Wstrzyknięcie domięśniowe (IM): Podanie związku do mięśnia grzbietowego dorosłego danio pręgowanego

- Przenieś znieczuloną rybę trykainą na mokrą gąbkę stroną grzbietową skierowaną do góry. Umieść gąbkę z rybą pod mikroskopem. Umieścić igłę do mikroiniekcji pod kątem 45 stopni od osi ciała w pobliżu mięśnia grzbietowego.

Następnie zlokalizuj miejsce przed płetwą grzbietową, które nie jest pokryte łuskami, w które możesz włożyć igłę bez użycia dużej siły. Następnie delikatnie włóż igłę i powoli wstrzyknij interesujący nas związek wraz z markerem, takim jak czerwień fenolowa, do mięśnia.

Jeśli interesujący nas związek zawiera materiał genetyczny, należy elektroporować komórki, umieszczając elektrody po obu stronach miejsca wstrzyknięcia i podając prąd. Prąd sprawia, że komórki mięśniowe są przepuszczalne i zdolne do sprawnego pobierania materiału genetycznego. Po zabiegu natychmiast przenieś rybę do zbiornika regeneracyjnego. W poniższym protokole wykonamy wstrzyknięcie domięśniowe dorosłemu danio pręgowanemu, aby dostarczyć szczepionkę DNA przeciwko mykobakteriozie.

Aby utrzymać rybę w ustalonej pozycji podczas wstrzykiwania, należy użyć kawałka gąbki z rowkiem wyciętym pośrodku jako wyściółka. Dokładnie namocz gąbkę w wodzie systemowej i umieść ją na szalce Petriego. Za pomocą plastikowej łyżki przenieś znieczulonego danio pręgowanego do mokrej gąbki brzuszną stroną ryby do dołu w rowku. Pod mikroskopem umieść igłę pod kątem 45 stopni w pobliżu mięśnia grzbietowego danio pręgowanego. Następnie znajdź małe miejsce bez łusek przed płetwą grzbietową i wepchnij igłę w mięsień.

Jeśli wyczujesz jakiś opór, wypróbuj sąsiednie miejsce. Użyj przełącznika nożnego, aby stopniowo wstrzykiwać roztwór plazmidu do mięśnia. Pod mikroskopem czerwień fenolowa powinna być widoczna, gdy dostaje się do tkanki mięśniowej.

Rybę należy poddać elektropoturze natychmiast po wstrzyknięciu, umieszczając elektrody typu pęseta po obu stronach miejsca wstrzyknięcia. Naciśnij przycisk Start na elektroporatorze i wyślij mu sześć impulsów o napięciu 40 V i 50 milisekundach. Następnie delikatnie przenieś rybę do zbiornika regeneracyjnego. Na koniec, po znieczuleniu ryby zgodnie z protokołem tekstowym, użyj światła UV, aby zobaczyć ekspresję EGFP w pobliżu miejsca wstrzyknięcia.