Name: Pomiar sztywności na zginanie komórek bakteryjnych za pomocą pułapki optycznej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-04-26T17:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: Poznaj metodę pomiaru sztywności na zginanie komórek E. coli za pomocą pułapki optycznej. Technika ta pozwala badać wkład struktur wewnątrzkomórkowych w mechanikę bakteryjną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wyrażamy wdzięczność Mingzhai Sun za pomocne wskazówki dotyczące wiązania komórek z powierzchniami. Dziękujemy Nedowi Wingreenowi oraz Zemerowi Gitai za wartościowe dyskusje. Badania te były wspierane przez grant National Institutes of Health P50GM07150, nagrodę National Science Foundation CAREER PHY-0844466 oraz Fundację Alfreda P. Sloana.

<ol>
	<li>Hodować komórki E. coli w bulionie Luria-Bertani (LB) do fazy wykładniczej (OD = 0,2-0,4).</li>
	<li>Hodować kulturę w pożywce LB uzupełnionej o 50 μg/mL cefaleksyny przez 15 min w celu indukcji wzrostu filamentowatego, a następnie skoncentrować kulturę 5-krotnie poprzez wirowanie.</li>
	<li>Przygotować szkiełko nakrywkowe pokryte PEI, wprowadzając 1% polietyleniminy rozcieńczonej w wodzie do komory przepływowej, a następnie przemyć wodą po 5-minutowej inkubacji.</li>
	<li>Wprowadzić skoncentrowaną kulturę komórek do komory i przemyć mieszaniną LB i cefaleksyny (50 μg/mL) po 3 min, aby usunąć nieprzyległe komórki.</li>
	<li>Inkubować komorę w temperaturze 37°C przez 30 min-1 h, aby umożliwić wzrost przytwierdzonych komórek przed umieszczeniem w urządzeniu do pułapkowania optycznego.</li>
	<li>Przygotować kuleczki pokryte polilizyną, inkubując polistyrenowe kuleczki o średnicy 0,5 μm (Bangs Labs) w 0,1% polilizyny rozcieńczonej w wodzie przez 30 min. Następnie przemyć kuleczki 3 razy i resuspendować w wodzie.</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór kuleczek dwukrotnie w pożywce LB z cefaleksyną (50 μg/mL) i wprowadzić do komory przepływowej.</li>
	<li>Uchwycić optycznie pływającą kuleczkę i dotknąć nią wolnego końca komórki. (Do sterowania ruchem próbki używamy stolika piezoelektrycznego Mad City Labs). Po znalezieniu odpowiedniej kombinacji kuleczka/komórka, przemyć komorę cefaleksyną w LB (50 μg/mL), aby usunąć nieprzyległe kuleczki.</li>
	<li>Uruchomić dedykowany program LabView w celu przyłożenia sił zginających do komórki i zarejestrowania danych siła-przemieszczenie.
Szczegóły programu
<ol class="lalpha">
 <li>Zkalibrować odpowiedź detektora poprzez skanowanie rastrowe przytwierdzonej kuleczki w wiązce lasera detekcyjnego i rejestrację sygnałów napięcia 3D PSD.</li>
 <li>Zidentyfikować oś długą komórki na obrazie mikroskopowym.</li>
 <li>Przesuwać komórkę skokowo w kierunku prostopadłym do jej osi długiej.</li>
 <li>Zarejestrować przebytą odległość oraz przemieszczenie względem pułapki optycznej.</li>
 <li>Przeliczyć przemieszczenie na przyłożoną siłę, korzystając z wcześniej zmierzonej sztywności pułapki, i zapisać przemieszczenie końca oraz siłę do pliku.</li>
</ol>
</li>
</ol>
Klucze do sukcesu: W kroku 8) należy znaleźć komórkę z wyraźnie unieruchomionym końcem. Niektóre komórki są przymocowane tylko jednym końcem, przez co siła zginania przy drugim końcu prowadzi do obrotu całej komórki zamiast jej zgięcia. Odpowiednią parę znajduje się, szybko zginając każdą komórkę ręcznie za pomocą ruchu stolika sterowanego dżojstikiem.
Reprezentatywne wyniki:
<img src="/files/ftp_upload/2012/2012fig1.jpg" alt="Wykres siła-przemieszczenie; dopasowanie liniowe; prawo Hooke'a; dane eksperymentalne; analiza fizyczna; stała sprężystości." data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Na tej rycinie przedstawiono dane dotyczące siły i przemieszczenia dla pojedynczej komórki. Nachylenie tej linii określa sztywność na zginanie komórki.

