Pomiar sztywności na zginanie komórek bakteryjnych za pomocą pułapki optycznej
26 kwietnia 2010
Przedstawiamy protokół zginania nitkowatych komórek bakteryjnych przymocowanych do powierzchni szkiełkowej za pomocą pułapki optycznej do pomiaru sztywności zginania komórek.
Aby określić sztywność zginania poszczególnych komórek coli, najpierw należy wyhodować bakterie do fazy wykładniczej, a następnie przymocować je do chemicznie poddanej obróbce powierzchni szkiełka nakrywkowego. Pozwól, aby komórki już przyczepiły się do powierzchni dalej rosły, aby rozwinęły elastyczne końce. Następnie przelej w kulkach dielektrycznych, uwięzij koralik i zegnij go do elastycznej końcówki komórki.
Ostatnim etapem procedury jest zgięcie ogniwa za pomocą pułapki optycznej i zmierzenie uzyskanych danych dotyczących wymuszonego przemieszczenia. Sztywność komórki na zginanie można obliczyć za pomocą dopasowania liniowego do danych wymuszonego przemieszczenia. Cześć, nazywam się Steven Wong i pracuję w laboratorium profesora Joshuy Shere'a w Instytucie Genomiki Integracyjnej im. Louisa Sicklera i na Wydziale Fizyki Uniwersytetu Princeton.
Dzisiaj pokażemy Wam procedurę gięcia poszczególnych ogniw ekologicznych oraz sztywność komórek małżeńskich. Używamy tej procedury w naszym laboratorium do zbadania wkładu różnych struktur wewnątrzkomórkowych w integralność mechaniczną komórek bakteryjnych. Więc zacznijmy.
Aby rozpocząć tę procedurę, wyhoduj trzy mililitry dowolnych komórek E. coli w fazie LB od średniej do wykładniczej. Gdy komórki osiągną gęstość optyczną przy 600 nanometrach od 0,2 do 0,4, uzupełnij kulturę 50 mikrogramami na mililitr cefaleksyny przez 15 minut, aby wywołać wzrost nitkowaty. W ciągu tych 15 minut przygotuj komorę przepływową.
Przymocuj dwa kawałki taśmy dwustronnej z trzymilimetrową przerwą między kawałkami do szklanego szkiełka i przyklej szkiełko nakrywkowe na górze. Szczelina między kawałkami taśmy tworzy kanał dla przepływającej cieczy. Pokryj szkiełko nakrywkowe PEI, przepływając 10 mikrolitrów 1% polietylenu rozcieńczonego w wodzie do komory przepływowej za pomocą mikropipety, inkubować przez pięć minut.
Następnie umyć, przepływając 200 mikrolitrów wody na jednym końcu komory i zbierając na drugim końcu za pomocą próżni. Po 15 minutach hodowli bakterii w obecności cefaleksyny, odwirować jeden mililitr komórek w mikrowirówce i ponownie zawiesić w 200 mikrolitrach LV z cefaleksyną. Następnie, ponownie, użyj mikropipety na jednym końcu i odkurz na drugim końcu, aby przepuścić 50 mikrolitrów skoncentrowanej kultury komórkowej do komory, w której znajduje się powlekane szkiełko nakrywkowe, inkubować przez trzy minuty.
Następnie umyj 50 mikrolitrami Vel B uzupełnionego cefaleksyną. Aby usunąć nieprzyłączone komórki, inkubuj komorę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut do jednej godziny, aby umożliwić wzrost przyłączonych komórek przed umieszczeniem ich na przyrządzie do pułapki optycznej podczas inkubacji komórek. Przygotuj kulki pokryte polilizyną, inkubując trzy mikrolitry kulek polistyrenowych o średnicy 0,5 mikrometra w jednym z 0,1% polilizyny rozcieńczonej w wodzie przez 30 minut.
Gdy kulki zakończą inkubację, umyj je trzykrotnie, obracając w dół w mikrowirówce i zawieszając resus w jednym mililitrze wody, przystąp do wiązania kulek z bakteriami i zmierz sztywność wiązania komórek. Najtrudniejszym aspektem tego protokołu jest możliwość rozpoznania, zlokalizowania i rozpoznania dobrej komórki do pomiarów zginania, sztywności. A dobra komórka to taka, która ma dobrze zdefiniowany zablokowany koniec i wolne miejsce końcowe.
