Ekstrakcja DNA z klipsa ogonowego: metoda stosowana w genotypowaniu danio pręgowanego

- Rozpocznij zabieg od umieszczenia znieczulonej dorosłej ryby na stosie chłonnego papieru. Teraz użyj sterylnej żyletki, aby przeciąć płetwę ogonową i szybko przenieś rybę do zbiornika zawierającego świeżą wodę w celu odzyskania zdrowia. Przenieś zacisk ogonowy do czystej rurki zawierającej bufor do lizy. Bufor do lizy zawiera niejonowe detergenty, które rozpuszczają błonę plazmatyczną i błonę jądrową komórki. Bufor zawiera również enzym zwany proteinazą K, który rozkłada białka i umożliwia uwalnianie DNA do lizatu. Rozkłada również nukleazy, chroniąc DNA przed trawieniem nukleazy.

Teraz pozostaw probówki z zaciskami ogonowymi w inkubatorze na noc, aby całkowicie rozbić tkankę w temperaturze 55 stopni Celsjusza z ciągłym obracaniem. Następnie podgrzej probówkę w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby dezaktywować proteinazę K. Odwiruj probówkę do granulowania niestrawionego materiału i przenieś supernatant zawierający DNA do innej probówki. Dodaj alkohol, aby wytrącić DNA i ponownie odwirować, aby zebrać DNA w postaci osadu. W poniższym protokole wyizolujemy DNA z klipsa ogonowego dorosłego danio pręgowanego i z całego zarodka.

- W dniu przygotowania DNA dodać świeżą proteinazę K do buforu do lizy w stężeniu 1 miligram na mililitr. Tkankę można pobrać od dorosłej ryby za pomocą klipsa do płetw lub od ryby embrionalnej.

Najpierw znieczul rybę roztworem tricainy. Poczekaj, aż ruchy skrzeli zwolnią. Następnie połóż rybę na stosie chusteczek i sterylną żyletką odetnij mały kawałek płetwy ogonowej o długości około 2 do 3 milimetrów. Szybko umieść rybę w oznakowanym zbiorniku ze świeżą wodą w celu odzyskania.

Podnieś klips do płetwy ze sterylną końcówką pipety i przenieś go do probówki wypełnionej stu mikrolitrami buforu do lizy DNA. Pamiętaj, aby oznaczyć zarówno zbiornik zwierzęcia, jak i rurkę. Inkubuj wszystkie pobrane tkanki przez co najmniej cztery godziny i do nocy w temperaturze 55 stopni Celsjusza.

Po inkubacji dezaktywować proteinazę K poprzez podgrzewanie probówek w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez 15 minut. Próbki te powinny być natychmiast wykorzystane do PCR, ale mogą być również przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez okres do trzech miesięcy.