Badania przesiewowe toksyczności chemicznej na podstawie zarodków: ocena wpływu na rozwój zarodków danio pręgowanego

- Rozpocznij od dodania 5 zarodków z pożywki E3 do każdego dołka na 96-dołkowej płytce i usuń nadmiar pożywki za pomocą pipety. Dodaj pożywkę E3 zawierającą kanamycynę do każdej studzienki, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Niech zarodki rosną w temperaturze 28 stopni Celsjusza.

Rozcieńczyć interesujący nas związek odpowiednim rozpuszczalnikiem, takim jak DMSO, aby przygotować kilka stężeń lub dawek i przetestować wpływ każdej dawki na rozwijające się zarodki. Gdy zarodki osiągną pożądany etap, należy pipetować każdy roztwór podstawowy do osobnych studzienek. Przykryj talerz pokrywką i delikatnie zamieszaj, aby wymieszać zawartość. Pozwól zarodkom w studzienku rosnąć w temperaturze 28 stopni Celsjusza.

W pożądanym momencie rozwoju embrionalnego umieścić płytkę studzienki pod odpowiednim mikroskopem w celu zbadania fenotypu zarodków. Możesz zaobserwować fenotypy, takie jak utrata oczu, opóźniony wzrost lub utrata melanocytów w rozwijających się zarodkach. W poniższym protokole przetestujemy bibliotekę związków pod kątem małocząsteczkowych inhibitorów rozwoju przodomózgowia.

- Biblioteki małych cząsteczek są zwykle dostarczane w 96-dołkowej płytce źródłowej, a każdy związek jest przechowywany w DMSO jako 10-milimolowy zapas. Na około 60 minut przed osiągnięciem przez zarodki pożądanego stadium należy rozmrozić odpowiednią liczbę 96-dołkowych płytek zawierających podwielokrotności małych cząsteczek. Zwróć uwagę na numer seryjny lub inny numer identyfikacyjny tabliczek źródłowych. Aby zminimalizować kondensację na płytkach, rozmrozić w komorze osuszającej zawierającej dryryt.

Krótko odwiruj płytki w wirówce stołowej wyposażonej w adapter płytki wielodołkowej. Usuń aluminiową taśmę uszczelniającą z płyty źródłowej. Za pomocą 12-kanałowej pipety rozcieńczyć związki w płytce źródłowej do pożądanego stężenia za pomocą DMSO. W tym protokole używamy końcowego stężenia 0,5 milimola i dodajemy 4,75 mikrolitra DMSO w celu rozcieńczenia 10-milimolowej płytki podstawowej.

Gdy zarodki na 96-dołkowej płytce osiągną pożądany etap, użyj 12-kanałowej pipety, aby przenieść 2,5 mikrolitra związków z płytek źródłowych do płytek biorczych zawierających zarodki. Przykryć płytki zawierające zarodki i związki innymi pokrywkami i zanotować numer identyfikacyjny płytek źródłowych na płytkach zarodkowych. Wymieszaj płytki, delikatnie obracając, i umieść je w inkubatorze o temperaturze 28,5 stopnia Celsjusza. Przykryj każdą płytkę źródłową zawierającą niewykorzystane małe cząsteczki aluminiową taśmą uszczelniającą i umieść w zamrażarce o temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do długotrwałego przechowywania.

Przed wykonaniem ekranu wizualnego sformułuj konkretne kryterium trafienia. Na przykład w badaniu przesiewowym pod kątem małocząsteczkowych inhibitorów rozwoju przodomózgowia trafienie może być związkiem, który powoduje utratę przodomózgowia. Brak oczu jest łatwym wizualnym wskaźnikiem utraty przodomózgowia i nie wymaga fluorescencji do oznaczenia.

W pożądanych momentach rozwoju należy wyjąć z inkubatora 96-dołkowe płytki zawierające zarodki poddane działaniu związków chemicznych i zbadać każdą studzienkę pod mikroskopem stereoskopowym. Podczas badań przesiewowych w kierunku małocząsteczkowych inhibitorów rozwoju przodomózgowia należy zbadać płytki po 28 godzinach pod kątem utraty oka jako markera zahamowania rozwoju przodomózgowia. Należy zapisać tożsamość płytki i lokalizację studzienki dla każdej studzienki, w której co najmniej 3 z 5 zarodków wykazują zalecany fenotyp trafienia.

Umieścić 96-dołkową płytkę z powrotem w inkubatorze. Potwierdź utratę oczu i przodomózgowia po 48 godzinach. Nawet jeśli zarodki nie będą miały przodomózgowia, przeżyją do co najmniej czterech dni. Potwierdź potencjalne trafienie, ponownie testując działanie związku w kilku dawkach. Dla każdej dawki 10 zarodków jest badanych w 0,5 mililitra pożywki E3 w formacie płytki 48-dołkowej.

Czas dodania związku do ponownego badania powinien być identyczny z terminem pierwotnego badania przesiewowego. Trafienie jest potwierdzone, gdy wywołany fenotyp jest odtwarzany w sposób zależny od dawki po ponownym badaniu związku. Na koniec zidentyfikuj trafiony związek z bazy danych małych cząsteczek w bibliotece chemicznej.