Aksotomia lasera dwufotonowego: metoda uszkadzania aksonów w zarodkach danio pręgowanego i obserwowania regeneracji aksonów

- Umieść interesujące nas zarodki w fenylotiomoczniku, PTU, roztworze Ringera, aby zahamować tworzenie pigmentu, które rozpoczyna się po 24 godzinach od zapłodnienia. Dzięki temu rozwijająca się anatomia jest bardziej widoczna, co jest niezbędne do tego zabiegu. Przenieść znieczulony zarodek trikainą do komory obrazowania. Umieść szklane szkiełko na górze i view to pod mikroskopem. Skoncentruj się na aksonie, który ma zostać uszkodzony, który jest widoczny pod laserem o długości 488 nanometrów, ponieważ transgenetycznie wyraża GFP.

Zrób zdjęcie witryny przed zdjęciem. Następnie obejrzyj akson za pomocą lasera o długości 910 nanometrów, który powoduje fluoryzację GFP na czerwono. Zwiększ intensywność tego lasera, aby uszkodzić obszar docelowy bez wpływu na otaczającą tkankę. Ten proces nazywa się aksotomią. Zrób nowe zdjęcie za pomocą pierwszego lasera, aby potwierdzić aksotomię, która wygląda jak rozrzucone szczątki. W poniższym protokole wykonamy aksotomię obwodowych aksonów czuciowych w zarodkach danio pręgowanego za pomocą lasera dwufotonowego.

- Jeśli specjalnie skonstruowany teleskop dwufotonowy nie jest dostępny w Twoim laboratorium, konfokalny mikroskop dwufotonowy Zeiss 510 może być również użyty do przecinania aksonów. Zaczynamy od umieszczenia zamontowanego zarodka na stoliku i ustawienia ostrości za pomocą obiektywu wodnego o powiększeniu 25x. Następnie włącz dwa lasery fotonowe i argonowe w ustawieniu wielościeżkowym, aby możliwe było przełączanie z jednego na drugi.

Chociaż oba lasery są używane do wykrywania GFP, emisja dwóch fotonów jest wizualizowana na czerwono, a emisja lasera argonowego na zielono w celu rozróżnienia tych dwóch. Użyj lasera argonowego, aby zidentyfikować akson, który ma zostać zraniony. W obszarze Ustawienia Z zaznacz pierwszą i ostatnią sekcję optyczną, wykonaj obraz konfokalny i utwórz maksymalną projekcję stosu Z.

Wyłącz laser argonowy i włącz laser dwufotonowy. Skanuj z intensywnością transmisji około 9%, aby upewnić się, że akson jest nadal ostry. Kliknij przycisk Zatrzymaj, aby narzędzie Kadrowanie było dostępne. Użyj opcji Przytnij, aby powiększyć obszar zainteresowania. Zazwyczaj powiększamy do około 70x. Wybierz obszar aksonu, który ma zostać zraniony i ustaw ostrość na tym obszarze. Powiększenie można sprawdzić w zakładce Tryb.

Następnie w zakładce Kanały zmień intensywność transmisji dwóch fotonów z około 9% na 15% do 30% transmisji. Aby aktywować nowe ustawienia, kliknij przycisk Fast XY, a następnie kliknij Zatrzymaj szybko, aby uniknąć nadmiernych uszkodzeń. Akson powinien być postrzegany jako rozrzucone szczątki, jeśli procedura zadziałała. Na koniec, aby upewnić się, że akson rzeczywiście został uszkodzony, przełącz się z powrotem na laser argonowy o długości 488 nanometrów. Weź kolejny obraz konfokalny i utwórz maksymalną projekcję stosów Z.