Karmienie RNAi w hodowli płynnej: wysokoprzepustowa metoda obniżania ekspresji genów u C. elegans
JoVE Encyklopedia Eksperymentów
Biologia
0 wyświetleń • 3:15 min. • April 30th, 2023
- Na początek dodaj karbenicylinę i jeden milimolowy IPTG w celu kontroli i przetestowania kolb hodowlanych zawierających podłoże podstawowe S. Obracaj rurkę zawierającą larwy w pierwszej fazie wzrostu, zwane również larwami L1, przez kilka minut. Teraz usuń supernatant i umieść dwa mikrolitry L1 na płytce agarowej. Umieść płytkę pod mikroskopem preparacyjnym i policz liczbę larw.
Dodać bakterie RNAi przenoszące niespecyficzny plazmid RNAi do kolby kontrolnej i bakterie z RNAi ukierunkowanym genowo do kolby testowej. Ilość dodanych bakterii powinna być proporcjonalna do liczby robaków.
Pozwól larwom rosnąć z ciągłym potrząsaniem, aby zapewnić prawidłowe natlenienie. Larwy żywią się bakteriami. Wewnątrz larwy mały interferujący RNA wiąże się z komplementarnym mRNA wytwarzanym przez docelowy gen i hamuje ekspresję białka. Na koniec zbadaj robaki pod kątem interesującego Cię fenotypu.
W przykładowym protokole będziemy traktować larwy L1 RNAi ukierunkowane na gen daf-2, w płynnej hodowli.
- Aby rozpocząć leczenie, dodać 207,45 mililitrów podłoża podstawowego S z dodatkowymi odczynnikami, zgodnie z opisem w dołączonym protokole tekstowym, do kolby hodowlanej Fernbacha o pojemności 2 800
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych