miesięcy.</td></tr><tr><td>Bufor 0,5 M NaH2PO4 pH 7</td><td>bufor</td><td></td><td></td><td>69 g NaH2PO4.H2O. Dostosować pH do 7 za pomocą NaOH. Dopełnić wodą do 1 L. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>1 M MgCl2</td><td></td><td></td><td></td><td>50,8 g MgCl2.6H2O. Dopełnić wodą do 250 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td>10% (w/v) SDS</td><td></td><td></td><td></td><td>20 g SDS. Dopełnić wodą do 200 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej.</td></tr><tr><td colspan="5">Zestaw kombinowany RPN3692 = RPN3680 + RPN3685</td></tr></tbody></table>

wielkoskalowe przesiewanie bibliotek metagenomicznych

Large-Scale Screens of Metagenomic Libraries

Biblioteki metagenomiczne archiwizują duże fragmenty ciągłych sekwencji genomicznych mikroorganizmów bez konieczności ich wcześniejszej hodowli. Opracowanie usprawnionej procedury tworzenia i przesiewania bibliotek metagenomicznych jest zatem przydatne dla efektywnych, wysokoprzepustowych badań nad właściwościami genetycznymi i metabolicznymi niehodowlanych zbiorowisk drobnoustrojów. W niniejszym materiale w formie wideo przedstawiono kluczowe protokoły, co w naszej ocenie jest najużyteczniejszym formatem do precyzyjnego opisania długotrwałego procesu, który naprzemiennie opiera się na instrumentacji robotycznej i interwencjach manualnych. W pierwszej kolejności wykorzystano robotykę do naniesienia klonów z biblioteki na membrany makromacierzy o wysokiej gęstości, z których każda może zawierać powielone kolonie z dwudziestu czterech 384-dołkowych płytek bibliotecznych. Automatyzacja jest niezbędna w tej procedurze nie tylko ze względu na dokładność i szybkość, ale także ze względu na miniaturyzację skali, która jest wymagana, aby pomieścić dużą liczbę klonów bibliotecznych w bardzo gęstych układach przestrzennych. Po ich przygotowaniu zademonstrowano, w jaki sposób membrany makromacierzy mogą być przesiewane pod kątem poszukiwanych genów przy użyciu zmodyfikowanych wersji standardowych protokołów znakowania sond, hybrydyzacji membran i detekcji sygnału. Wizualną prezentację tych procedur uzupełniono szczegółowymi opisami pisemnymi poszczególnych etapów oraz listą wymaganych materiałów, które są dostępne online wraz z filmem.

Wielkoskalowe przesiewanie bibliotek metagenomicznych

Biblioteki metagenomiczne archiwizują duże fragmenty ciągłych sekwencji genomowych mikroorganizmów bez konieczności ich wcześniejszej hodowli. Tworzenie...

