JoVE Encyclopedia of Experiments
Biologia
0 wyświetleń • 3:27 min • April 30th, 2023
- Zacznij od szalki Petriego zawierającej zarodki w pożywce E3. Dodaj trikainę w celu znieczulenia zarodków i fenylotioryn, roztwór PTU, aby zahamować tworzenie się pigmentu. Za pomocą mikroskopu preparacyjnego usuń zarodki.
Za pomocą szklanej pipety przenieś jeden z odkorówkowych zarodków na małą szalkę Petriego z płytkim szklanym dnem pośrodku i usuń nadmiar pożywki. Następnie umieść roztwór agarozy o optymalnym stężeniu, aby zminimalizować zniekształcenia i ruchliwość zarodków, w probówce do mikrofuzy i podgrzej go. Obniż temperaturę do 30 stopni Celsjusza, aby uniknąć uszkodzenia zarodka z powodu ciepła.
Wlej pierwszą warstwę agarozy na zarodek, całkowicie wypełniając płytką studnię. Umieść kolejną szklankę nakrywkową nad studzienką i dodaj do niej 1% agarozy. Druga warstwa utrzymuje szkło nakrywkowe na miejscu.
Gdy agaroza zastygnie, napełnij szalkę Petriego pożywką E3 zawierającą trikainę. Jest to trzecia warstwa, która utrzymuje nawodnienie agarozy i zarodka. W poniższym protokole wykonamy warstwowe mocowanie zarodków danio pręgowanego w celu wydłużenia czasu obrazowania poklatkowego.
- Tuż przed montażem podgrzej roztwór agarozy do 65 stopni Celsjusza, a następnie pozwól mu ostygnąć do około 30 stopni Celsjusza, aby zarodek nie został uszkodzony przez ciepło i dodaj trikainę do roztworu agarozy. Używaj naczyń ze szklanym dnem o grubości 35 milimetrów ze szklanym dnem pokrytym numerem zero. Delikatnie umieść zdekorionowany zarodek jedną z jego bocznych stron w kierunku dna naczynia za pomocą szklanej pipety lub mikropipety. Następnie ostrożnie usuń pozostały E3 za pomocą mikropipety.
Dodaj pierwszy roztwór agarozy do małego dołka utworzonego przez szklankę nakrywkową przymocowaną do dna naczynia, aby przykryć zarodek, upewniając się, że agaroza przykrywa małą studzienkę, ale jej nie przelewa. Przykryj małą studzienkę szkłem nakrywkowym, aby stworzyć wąską przestrzeń wypełnioną agarozą z zarodkiem między dwoma szkłami nakrywkowymi. Umieść warstwę 1% roztworu agarozy na wierzchu szkła nakrywkowego na całym dnie naczynia, co utrzyma szkło nakrywkowe na miejscu podczas krzepnięcia. Następnie napełnij pozostałą część naczynia E3 zawierającym 0,02% trikainy, aby utrzymać nawodnienie systemu. Aby określić optymalne stężenie agarozy dla warstwy pierwszej, umieść zarodki w rosnących stężeniach agarozy i wykonaj obrazowanie poklatkowe, aby określić stężenie, które minimalizuje zniekształcenia i ruchliwość zarodka, a następnie przetestuj dokładniejszy zakres stężeń w oparciu o wyniki.
- Najważniejszym krokiem tego protokołu jest określenie optymalnego stężenia agarozy dla warstwy pierwszej. Przetestuj różne nanostężenia agarozy, takie jak 0,030%, 0,032% i tak dalej, aby znaleźć optymalne stężenie.