Drosophila In Vivo (Drosophila) in vivo (Drosophila) Obrazowanie wapnia: metoda funkcjonalnego obrazowania aktywności neuronalnej

- Aby wykonać obrazowanie wapnia in vivo w układzie nerwowym Drosophila, należy skupić się na ekspresji genetycznie kodowanego wskaźnika wapnia, takiego jak GCaMP, w interesujących neuronach. Kiedy neurony wystrzeliwują potencjał czynnościowy, szybka depolaryzacja błony powoduje otwarcie kanałów wapniowych bramkowanych napięciem, co prowadzi do napływu zewnątrzkomórkowego wapnia do komórki.

GCaMP jest białkiem fuzyjnym, w którym wzmocnione białko zielonej fluorescencji lub EGFP jest modyfikowane i łączone z fragmentem M13 łańcucha lekkiego miozyny na końcu N oraz z białkiem wiążącym wapń, kalmoduliną, na końcu C. Wapń wiąże się z kalmoduliną, wyzwala zmiany konformacyjne w GCaMP, powodując wzrost fluorescencji białka.

Aby zobrazować zmiany we fluorescencji GCaMP jako wskaźnik aktywności neuronalnej in vivo, należy naświetlić obszar układu nerwowego o przewidywanej aktywności. Następnie użyj mikroskopu fluorescencyjnego, który może uchwycić dynamikę GCaMP i jest wyposażony w konfigurację dostarczania bodźców. Dostarcz bodziec, na przykład zapach, jednocześnie rejestrując fluorescencję GCaMP w reagujących neuronach.

W przykładowym protokole zobaczymy, jak obrazowanie funkcjonalne GCaMP jest wykorzystywane do wizualizacji reakcji w ciałach grzybów mózgu podczas węchowego uczenia się asocjacyjnego.

- W celu wizualizacji wskaźników wapniowych opartych na GFP należy dostroić laser mikroskopu wielofotonowego wyposażonego w laser na podczerwień i obiektyw zanurzeniowy w wodzie, zainstalowanego na stole z izolacją drgań, do długości fali wzbudzenia 920 nanometrów i zainstalować filtr pasmowoprzepustowy GFP. Za pomocą pokrętła regulacji zgrubnej litery Z przeskanuj oś Z mózgu, aby zlokalizować obszar mózgu będący przedmiotem zainteresowania. Użyj funkcji kadrowania, aby ustawić ostrość skanowania tylko na obszarze zainteresowania, aby zminimalizować czas skanowania, i obróć widok skanowania tak, aby przednia część głowy była skierowana w dół. Następnie dostosuj rozmiar klatki do 512 na 512 pikseli i wybierz region do skanowania, biorąc pod uwagę obliczony czas skanowania dla każdej klatki, aby osiągnąć częstotliwość odświeżania co najmniej 4 Hz.

W celu wizualizacji stanu przejściowego wapnia wywołanego zapachem, zainicjuj wstępnie zaprogramowany pakiet makr, który może połączyć oprogramowanie do akwizycji obrazu i program dostarczania zapachu, a następnie rozpocznij pomiar w oprogramowaniu mikroskopu na 6,25 sekundy, aby ustalić wartość bazową F0. W systemie dostarczania zapachów należy dostarczyć 2,5-sekundowy bodziec zapachowy, sygnalizowany tutaj zapaleniem diod LED, wyzwalany przez otwarcie i zamknięcie określonych zaworów kubków zapachowych, a następnie 12,5 sekundy nagrywania na końcu przesunięcia zapachu. Następnie powtórz podawanie drugiego i trzeciego środka zapachowego w ten sam sposób.

Aby przeprowadzić warunkowanie asocjacyjne w tej konfiguracji, użyj sterowanego komputerowo systemu dostarczania zapachów, aby przedstawić kondycjonowany bodziec i zapach przez 60 sekund, wraz z 12 90-woltowymi wstrząsami elektrycznymi. Po 60-sekundowej przerwie prezentuj sam bodziec kondycyjny minus zapach przez 60 sekund bez porażenia prądem. Ponownie zmierz stany przejściowe wapnia wywołane przez nieprzyjemny zapach po treningu, powtarzając protokół przedtreningowej stymulacji zapachu 3 minuty po zakończeniu fazy treningowej. Następnie zapisz pliki obrazowania w odpowiednim formacie do późniejszej analizy obrazu.