Pomiar sztywności na zginanie komórek bakteryjnych za pomocą pułapki optycznej
April 26th, 2010
Przedstawiamy protokół zginania nitkowatych komórek bakteryjnych przymocowanych do powierzchni szkiełkowej za pomocą pułapki optycznej do pomiaru sztywności zginania komórek.
Aby określić sztywność zginania poszczególnych komórek coli, najpierw należy wyhodować bakterie do fazy wykładniczej, a następnie przymocować je do chemicznie poddanej obróbce powierzchni szkiełka nakrywkowego. Pozwól, aby komórki już przyczepiły się do powierzchni dalej rosły, aby rozwinęły elastyczne końce. Następnie przelej w kulkach dielektrycznych, uwięzij koralik i zegnij go do elastycznej końcówki komórki.
Ostatnim etapem procedury jest zgięcie ogniwa za pomocą pułapki optycznej i zmierzenie uzyskanych danych dotyczących wymuszonego przemieszczenia. Sztywność komórki na zginanie można obliczyć za pomocą dopasowania liniowego do danych wymuszonego przemieszczenia. Cześć, nazywam się Steven Wong i pracuję w laboratorium profesora Joshuy Shere'a w Instytucie Genomiki Integracyjnej im. Louisa Sicklera i na Wydziale Fizyki Uniwersytetu Princeton.
Dzisiaj pokażemy Wam procedurę gięcia poszczególnych ogniw ekologicznych oraz sztywność komórek małżeńskich. Używamy tej procedury w naszym laboratorium do zbadania wkładu różnych struktur wewnątrzkomórkowych w integralność mechaniczną komórek bakteryjnych. Więc zacznijmy.
Aby rozpocząć tę procedurę, wyhoduj trzy mililitry dowolnych komórek E. coli w fazie LB od średniej do wykładniczej. Gdy komórki osiągną gęstość optyczną przy 600 nanometrach od 0,2 do 0,4, uzupełnij kulturę 50 mikrogramami na mililitr cefaleksyny przez 15 minut, aby wywołać wzrost nitkowaty. W ciągu tych 15 minut przygotuj komorę przepływową.
Przymocuj dwa kawałki taśmy dwustronnej z trzymilimetrową przerwą między kawałkami do szklanego szkiełka i przyklej szkiełko nakrywkowe na górze. Szczelina między kawałkami taśmy tworzy kanał dla przepływającej cieczy. Pokryj szkiełko nakrywkowe PEI, przepływając 10 mikrolitrów 1% polietylenu rozcieńczonego w wodzie do komory przepływowej za pomocą mikropipety, inkubować przez pięć minut.
Następnie umyć, przepływając 200 mikrolitrów wody na jednym końcu komory i zbierając na drugim końcu za pomocą próżni. Po 15 minutach hodowli bakterii w obecności cefaleksyny, odwirować jeden mililitr komórek w mikrowirówce i ponownie zawiesić w 200 mikrolitrach LV z cefaleksyną. Następnie, ponownie, użyj mikropipety na jednym końcu i odkurz na drugim końcu, aby przepuścić 50 mikrolitrów skoncentrowanej kultury komórkowej do komory, w której znajduje się powlekane szkiełko nakrywkowe, inkubować przez trzy minuty.
Następnie umyj 50 mikrolitrami Vel B uzupełnionego cefaleksyną. Aby usunąć nieprzyłączone komórki, inkubuj komorę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut do jednej godziny, aby umożliwić wzrost przyłączonych komórek przed umieszczeniem ich na przyrządzie do pułapki optycznej podczas inkubacji komórek. Przygotuj kulki pokryte polilizyną, inkubując trzy mikrolitry kulek polistyrenowych o średnicy 0,5 mikrometra w jednym z 0,1% polilizyny rozcieńczonej w wodzie przez 30 minut.
Gdy kulki zakończą inkubację, umyj je trzykrotnie, obracając w dół w mikrowirówce i zawieszając resus w jednym mililitrze wody, przystąp do wiązania kulek z bakteriami i zmierz sztywność wiązania komórek. Najtrudniejszym aspektem tego protokołu jest możliwość rozpoznania, zlokalizowania i rozpoznania dobrej komórki do pomiarów zginania, sztywności. A dobra komórka to taka, która ma dobrze zdefiniowany zablokowany koniec i wolne miejsce końcowe.
Komora przepływowa na mikroskopie szuka komórki z dobrze zdefiniowanym, zablokowanym końcem. Niektóre ogniwa są przymocowane tylko na jednej końcówce, a siła zginająca na drugiej końcówce prowadzi do obracania całej komórki, a nie zginania. Aby znaleźć odpowiednią komórkę, szybko zegnij każdą komórkę za pomocą pułapki za pomocą ruchu scenicznego sterowanego joystickiem.
Po znalezieniu odpowiedniej komórki rozcieńczyć roztwór kulki dwukrotnie do funta z cefaleksyną, dodać 30 mikrolitrów roztworu kulek do komory przepływowej, pipetując na jeden koniec i delikatnie wypływając na drugim końcu za pomocą chusteczki Kim, optycznie uwięzić pływającą kulkę i dotknąć jej do wolnego końca komórki. Ponownie umyć komorę za pomocą mikropipety i za pomocą białej chusteczki Kim z 50 mikrolitrami cefaleksyny w LB, aby usunąć nieprzymocowane koraliki. Następnie uruchom niestandardowy pisemny program widoku laboratorium, aby zastosować siły zginające do komórki i zarejestrować dane wymuszonego przemieszczenia.