Komora przepływowa na mikroskopie szuka komórki z dobrze zdefiniowanym, zablokowanym końcem. Niektóre ogniwa są przymocowane tylko na jednej końcówce, a siła zginająca na drugiej końcówce prowadzi do obracania całej komórki, a nie zginania. Aby znaleźć odpowiednią komórkę, szybko zegnij każdą komórkę za pomocą pułapki za pomocą ruchu scenicznego sterowanego joystickiem.
Po znalezieniu odpowiedniej komórki rozcieńczyć roztwór kulki dwukrotnie do funta z cefaleksyną, dodać 30 mikrolitrów roztworu kulek do komory przepływowej, pipetując na jeden koniec i delikatnie wypływając na drugim końcu za pomocą chusteczki Kim, optycznie uwięzić pływającą kulkę i dotknąć jej do wolnego końca komórki. Ponownie umyć komorę za pomocą mikropipety i za pomocą białej chusteczki Kim z 50 mikrolitrami cefaleksyny w LB, aby usunąć nieprzymocowane koraliki. Następnie uruchom niestandardowy pisemny program widoku laboratorium, aby zastosować siły zginające do komórki i zarejestrować dane wymuszonego przemieszczenia.
Najpierw skalibruj odpowiedź detektora, skanując RA dołączony koralik w wykrywającej wiązce laserowej i rejestrując sygnały napięciowe 3D PSD. Następnie zidentyfikuj długą oś komórki na obrazie mikroskopowym. Po zidentyfikowaniu długiej osi komórki, przesuwaj komórkę krokowo w kierunku prostopadłym do długiej osi, przesuwając rekord komórki, przebytą odległość i przemieszczenie koralika od środka pułapki optycznej.
Na koniec przekształć wartości przemieszczenia na przyłożoną siłę, korzystając z wcześniej zmierzonej sztywności pułapki i zapisz. Przemieszczenie końcówki i siła do spiłowania w tym miejscu są danymi wymuszonego przemieszczenia dla pojedynczej komórki. Nachylenie tej linii to sztywność komórki na zginanie.
Właśnie pokazaliśmy, jak połączyć sztywność zginania E. coli z pułapką optyczną. Korzystając z tej procedury, należy pamiętać, aby znaleźć dobrą komórkę z dobrze zdefiniowanym zablokowanym końcem i wolnym końcem. Więc to wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół pomiaru sztywności na zginanie włóknistych komórek bakteryjnych z wykorzystaniem technik pułapkowania optycznego. Metoda ta polega na hodowli komórek E. coli, przytwierdzaniu ich do szkiełka podstawowego i przykładaniu sił zginających w celu oceny ich właściwości mechanicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Biofizyka
- Mechanika komórki
Wstęp
- Zrozumienie właściwości mechanicznych komórek bakteryjnych jest kluczowe dla uzyskania wglądu w ich zachowanie i integralność.
- W celu zbadania sztywności zginania można indukowanie wzrost nitek E. coli.
- Pułapki optyczne stanowią nieinwazyjną metodę przykładania sił do pojedynczych komórek.
- Poprzednie badania koncentrowały się na integralności mechanicznej komórek w różnych warunkach.
Cel badania
- Opracowanie wiarygodnego protokołu pomiaru sztywności zginania komórek E. coli.
- Zbadanie wpływu struktur wewnątrzkomórkowych na mechanikę komórek.
- Pogłębienie zrozumienia zachowania komórek bakteryjnych pod wpływem stresu mechanicznego.
Zastosowane metody
- Hodować komórki E. coli w medium LB do fazy wykładniczej.
- Indukować wzrost włóknisty przy użyciu cefaleksyny.
- Przytwierdzić komórki do chemicznie potraktowanego szkiełka podstawowego.
- Użyć pułapek optycznych do przyłożenia sił zginających i pomiaru danych o przemieszczeniu.
Główne wyniki
- Protokół pozwala na skuteczne pomiary sztywności na zginanie pojedynczych komórek E. coli.
- Analiza danych ujawnia zależność między przyłożoną siłą a przemieszczeniem komórki.
- Identyfikacja odpowiednich komórek do pomiaru jest kluczowa dla uzyskania dokładnych wyników.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechaniki komórek bakteryjnych.
Wnioski
- Opracowany protokół jest skuteczny w badaniu właściwości mechanicznych komórek bakteryjnych.
- Pułapkowanie optyczne jest cennym narzędziem do badania sztywności komórek.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach, aby zgłębić inne aspekty mechaniki komórkowej.
