Karmienie RNAi w hodowli płynnej: wysokoprzepustowa metoda obniżania ekspresji genów u C. elegans

- Na początek dodaj karbenicylinę i jeden milimolowy IPTG w celu kontroli i przetestowania kolb hodowlanych zawierających podłoże podstawowe S. Obracaj rurkę zawierającą larwy w pierwszej fazie wzrostu, zwane również larwami L1, przez kilka minut. Teraz usuń supernatant i umieść dwa mikrolitry L1 na płytce agarowej. Umieść płytkę pod mikroskopem preparacyjnym i policz liczbę larw.

Dodać bakterie RNAi przenoszące niespecyficzny plazmid RNAi do kolby kontrolnej i bakterie z RNAi ukierunkowanym genowo do kolby testowej. Ilość dodanych bakterii powinna być proporcjonalna do liczby robaków.

Pozwól larwom rosnąć z ciągłym potrząsaniem, aby zapewnić prawidłowe natlenienie. Larwy żywią się bakteriami. Wewnątrz larwy mały interferujący RNA wiąże się z komplementarnym mRNA wytwarzanym przez docelowy gen i hamuje ekspresję białka. Na koniec zbadaj robaki pod kątem interesującego Cię fenotypu.

W przykładowym protokole będziemy traktować larwy L1 RNAi ukierunkowane na gen daf-2, w płynnej hodowli.

- Aby rozpocząć leczenie, dodać 207,45 mililitrów podłoża podstawowego S z dodatkowymi odczynnikami, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym, do kolby hodowlanej Fernbacha o pojemności 2 800 mililitrów. Dodać końcowe stężenie 50 mikrogramów na mililitr karbenicyliny i 1 milimolowy IPTG i zamknąć kolbę zakrętką membranową.

Wyjmij L1 z inkubatora o temperaturze 25 stopni Celsjusza i przenieś je do 15-mililitrowych probówek. Odwirować L1 w temperaturze 1,900 g przez trzy minuty. Po odwirowaniu usunąć supernatant. Pod mikroskopem policz L1 na dwa mikrolitry i uśrednij liczby uzyskane z co najmniej dziewięciu kropli.

Następnie dodaj 50 000 robaków do kolekcji młodych robaków i 100 000 robaków do kolekcji starych robaków do czterech kolb hodowlanych Fernbacha przygotowanych w poprzednim kroku. Następnie dodaj kontrolne bakterie RNAi i bakterie RNAi dla interesującego genu proporcjonalnie do liczby robaków.

Po dodaniu bakterii zakończ hodowlę robaków z bazą S, aby uzyskać całkowitą objętość do 300 mililitrów. Inkubować kulturę robaków w temperaturze 25 stopni Celsjusza w inkubatorze z wytrząsaniem z prędkością 150 obr./min do zebrania.