Najpierw skalibruj odpowiedź detektora, skanując RA dołączony koralik w wykrywającej wiązce laserowej i rejestrując sygnały napięciowe 3D PSD. Następnie zidentyfikuj długą oś komórki na obrazie mikroskopowym. Po zidentyfikowaniu długiej osi komórki, przesuwaj komórkę krokowo w kierunku prostopadłym do długiej osi, przesuwając rekord komórki, przebytą odległość i przemieszczenie koralika od środka pułapki optycznej.
Na koniec przekształć wartości przemieszczenia na przyłożoną siłę, korzystając z wcześniej zmierzonej sztywności pułapki i zapisz. Przemieszczenie końcówki i siła do spiłowania w tym miejscu są danymi wymuszonego przemieszczenia dla pojedynczej komórki. Nachylenie tej linii to sztywność komórki na zginanie.
Właśnie pokazaliśmy, jak połączyć sztywność zginania E. coli z pułapką optyczną. Korzystając z tej procedury, należy pamiętać, aby znaleźć dobrą komórkę z dobrze zdefiniowanym zablokowanym końcem i wolnym końcem. Więc to wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół do pomiaru sztywności gięcia włóknistych komórek bakterii przy użyciu technik pułapek optycznych. Metoda obejmuje hodowle komórek E. coli, ich przymocowanie do szkiełka pokrywowego i stosowanie sił gięcia w celu oceny ich właściwości mechanicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Biofizyka
- Mechanika komórki
Tło
- Rozumienie właściwości mechanicznych komórek bakteryjnych jest kluczowe dla poznania ich zachowania i integralności.
- Włókniste wzrost E. coli może być indukowany w celu badania ich sztywności gięcia.
- Pułapki optyczne zapewniają nieinwazyjną metodę stosowania sił na pojedyncze komórki.
- Poprzednie badania koncentrowały się na integralności mechanicznej komórek w różnych warunkach.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnego protokołu do pomiaru sztywności gięcia komórek E. coli.
- Zbadanie wkładu struktur wewnątrzkomórkowych w mechanikę komórki.
- Poprawa rozumienia zachowania komórek bakteryjnych pod wpływem stresu mechanicznego.
Stosowane metody
- Hodowla komórek E. coli w środowisku LB do fazy wykładniczej.
- Indukcja włóknistego wzrostu za pomocą cefaleksyny.
- Przymocowanie komórek do chemicznie traktowanego szkiełka pokrywowego.
- Zastosowanie pułapek optycznych do stosowania sił gięcia i pomiaru danych o przemieszczeniu.
Główne wyniki
- Protokół skutecznie mierzy sztywność gięcia pojedynczych komórek E. coli.
- Analiza danych ujawnia związek między stosowaną siłą a przemieszczeniem komórek.
- Identyfikacja odpowiednich komórek do pomiaru jest kluczowa dla dokładnych wyników.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia mechaniki komórek bakteryjnych.
Wnioski
- Opracowany protokół jest skuteczny w badaniu właściwości mechanicznych komórek bakteryjnych.
- Pułapki optyczne są cennym narzędziem do badania sztywności komórek.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych odkryciach, aby zbadać inne aspekty mechaniki komórkowej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Measuring bacterial cell stiffness provides a quantitative readout of structural integrity that can inform target validation in antimicrobial discovery. This biophysical assay enables mechanistic de-risking by linking genetic or chemical perturbations to functional mechanical phenotypes. The method supports early-stage hypothesis testing where changes in bending rigidity reflect alterations in cell wall biosynthesis or cytoskeletal organization.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by quantifying how genetic knockdowns or small molecules affect cell wall integrity.
- Operational Value: Enables phenotypic screening of compounds that alter mechanical properties as a proxy for lethal target engagement.
- Predictive Value: Stiffness changes serve as early biomarkers of target vulnerability, supporting go/no-go decisions in lead identification.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Produces standardized, quantifiable force-displacement curves suitable for high-content mechanical phenotyping.
- Reproducibility: Optical trap calibration and linear fitting ensure consistent stiffness measurements across operators and labs.
- Scalability: The method can be adapted to test multiple conditions in parallel using microfluidic flow chambers and automated bead delivery.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Aligns with preclinical models where cell wall-targeting antibiotics are evaluated for mechanism of action.
- Mechanistic De-risking: Distinguishes bacteriostatic from bactericidal effects by correlating stiffness loss with cell lysis.
- Translational Continuity: Enables cross-validation between in vitro mechanical phenotypes and in vivo efficacy in infection models.
Pipeline & Workflow Integration
The assay fits within the discovery continuum from target validation to lead optimization, providing orthogonal mechanical data to complement biochemical and growth-based assays.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking mutants or drugs to specific mechanical outcomes, de-risking targets involved in peptidoglycan synthesis.
- Screening: Delivers quantitative outputs (stiffness in pN/µm) that enable rank-ordering of compounds by biophysical impact.
- Analytics: Generates force-displacement datasets requiring linear regression analysis, enabling statistical comparison of mechanical phenotypes across conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by providing a mechanistic basis for predicting how cell wall agents compromise structural integrity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable biophysical platform for screening antimicrobial candidates across Gram-negative pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by providing direct physical readouts of cell wall integrity upon target perturbation.
- Operational Value: Ensures assay standardization through trap calibration and bead functionalization protocols.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by filtering compounds with non-specific or weak mechanical effects early in screening.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of leads demonstrating significant stiffness reduction, correlating with target vulnerability.
Implementation Considerations
- Requires expertise in optical trapping, microfluidics, and bacterial culture handling.
- Depends on calibrated laser trapping systems and position-sensitive detectors for force measurement.
- Necessitates standardization of cell attachment, bead coating, and growth conditions across teams.
- Adaptation to other bacterial strains may require optimization of surface chemistry and growth inducers.
- Practical limitations include low throughput due to single-cell manipulation and the need for skilled operators to identify suitable filamentous cells.