<ol><li>Janmey, P. A., McCulloch, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mechanics%3A+integrating+cell+responses+to+mechanical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cell mechanics: integrating cell responses to mechanical stimuli.</a> Annu Rev Biomed Eng. 9, 1-34 (2007).</li>
<li>Morris, D. M., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+biomechanical+understanding+of+whole+bacterial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Toward a biomechanical understanding of whole bacterial cells.</a> Annu Rev Biochem. 77, 583-613 (2008).</li>
</ol>

Produkcja wideo do tego artykułu była sponsorowana przez Mad City Labs, firmę produkującą instrumenty wykorzystane w tych badaniach.

Przedstawiony tutaj protokół został opracowany w celu ilościowego pomiaru właściwości zginania komórek bakteryjnych. Konfiguracja eksperymentalna może być zastosowana do każdej komórki o kształcie pręcika, którą można pobudzić do wzrostu filamentowego. Z sukcesem wykorzystaliśmy ten układ do badania wpływu filamentów cytoszkieletu na sztywność zginania komórek E. coli. Ta sama technika może być użyta do oceny roli ciśnienia, sztywności ściany komórkowej oraz innych komponentów wewnątrzkomórkowych w określaniu ogólnej sztywności zginania komórek.

<table><tbody><tr><td>cefaleksyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4895-5G</td><td></td></tr><tr><td>polietylenoimina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>181978-5G</td><td></td></tr><tr><td>polilizyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>kulki polistyrenowe o średnicy 0,5-&amp;mu;m</td><td>Bangs Laboratories</td><td>PS03N</td><td></td></tr><tr><td>system nanopozycjonowania serii Nano-LP</td><td>Mad City Labs</td><td>NanoLP series</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html">http://www.madcitylabs.com/nanolpseries.html&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

pomiar sztywności zginania komórek bakteryjnych z wykorzystaniem pułapki optycznej

Measuring the Bending Stiffness of Bacterial Cells Using an Optical Trap

Opracowaliśmy protokół służący do pomiaru sztywności zginania nitkowatych bakterii o kształcie pręcika. Siły są przyłożone za pomocą pułapki optycznej, czyli mikroskopowej trójwymiarowej sprężyny zbudowanej ze światła, która powstaje, gdy wiązka lasera o wysokiej intensywności zostaje skupiona w bardzo małym punkcie przez obiektyw mikroskopu. Aby zegnąć komórkę, najpierw wiążemy żywe bakterie z chemicznie potraktowanym szkiełkiem podstawowym. W miarę wzrostu komórek ich środkowa część pozostaje związana ze szkiełkiem, natomiast rosnące końce są wolne od tego ograniczenia. Poprzez indukowanie wzrostu nitkowatego za pomocą leku cefaleksyna jesteśmy w stanie zidentyfikować komórki, w których jeden koniec przylega do powierzchni, podczas gdy drugi pozostaje nieprzymocowany i podatny na siły zginania. Następnie siła zginania jest przyłożona za pomocą pułapki optycznej poprzez przywiązanie koralika pokrytego polilizyną do końcówki rosnącej komórki. Rejestrowane są zarówno siła, jak i przemieszczenie koralika, a sztywność zginania komórki stanowi nachylenie tej zależności.

Przedstawiamy protokół wyginania nitkowatych komórek bakteryjnych przytwierdzonych do powierzchni szkiełka podstawowego za pomocą pułapki optycznej w celu pomiaru sztywności zgięciowej komórek.

Pomiar sztywności zginania komórek bakteryjnych z wykorzystaniem pułapki optycznej

Opracowaliśmy protokół służący do pomiaru sztywności zginania nitkowatych bakterii o kształcie pręcika. Siły są przyłożone za pomocą pułapki optycznej, mikroskopijnego...

Aby określić sztywność zginania pojedynczych komórek coli, najpierw należy wyhodować bakterie do fazy wykładniczej, a następnie przytwierdzić je do chemicznie traktowanej powierzchni szkiełka nakrywkowe. Pozostaw przytwierdzone do powierzchni komórki do dalszego wzrostu, tak aby rozwinęły elastyczne końce. Następnie wprowadź przepływem kulki dielektryczne, przechwyć jedną kulkę i przygnij ją do elastycznej końcówki komórki.Ostatnim etapem procedury jest wygięcie komórki za pomocą pułapki optycznej i pomiar wynikających z tego danych dotyczących wymuszonego przemieszczenia. Sztywność zginania komórki można obliczyć, stosując dopasowanie liniowe do danych wymuszonego przemieszczenia. Cześć, jestem Steven Wong z laboratorium profesora Joshuy Shere'a w Instytucie Genomiki Integracyjnej Louisa Sicklera oraz w Katedrze Fizyki na Uniwersytecie Princeton.Dzisiaj przedstawimy procedurę zginania pojedynczych komórek E. coli oraz pomiaru sztywności komórek. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby badać wpływ różnych struktur wewnątrzkomórkowych na integralność mechaniczną komórek bakteryjnych. Zapraszamy do rozpoczęcia.Aby rozpocząć tę procedurę, należy wyhodować 3 mL dowolnych komórek e coli w medium LB do fazy wykładniczej. Gdy komórki osiągną gęstość optyczną przy 600 nm w zakresie od 0,2 do 0,4, należy uzupełnić kulturę o 50 µg/mL cefaleksyny i inkubować przez 15 minut w celu indukcji wzrostu nitkowatego. W ciągu tych 15 minut należy przygotować komorę przepływową.Przytwierdź dwa kawałki dwustronnej taśmy do szkiełka przedmiotowego w taki sposób, aby między nimi pozostała przerwa o szerokości 3 mm, a następnie przymocuj na górze szkiełko nakrywkowe. Przerwa między kawałkami taśmy tworzy kanał dla przepływającej cieczy. Pokryj szkiełko nakrywkowe PEI, wprowadzając za pomocą mikropipety 10 µL 1% polietylenoiminy rozpuszczonej w wodzie do komory przepływowej, a następnie inkubuj przez pięć minut.Następnie przeprowadź płukanie, wprowadzając 200 µL wody z jednego końca komory i zbierając ją z drugiego końca za pomocą pompy próżniowej. Po 15 minutach hodowli bakterii w obecności cefaleksyny, odwirowuj jeden ml komórek w mikrocentry fudze i resuspenduj je w 200 µL LV z cefaleksyną. Następnie ponownie, używając mikropipety z jednej strony i próżni z drugiej, wprowadź 50 µL skoncentrowanej kultury komórek do komory zawierającej pokrywkę szkiełkami i inkubuj przez trzy minuty.Następnie przemyć 50 µL pożywki Vel B uzupełnionej o cefaleksynę. Aby usunąć nieprzytwierdzone komórki, inkubować komorę w temperaturze 37 °C przez od 30 minut