Naszym celem jest zaszczepienie kolonii z niektórych z tych bibliotek metagenomicznych na filtry membranowe, przy czym każdy z tych filtrów może pomieścić 10 000 kolonii. Obecnie kładę ten filtr nylonowy na bloku i go wyrównuję. Filtr znajduje się w niewielkiej ilości cieczy, którą jest pożywka wzrostowa Luria broth.Następnie przeniesie on tę nawilżoną membranę do robota, który automatycznie zaszczepi na niej 10 000 kolonii. Robotyka jest niezbędna w tego rodzaju procedurach, ponieważ żaden człowiek nie posiada rzeczywistej cierpliwości ani precyzji, aby nanieść 10 000 kolonii na jedną z takich membran. Roboty są jednym z czynników, które realnie rozwinęły naukę o genomach, umożliwiając wykonywanie bardzo powtarzalnych operacji w niewielkiej skali przestrzennej z wysoką dokładnością.W tej chwili konfigurujemy robota do zasilania tymi trzema płytkami 84-dołkowymi; każda studzienka w tych trzech płytkach 84-dołkowych zawiera pojedynczą kolonię z biblioteki metagenomicznej. Obecnie robot sterylizuje igły szczepielne, których będzie używał do nanoszenia próbek na membranę. Przechodzą one przez kilka różnych roztworów, z których jednym jest 70% etanol w celu sterylizacji, a następnie igły szczepielne zostaną zanurzone w płytce 84-dołkowej zawierającej wszystkie kolonie.Obecnie próbki są sterylizowane i suszone za pomocą światła. Po wysuszeniu igieł szczepiących robot wprowadzi płytkę. Każda z tych kolonii jest w rzeczywistości odciskana i powielana, co służy jako kontrola.W rzeczywistości poszukujemy dwóch identycznych kolonii, które wykażą sygnał w wyniku hybrydyzacji. Po naniesieniu wszystkich tych kolonii na filtr, zostaje on ponownie przyłożony do szalki z agarem, którą tutaj widzicie, a następnie inkubowany w temperaturze 37 °C przez noc.W wyniku tego procesu każda z kolonii urośnie, a w tym układzie widać 10 000 kolonii na filtrze. Oczywiście każda z tych kolonii zawiera wiele, wiele kopii rekombinowanego DNA, w tym przypadku DNA metagenomicznego. Pochodzi ono z próbek pobranych z centralnej części północnego Oceanu Spokojnego, które przygotowaliśmy.W następnym kroku Saltram przeniesie tę membranę do serii roztworów. Pierwszym roztworem, do którego zostanie ona przeniesiona, jest zasadowy roztwór wodorotlenku sodu, który spowoduje lizę kolonii. Powoduje on w zasadzie rozpuszczenie ścian komórkowych i uwolnienie DNA, dzięki czemu DNA może nawiązać kontakt z filtrem.W ten sposób wszystkie ściany komórkowe bakterii w tych koloniach ulegają rozpuszczeniu, a DNA zostaje uwolnione. Po pięciu minutach w wodorotlenku sodu filtry zostają przeniesione. Jest to jedynie miejsce, w którym zostaną odłożone, ponieważ w następnym kroku trafią one do wrzącej pary.To jest druga część etapu lizy. Najpierw komórki zostały poddane działaniu silnie zasadowego roztworu wodorotlenku sodu i detergentu, siarczanu dodecylu sodu. Teraz kolonie te są poddawane działaniu wysokiej temperatury, pary wodnej o temperaturze 100 °C.Połączenie tej zasady i detergentu z wysoką temperaturą spowoduje całkowitą lizę komórek, a DNA zostanie uwolnione na filtrze. Po pięciu minutach w łaźni parowej filtr zostanie przeniesiony do roztworu neutralizującego. Roztwór neutralizujący w zasadzie neutralizuje całą zasadę, a następnie filtr zostanie wysuszony.To jest roztwór neutralizujący; filtr pozostaje w nim przez kolejne pięć minut. Następnie filtr przenosi się na papier filtracyjny i pozostawia do wyschnięcia, zazwyczaj na noc. Po wysuszeniu błon z lizowanymi komórkami przez noc, umieszcza się je w roztworze Tris-EDTA i proteazy K; proteaza K służy do usunięcia wszystkich białek znajdujących się na błonie.Widać, że próbka została odwrócona, aby upewnić się, że wszystkie kolonie zostały pokryte proteinazą K. Pozwoli to na strawienie znacznej ilości obcego materiału komórkowego oraz białek. Po półgodzinnej inkubacji w proteinazie K w temperaturze 37 °C, membrany wyjmuje się z roztworu i suszy na papierze filtracyjnym przez noc. Następnie są one gotowe do kolejnego etapu, którym jest hybrydyzacja.Nazywam się Vin fm. Jestem pracownikiem postdoktoralnym w laboratorium delong's. W MIT wykorzystuję technologię makromacierzy do przesiewania markerów filogenetycznych oraz genów funkcjonalnych.Zaprezentowano sposób przygotowania bibliotek makromacierzy. Teraz przeprowadzę Państwa przez pozostałą część procedury dotyczącej przeprowadzania przesiewu. Oto makromacierz; zanim będziemy mogli przejść dalej, musimy przymocować DNA do samej membrany poprzez sieciowanie promieniowaniem UV.Wykonujemy to za pomocą łącznika UV strata, umieszczamy go w urządzeniu, ustawiamy opcję automatycznego sieciowania i uruchamiamy proces. Po zakończeniu sieciowania preferuję rozciąć membrany na dwie połowy. Robię to, ponieważ membrany będą hybrydyzowane w probówkach do hybrydyzacji, a przecięcie ich na pół pozwala na pełną ekspozycję całej wewnętrznej powierzchni membrany na roztwór hybrydyzacyjny.Widać, że membrana idealnie przylega do wnętrza probówki, nie zwijając się. W ten sposób membrana została prawidłowo umieszczona w probówce do hybrydyzacji. W następnym kroku dodam do niej bufor do hybrydyzacji.Zawierająca sondę, którą mam w tej drugiej probówce, podgrzanej