Celowana ablacja wątroby: indukowanie śmierci hepatocytów za pomocą metronidazolu u transgenicznych larw danio pręgowanego

- Rozpuść metronidazol w wodzie jajecznej zawierającej rozpuszczalnik DMSO i dodaj fenylotiomocznik, który zapobiega tworzeniu się pigmentu w zarodkach. Przenieść kilka larw w odpowiednim wieku na płytki zabiegowe i kontrolne. Następnie dodać pożądane stężenie roztworu metronidazolu do płytki testowej i wodę jajeczną zawierającą DMSO do płytki kontrolnej.

Niech larwy na obu płytkach rosną w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Transgeniczne larwy wytwarzają nitroreduktazę tylko w hepatocytach, która przekształca metronidazol w lek cytotoksyczny, powodując śmierć tylko docelowych hepatocytów. Po leczeniu należy usunąć roztwór metronidazolu z płytki zabiegowej i umyć zarodki wodą z jaj.

Dodaj trikainę, aby znieczulić larwy i zbadaj je pod mikroskopem epifluorescencyjnym pod kątem ciężkiej ablacji hepatocytów - zniszczenia komórek wątroby. U osób leczonych zaobserwuje się znacznie mniejszą wątrobę niż u osób z grupy kontrolnej. W przykładowym protokole użyjemy metronidazolu do ablacji hepatocytów u transgenicznych larw danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji wątroby.

- Przenieś do 100 zarodków na 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 25 mililitrów wody jajecznej i umieść szalkę w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Aby zahamować pigmentację, dodaj PTU do kultury do 10 godzin po zapłodnieniu. Po 80 godzinach od zapłodnienia znieczulić larwy trikainą i użyć mikroskopu epifluorescencyjnego do zebrania larw CFP dodatnich, trzymając tylko zwierzęta o wątrobach o podobnej wielkości

Następnie zastąp wodę z jaj trikainy świeżą wodą jajeczną uzupełnioną PTU i włóż larwy danio pręgowanego z dodatnim CFP do inkubatora o temperaturze 28 stopni Celsjusza. Aby potraktować larwy danio pręgowanego MTZ, najpierw podziel odpowiednią liczbę larw na dwa różne naczynia hodowlane. Utrzymuj doświadczalną grupę larw w roztworze świeżo przygotowanego MTZ, a grupę kontrolną w wodzie jajecznej uzupełnionej DMSO.

Przykryj grupę doświadczalną folią aluminiową, aby zapobiec dezaktywacji fotoaktywnej MTZ i inkubuj obie grupy larw danio pręgowanego w temperaturze 28 stopni Celsjusza. Pod koniec okresu ablacji usuń roztwór MTZ z płytek i umyj lawę potraktowaną MTZ dwa do trzech razy 25 mililitrami wody jajecznej i mieszając, wyrzucając wodę jajeczną po każdym myciu. Po ostatnim płukaniu należy unieruchomić larwy połową stężenia tricainy stosowanego wcześniej, aby uniknąć obrzęku serca i śmierci larw leczonych MTZ. Następnie użyj filtra CFP na mikroskopie epifluorescencyjnym, aby ocenić poziom ablacji hepatocytów na podstawie względnej wielkości wątroby lawy poddanej działaniu MTZ. Rozważmy, że danio pręgowany z dużymi wątrobami stanowi od 0% do 5% larw, które nie są poddane ablacji, te z wątrobami średniej wielkości stanowią od 10% do 20% larw, które mają być częściowo poddane ablacji, oraz te z bardzo małymi wątrobami, które stanowią od 80% do 90% larw, które mają zostać całkowicie poddane ablacji.