do jednej godziny, aby umożliwić wzrost przytwierdzonych komórek przed umieszczeniem ich w urządzeniu do pułapkowania optycznego podczas inkubacji. Przygotować koraliki powlekane polilizyną, inkubując 3 µL koralików polistyrenowych o średnicy 0,5 µm w 0,1% polilizynie rozcieńczonej w wodzie przez 30 minut.Po zakończeniu inkubacji kulek, należy je wyprać trzykrotnie poprzez wirowanie w mikrocentry fudze i ponowne zawieszenie w 1 ml wody, a następnie przejść do wiązania kulek z bakteriami i pomiaru sztywności wiązania komórek. Najtrudniejszym elementem tego protokołu jest umiejętność zlokalizowania i rozpoznania odpowiedniej komórki do pomiarów sztywności zginania. Za odpowiednią uznaje się komórkę z wyraźnie określonym końcem przytwierdzonym oraz końcem wolnym.W komorze przepływowej mikroskopu należy poszukać komórki z wyraźnie utrwalonym końcem. Niektóre komórki są przytwierdzone tylko jednym końcem, a siła zginająca działająca na drugi koniec powoduje obrót całej komórki zamiast jej zgięcia. Aby znaleźć odpowiednią komórkę, należy szybko zgiąć każdą z nich za pomocą pułapki, wykorzystując ruch stolika sterowany dżojstikiem.Po znalezieniu odpowiedniej komórki, rozcieńczyć roztwór kulek dwukrotnie w pożywce LB z cefaleksyną, a następnie nanieść 30 µL roztworu kulek do komory przepływowej, pipetując go na jednym końcu i delikatnie usuwając nadmiar z drugiego końca za pomocą chusteczki Kimwipe. Za pomocą pułapki optycznej uchwycić pływającą kulkę i dotknąć nią wolnego końca komórki. Ponownie przemyć komórkę za pomocą mikropipety i chusteczki Kimwipe, używając 50 µL cefaleksyny w pożywce LB, aby usunąć nieprzyczepione kulki. Następnie uruchomić dedykowany program LabVIEW w celu przyłożenia sił zginających do komórki i zarejestrować dane dotyczące wymuszonego przemieszczenia.Najpierw skalibruj odpowiedź detektora, wykonując skanowanie RA przyczepionego koralika w wiązce lasera detekcyjnego i rejestrując sygnały napięcia 3D PSD. Następnie określ oś długą komórki na obrazie mikroskopowym. Po wyznaczeniu długiej osi komórki, przesuwaj komórkę skokowo w kierunku prostopadłym do tej osi, rejestrując jednocześnie przebytą odległość oraz przemieszczenie koralika względem centrum pułapki optycznej.Na koniec przekonwertuj wartości przemieszczenia na przyłożoną siłę, korzystając z wcześniej zmierzonej sztywności pułapki, i zapisz wyniki. Przemieszczenie końcówki oraz siła zapisane w pliku stanowią dane dotyczące wymuszonego przemieszczenia dla pojedynczej komórki. Nachylenie tej prostej odpowiada sztywności zginania komórki.Właśnie pokazaliśmy, jak połączyć sztywność zginania bakterii E. coli z pułapką optyczną. Stosując tę procedurę, należy pamiętać o wybraniu odpowiedniej komórki z wyraźnie zdefiniowanym końcem unieruchomionym i końcem wolnym. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

measuring-bending-stiffness-bacterial-cells-using-an-optical

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Pomiar sztywności na zginanie komórek bakteryjnych za pomocą pułapki optycznej

Opisano metodę indywidualnego wyboru, manipulowania i obrazowania żywych patogenów przy użyciu pułapki optycznej sprzężonej z mikroskopem dyskowym (spinning disk). Pułapka optyczna zapewnia przestrzenną i czasową kontrolę nad organizmami i pozwala na umieszczenie ich w bezpośrednim sąsiedztwie komórek gospodarza. Mikroskopia fluorescencyjna pozwala na rejestrację dynamicznych interakcji międzykomórkowych przy minimalnym zaburzeniu stanu komórek.

Wykorzystanie pułapki optycznej do badania oddziaływań gospodarz-patogen w dynamicznym obrazowaniu żywych komórek

Ten artykuł demonstruje protokół charakteryzujący właściwości mechaniczne żywych komórek za pomocą mikrowgłębienia za pomocą mikroskopu sił atomowych (AFM).

Pomiar właściwości mechanicznych żywych komórek za pomocą mikroskopii sił atomowych

Przedstawiono protokół do wystrzeliwania i stabilnego zatrzymywania wybranych mikrocząstek dielektrycznych w powietrzu.

Pułapka optyczna obciążenia mikrocząstek dielektrycznych w powietrzu

Wiele białek w sensie komórkowym i indukuje krzywiznę błony. Opisujemy metodę wyciągania nanorurek błonowych z pęcherzyków lipidowych w celu zbadania interakcji białek lub dowolnej cząsteczki aktywnej pod kątem krzywizny z zakrzywionymi błonami in vitro.

Wyciąganie nanorurek membranowych z gigantycznych pęcherzyków jednowarstwowych

Prezentujemy zestaw pęsety optycznej sprzężonej z mikroskopem z arkuszem świetlnym oraz jej implementację do badania mechaniki komórkowej bez koralików w zarodku Drosophila.

Sondowanie mechaniki komórkowej za pomocą pęsety optycznej bez koralików w zarodku Drosophila

Ten protokół przedstawia kompletny eksperymentalny przepływ pracy do badania interakcji RNA-białko za pomocą pęsety optycznej. Przedstawiono kilka możliwych konfiguracji eksperymentalnych, w tym połączenie pęsety optycznej z mikroskopią konfokalną.

Pęseta optyczna do badania interakcji RNA-białko w regulacji translacji

Tutaj prezentujemy protokół do badania wewnątrzkomórkowych właściwości mechanicznych izolowanych embrionalnych komórek zebrytanicznego danio pręgowanego w trójwymiarowym zamknięciu z bezpośrednim pomiarem siły przez pułapkę optyczną.

Bezpośrednie pomiary siły mechaniki subkomórkowej w zamknięciu za pomocą pęsety optycznej

Tutaj opisany jest zintegrowany protokół oparty na pęsetach optycznych i mikroskopii defoksyjnej do pomiaru właściwości reologicznych komórek. Protokół ten ma szerokie zastosowanie w badaniu właściwości lepkosprężystych erytrocytów w zmiennych warunkach fizjopatologicznych.

Analiza ilościowa właściwości lepkosprężystych krwinek czerwonych przy użyciu pęsety optycznej i mikroskopii defoksyjnej

Przedstawiono i omówiono tworzenie wiązek aktomiozyny in vitro oraz pomiar siły generowania zespołu miozyny za pomocą pęsety optycznej.

Sondowanie mechaniki zespołu miozyny w wiązkach filamentów aktynowych za pomocą pęsety optycznej

Tutaj prezentujemy protokół odtwarzania wiązek mikrotubul in vitro i bezpośredniego ilościowego określania sił wywieranych w ich obrębie za pomocą jednoczesnego pułapkowania optycznego i mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Test ten pozwala na pomiar sił i przemieszczeń generowanych przez zespoły białek w aktywnych sieciach mikrotubul na poziomie nanoskali.

Bezpośredni pomiar sił w odtworzonych wiązkach aktywnych mikrotubul

Wizualna, jednocząsteczkowa biochemia badana za pomocą komór mikroprzepływowych jest znacznie ułatwiona dzięki szklanemu cylindrowi, gazoszczelnym strzykawkom, stabilnym połączeniom rurek z komórkami przepływowymi i eliminacji pęcherzyków poprzez umieszczenie zaworów przełączających między strzykawkami a rurkami. Protokół opisuje podwójne pułapki optyczne, które umożliwiają wizualizację transakcji DNA i oddziaływań międzycząsteczkowych.

Zastosowanie podwójnej pęsety optycznej i mikrofluidyki do badań pojedynczych cząsteczek

Poznaj metodę pomiaru sztywności na zginanie komórek E. coli za pomocą pułapki optycznej. Technika ta pozwala badać wkład struktur wewnątrzkomórkowych w mechanikę bakteryjną.

Pomiar sztywności zginania komórek bakteryjnych z wykorzystaniem pułapki optycznej

Przeglądaj więcej filmów