wcześniej do 60°C. Jest to moja preferowana temperatura hybrydyzacji. Zanim to zrobię, a właściwie w trakcie tego procesu, wyjaśnię, że bufor do hybrydyzacji został przesłany do nas wraz z zestawem detekcyjnym od producenta.Jest to bufor do hybrydyzacji, który uzupełniamy odczynnikiem blokującym. W skład wchodzą również bufor fosforanowy, SDS, chlorek magnezu i chlorek sodu, a także niewielka ilość mocznika. Świetnie. Kolejnym krokiem jest umieszczenie tej probówki z membraną w buforze do hybrydyzacji oraz sondą w piecu do hybrydyzacji, który ustawiłem na 60°C, i pozostawienie jej na inkubację przez noc.Po inkubacji, która w idealnych warunkach powinna trwać całą noc, należy wyprać membrany, aby usunąć niezwiązaną sondę. Przygotowanie buforu do hybrydyzacji oraz sondy nie wiąże się z użyciem materiałów niebezpiecznych, więc można je bezpiecznie wylać do zlewu.Pobiorę teraz główny bufor do płukania, który również jest ogrzewany do 60 °C. Jest on podgrzewany w tej samej temperaturze, w której membrany ulegały hybrydyzacji przez noc. Płukanie również zostanie przeprowadzone w tej samej temperaturze.Zazwyczaj wykonuję trzy płukania buforem do płukania pierwotnego, z każdym etapem inkubacji trwającym mniej więcej od 5 do 10 minut. Ponownie, bufor do płukania nie jest radioaktywny ani nie zawiera znanych substancji niebezpiecznych; po każdym cyklu płukania można go po prostu wylać do zlewu. Wykonano trzy płukania buforem do płukania pierwotnego w temperaturze 60 °C.Membrany są teraz gotowe do drugiego płukania, które pozwala doprowadzić je do odpowiedniego pH przed ekspozycją na odczynniki detekcyjne ECF. W kolejnym kroku płuczemy membrany w buforze do drugiego płukania w temperaturze pokojowej. Można teraz użyć pęsety do wyjęcia membran lub, zachowując szczególną ostrożność, użyć dłoni w rękawiczce, trzymając membrany wyłącznie za tylną stronę lub krawędzie, aby nie zanieczyścić ich substancjami, które mogą znajdować się na dłoniach, nawet w rękawiczkach.Należy przenieść membrany do pojemnika zawierającego bufor do drugiego płukania, który został wcześniej przygotowany i doprowadzony do temperatury pokojowej. Należy je rozłożyć starannie i płasko. Czasami membrany mogą na siebie nachodzić, jednak nie ma to większego znaczenia.Należy pamiętać, że ten konkretny krok służy jedynie wyrównaniu pH dla membran. Następnie pozostawia się je do inkubacji. W razie potrzeby można zastosować lekkie wytrząsanie.Nie stwierdziłem, aby miało to szczególnie korzystny lub szkodliwy wpływ. Dlatego ponownie pozostawiam go na blacie na 5 do 10 minut, a następnie powtarzam płukanie wtórne po raz drugi. Drugie płukanie w ramach etapu płukania wtórnego zostało zakończone.Teraz czas na przygotowanie do detekcji, rozwińcie folię. Rozwijam kawałek folii spożywczej; membrany zostaną położone na folii, od strony odczynników detekcyjnych, a następnie zagięty zostanie fragment folii. W ten sposób powstanie niewielka kieszonka, która utrzyma odczynnik detekcyjny.Oto nasze membrany. Odlewam nadmiar buforu do płukania na stos suchego ręcznika papierowego, a następnie rozkładam membrany na folii Theran. Należy przygotować wcześniej wymieszany zestaw do detekcji ECF.Zazwyczaj można je przechowywać w zamrażarce przez kilka miesięcy; po prostu wlewam odczynniki na membranę. Pozostałą część zawijam w folię spożywczą.Następnie tworzę niewielką kieszeń, podwijając końce lub krawędzie, i zabezpieczam cały proces detekcji folią aluminiową. Pozostawiam to w ten sposób na około 5 do 10 minut. Jest to czas na odprowadzenie odczynników detekcyjnych z pierwszej torby.Zauważą Państwo, że przykleiłem część folii spożywczej do blatu. Często może okazać się to przydatne, aby zapobiec przywieraniu, które jest typowe dla folii spożywczej. Ponownie, pomocne jest osuszenie poprzez delikatne przykładanie do stosu ręczników papierowych, a następnie przełożenie do nowej, czystej folii, którą wcześniej przygotowano na blacie.Zatem odmyto odczynniki detekcyjne, więc membrany są gotowe do około dwugodzinnej inkubacji w celu rozwinięcia sygnału. Minęły dwie godziny i jesteśmy gotowi do detekcji sygnału na naszych membranach. Robimy to, skanując membrany za pomocą skanera fluorescencyjnego, ponownie trzymając membrany wyłącznie za krawędzie.Przydatne może być użycie pipety do usunięcia pęcherzyków powietrza, które utworzyły się między membraną a szkłem. Jesteśmy zatem gotowi do skanowania. Wyznacz obszar na płytce natkrywnej, który był pokryty naszymi membranami, a następnie wykonaj skanowanie przy 4 i 73 nanometrach.Zatem po powiększeniu zakończonego skanowania otrzymamy obraz podobny do tego. Tutaj widać sygnał. Pojawienie się dwóch przeciwstawnych kropek jest oznaką sygnału dodatniego.Oto pierwszy przykład, a tutaj drugi przykład. Gdy już wiadomo, która część membrany wykazuje sygnał, należy następnie prześledzić, której płytce i którym studniom odpowiada ten konkretny sygnał. Pozwoli to określić, który fo smidt niesie konkretny gen, który próbowano zidentyfikować podczas przesiewu.Gdy już zidentyfikujesz smid, możesz go przeanalizować. Jednym ze sposobów jest sekwencjonowanie całego insertu smid i odnalezienie genu, który Cię interesuje.