Często zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Pomiar sztywności komórek bakteryjnych dostarcza ilościowych danych na temat integralności strukturalnej, co może pomóc w walidacji celów w procesie odkrywania leków przeciwdrobnoustrojowych. Ten test biofizyczny umożliwia redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez powiązanie zaburzeń genetycznych lub chemicznych z funkcjonalnymi fenotypami mechanicznymi. Metoda ta wspiera wczesne etapy testowania hipotez, w których zmiany sztywności na zginanie odzwierciedlają zmiany w biosyntezie ściany komórkowej lub organizacji cytoszkieletu.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określenie, w jaki sposób wyciszanie genów lub małe cząsteczki wpływają na integralność ściany komórkowej.
- Wartość operacyjna: Umożliwia screening fenotypowy związków zmieniających właściwości mechaniczne jako wskaźnika letalnego związania z celem.
- Wartość prognostyczna: Zmiany sztywności służą jako wczesne biomarkery podatności celu, wspierając decyzje o kontynuacji lub przerwaniu prac (go/no-go) podczas identyfikacji związków wiodących.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Pozwala na uzyskanie ustandaryzowanych, mierzalnych krzywych siła-przemieszczenie, odpowiednich do wysokoprzepustowego fenotypowania mechanicznego.
- Powtarzalność: Kalibracja pułapki optycznej i dopasowanie liniowe zapewniają spójne pomiary sztywności niezależnie od operatora i laboratorium.
- Skalowalność: Metodę można dostosować do równoległego testowania wielu warunków z wykorzystaniem mikroprzepływowych komór przepływowych i zautomatyzowanego dozowania kulek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla jednostek chorobowych: Jest zgodne z modelami przedklinicznymi, w których ocenia się mechanizm działania antybiotyków celujących w ścianę komórkową.
- Redukcja ryzyka mechanistycznego: Pozwala odróżnić efekty bakteriostatyczne od bakteriobójczych poprzez korelację utraty sztywności z lizą komórek.
- Ciągłość translacyjna: Umożliwia walidację krzyżową między fenotypami mechanicznymi in vitro a skutecznością in vivo w modelach infekcji.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po optymalizację związku wiodącego, dostarczając ortogonalnych danych mechanicznych uzupełniających analizy biochemiczne i oparte na wzroście.
- Biologia odkrywcza: Wspiera wyjaśnianie szlaków poprzez powiązanie mutantów lub leków z konkretnymi efektami mechanicznymi, co pozwala na zmniejszenie ryzyka w przypadku celów zaangażowanych w syntezę peptydoglikanu.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych wyników (sztywność w pN/µm), które umożliwiają rankingowanie związków pod kątem ich wpływu biofizycznego.
- Analityka: Generuje zbiory danych siła-przemieszczenie wymagające analizy regresji liniowej, co umożliwia statystyczne porównanie fenotypów mechanicznych w różnych warunkach.
- Badania translacyjne: Łączy się z pracami przedklinicznymi, dostarczając podstaw mechanistycznych do przewidywania, w jaki sposób środki oddziałujące na ścianę komórkową naruszają jej integralność strukturalną.
- Ponowne zastosowanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku platformę biofizyczną do przesiewania kandydatów na leki przeciwdrobnoustrojowe przeciwko patogenom Gram-ujemnym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwa
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną, zapewniając bezpośrednie odczyty fizyczne integralności ściany komórkowej po zaburzeniu celu.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację analizy poprzez kalibrację pułapki oraz protokoły funkcjonalizacji kulek.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez wczesne odfiltrowywanie związków o nieswoistych lub słabych efektach mechanicznych podczas przesiewania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację leadów z uwzględnieniem ryzyka, wykazujących znaczną redukcję sztywności, co koreluje z podatnością celu.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie pułapkowania optycznego, mikrofluidyki oraz prowadzenia kultur bakteryjnych.
- Zależność od skalibrowanych systemów pułapkowania laserowego i detektorów czułych na położenie w celu pomiaru siły.
- Konieczność standaryzacji procesu przywierania komórek, powlekania kulek oraz warunków wzrostu pomiędzy zespołami badawczymi.
- Adaptacja do innych szczepów bakteryjnych może wymagać optymalizacji chemii powierzchni i induktorów wzrostu.
- Ograniczenia praktyczne obejmują niską przepustowość ze względu na manipulację pojedynczymi komórkami oraz konieczność posiadania wykwalifikowanych operatorów do identyfikacji odpowiednich komórek nitkowatych.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:00
Title
0:41
Introduction
3:19
Measuring the Bending Stiffness of the Bacterial Cells
1:12
Attaching Bacteria to a Coverlip and Preparing the Beads
5:11
Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Representative Results
5:21
Conclusion
5:44
Credits