large-scale-screens-of-metagenomic-libraries

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Duże skale ekranowania bibliotek metagenomowych

Niniejszy protokół opisuje wysokoprzepustowy screening aktywności celulolitycznej z biblioteki metagenomicznej eksprymowanej w Escherichia coli. Screening opiera się na analizie w roztworze, jest wysoce zautomatyzowany i wykorzystuje chemię jednopojemnikową w mikropłytkach 384-dołkowych, z końcowym odczytem w postaci pomiaru absorbancji.

Wysokoprzepustowy screening aktywności celulazy w procesie biominingu z bibliotek metagenomicznych

Opracowaliśmy kompleksowe, nieobciążone systematycznie badania przesiewowe całego genomu, aby zrozumieć interakcje gen-lek oraz gen-środowisko. Przedstawiono metody przesiewania tych kolekcji mutantów.

Konkurencyjne przesiewy genomiczne z zastosowaniem bibliotek drożdży z kodami kreskowymi

Źródło: Kim, H. i in., Wieloenzymowe przesiewowe badanie z użyciem wysokoprzepustowego systemu przesiewowe enzymów genetycznych. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje metodę przesiewania genetycznego do wykrywania ekspresji enzymów z wykorzystaniem metagenomowych bibliotek fosmidów i chromogenicznych substratów. Cytometria przepływowa identyfikuje i izoluje pojedyncze komórki produkujące produkty kolorowe, umożliwiając wysokoprzepustowy selekcję aktywnych komórek ekspresujących enzymy.

Wykrywanie ekspresji docelowych enzymów w genetycznie modyfikowanych komórkach bakteryjnych

Ten manuskrypt opisuje zautomatyzowane podejście do wyboru rozmiaru żelu do oczyszczania fragmentów DNA do sekwencjonowania nowej generacji. Technologia Ranger zapewnia pełną automatyzację całego procesu ładowania żelem agarozowym, analizy elektroforetycznej i odzyskiwania docelowych fragmentów DNA, co pozwala na uzyskanie wysokiej przepustowości i wysokiej jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji.

Zautomatyzowany wybór wielkości żelu w celu poprawy jakości bibliotek sekwencjonowania nowej generacji przygotowanych na podstawie próbek wody środowiskowej

Ta praca przedstawia metodę wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu uniwersalnego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych, który teoretycznie można zastosować do ponad 200 enzymów. W tym przypadku pojedynczy system przesiewowy identyfikuje trzy różne enzymy (lipazę, celulazę i fosfatazę alkaliczną), po prostu zmieniając zastosowany substrat (octan p-nitrofenylu, p-nitrofenylo-β-D-celobiozyd i fosforan fenylu).

Badania przesiewowe wielu enzymów przy użyciu wysokoprzepustowego systemu badań przesiewowych enzymów genetycznych

Metagenomics została wykorzystana do zbadania mikrobiomu paszy dla bydła na kiszonkę. Analizę przeprowadzono za pomocą sekwencjonowania typu shotgun. Podejście to wykorzystano do scharakteryzowania składu zbiorowiska mikrobiologicznego w paszy dla bydła.

Analiza metagenomiczna kiszonki

Identyfikacja fizycznych interakcji między genami a elementami regulatorowymi jest trudna, ale została ułatwiona dzięki metodom wychwytywania konformacji chromosomów. Ta modyfikacja protokołu 4C-seq łagodzi stronniczość PCR, minimalizując nadmierną amplifikację matryc PCR i maksymalizując mapowalność odczytów poprzez włączenie etapu trawienia enzymu ograniczającego dodawanie.

Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq)

Technologia CRISPR-Cas9 zapewnia efektywną metodę precyzyjnej edycji genomu ssaków w dowolnym typie komórki i stanowi nowatorski sposób przeprowadzania genetycznych badań przesiewowych całego genomu. Szczegółowy protokół omawiający kroki wymagane do pomyślnego przeprowadzenia zbiorczych badań przesiewowych CRISPR-Cas9 dla całego genomu znajduje się tutaj.

Połączone genetyczne badania przesiewowe oparte na CRISPR w komórkach ssaków

Ten manuskrypt opisuje metodę badań przesiewowych na skalę genomu opartą na komórkach w celu identyfikacji interakcji receptor-ligand zewnątrzkomórkowy.

Identyfikacja receptorów na powierzchni komórki za pomocą genetycznych badań przesiewowych CRISPR/Cas9 w skali genomu

To badanie przedstawia przestrzenny protokół Trekker–CUT&amp;Tag multiome, łączący bezpośrednie przestrzenne kodowanie sekcji tkanki z analizą wielodostępu pojedynczych komórek. To podejście umożliwia przestrzennie rozdzielone profilowanie pojedynczych komórek ekspresji genów i modyfikacji histonu H3K27ac jednocześnie, oferując mechanizmy wglądu w regulację genów w kontekście mikroanatomii tkanki.

Przestrzennie rozdzielone, zintegrowane profilowaniu wieloomowe z pojedynczymi komórkami transkryptomu i epigenomicznych celów w zamrożonych sekcjach tkankowych

Poznaj metodę automatycznego inokulowania bibliotek metagenomicznych na membrany nylonowe przy użyciu robotyki. Technika ta umożliwia precyzyjne rozmieszczenie 10 000 kolonii, zwiększając dokładność i odtwarzalność badań genomowych.

Wielkoskalowe przesiewanie bibliotek metagenomicznych

Przeglądaj więcej filmów