Przygotowanie tkanki mózgu myszy do immunoelektromikroskopii
20 lipca 2010
Opisujemy protokół perfuzji transkardiakalnej u myszy, usuwania i sekcjonowania mózgu, a także barwienia immunoperoksydazowego, zatapiania w żywicy i przygotowywania ultracienkich przekrojów z sekcji mózgu. Po zakończeniu tych procedur materiał poddany immunobarwieniu jest gotowy do badania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.
Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie tkanki mózgu myszy do immuno-mikroskopii elektronowej. Jest to realizowane poprzez wstępną fiksację mózgu za pomocą perfuzji zwierzęcia. Drugim etapem procedury jest pocięcie mózgu i opracowanie przekrojów do immunohistochemii.
Trzecim etapem procedury jest osuszanie, odwadnianie i zatapianie przekrojów. Ostatnim etapem procedury jest przygotowanie ultracienkich skrawków. W rezultacie można uzyskać wyniki ukazujące z wysoką rozdzielczością przestrzenną rozkład różnych białek w obrębie różnych obszarów i typów komórek ośrodkowego układu nerwowego.
Witajcie, jestem Maria Trombley z Laboratorium Esca w Katedrze Neurobiologii i Anatomii na Uniwersytecie w Rochester. Dzisiaj przedstawimy procedurę przygotowania tkanki mózgu myszy do immuno-elektronowej mikroskopii. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania interakcji między mikroglejem a synapsami podczas rozwoju, plastyczności zależnej od doświadczenia oraz starzenia się.
Zacznijmy zatem. Po utrwaleniu mózgu myszy za pomocą perfuzji wewnątrzsercowej, przeprowadź postfiksację w około 10 mililitrach formaldehydu w temperaturze 4°C przez dwie godziny. Przemyj mózg w temperaturze 4°C w 1X PBS trzykrotnie przez 10 minut podczas każdego płukania, używając wibratora i lodowatego 1X PBS, a następnie niezwłocznie przetnij mózg w poprzeczne sekcje o grubości 50 mikronów.
Za pomocą cienkiego pędzla przenieść wybrane skrawki do fiolki szklanej wypełnionej 4°C XPBS. Pozostałe skrawki przechowywać w krioprotektancie w temperaturze -20°C przez maksymalnie kilka lat bez zmian. W każdej fiolce szklanej procesować maksymalnie 10 swobodnie pływających skrawków do barwienia.
Za pomocą pipety transferowej zastąp roztwór XPBS świeżym 0,1% borowodorkiem sodu w PBS; wymień roztwory szybko, aby zapobiec wyschnięciu skrawków. Inkubuj przez 30 minut, a następnie przepłucz skrawki roztworem XPBS 3 razy po 10 minut każdy. Dbając o usunięcie wszystkich pęcherzyków powietrza, zablokuj skrawki roztworem XPBS zawierającym 0,5% żelatyny i 5% surowicy normalnej odpowiedniej dla przeciwciała wtórnego, które zostanie użyte.
Inkubować przez dwie godziny. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym. Inkubować przez 48 godzin.
Płucz w 1X PBS 3 razy przez 10 minut. Następnie inkubuj przez dwie godziny z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z biotyną, rozcieńczonym w roztworze blokującym. Płucz trzy razy przez 10 minut w 1X PBS w ten sam sposób co wcześniej.
Inkubować ze streptawidyną sprzężoną z peroksydazą chrzanową rozcieńczoną w roztworze blokującym przez jedną godzinę. Przepłukać skrawki jednokrotnie w jednym XPBS i dwukrotnie w jednym XTBS przez 10 minut każdego z etapów. Aby uwidocznić znakowanie, inkubować skrawki ze świeżo przygotowanym roztworem zawierającym 0,05% DAB i 0,01% nadtlenku wodoru w jednym XTBS.
Gdy barwienie stanie się widocznie ciemnobrązowe lub gdy reakcja potrwa pięć minut, należy przepłukać preparaty roztworem XTBS, aby zatrzymać reakcję. Następnie przepłukać raz roztworem XTBS i dwukrotnie roztworem 1x PB przez 10 minut za każdym razem. W dygestorium, używając cienkiego pędzla, przenieść preparaty do wielodołkowej płytki hodowlanej wypełnionej roztworem 1x PB.
Usunąć PB z jednej dołki za pomocą cienkiego pędzla, aby natychmiast rozpłaszczyć przekroje. Przed przejściem do następnej dołki dodać roztwór 1% tetratlenku osmu w jednym x PB, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przenieść przekroje w OSM do szklanych fiolek.
Płukać w roztworze XPB trzykrotnie przez 10 minut. Odwodnić przekroje w roztworach etanolu o rosnącym stężeniu. Następnie zastosować tlenek propylenu zgodnie z opisem w części tekstowej niniejszego protokołu.
Używając cienkiego pędzla wypłukanego w tlenku propylenu, przenieś skrawki do świeżo przygotowanej żywicy dupant. W przypadku impregnacji nocnej umieść szalkę z próbkami w piecu w temperaturze 55 degree Celsius na 10 minut. Aby zmiękczyć żywicę, użyj pędzla wypłukanego w tlenku propylenu, aby pokryć folię do zatapiania chlor cienką warstwą żywicy.
Przenieś przekrój na folię i przykryj go drugą folią do zatapiania. Rozmieść równomiernie na wierzchu obciążniki o masie około 2 g, aby wspomóc rozpływanie się żywicy. Pozostaw żywicę do polimeryzacji w temperaturze 55 °C przez 48 do 72 godzin w inkubatorze. Po polimeryzacji usuń obciążniki z górnej warstwy folii do zatapiania pod mikroskopem binokularnym.
Wybierz obszary zainteresowania o wymiarach dwóch na dwa milimetry i wytnij je z folii za pomocą żyletki. Przyklej obszary zainteresowania do końcówek bloków żywicznych za pomocą kleju typu Super Glue. Utwardzaj w inkubatorze w temperaturze 55 °C przez jedną godzinę.
Używając żyletki, przytnij blok żywiczny do kształtu trapezu równoramiennego, który jest optymalny dla ultra cienkiegoy skrawania metodą ssania. Za pomocą mikrotomu i noża szklanego usuń klej z powierzchni tkanki, aby uzyskać płaską powierzchnię do ssania.
Napełnij rynienkę noża szklanego wodą dwukrotnie destylowaną i wykonaj kilka cięć o grubości od 0.5 do 1 µm. Użyj pętelki PerfectLoop, aby przenieść skrawki na szkiełko SuperFrost. Susz na płycie grzewczej o temperaturze 80 °C przez jedną minutę, a następnie barw 0,1% błękitem toluidyny przez jedną minutę.
Za pomocą butelki z rozpylaczem wypłucz nadmiar barwnika wodą dwukrotnie destylowaną. Pod mikroskopem świetlnym obejrzyj skrawki, aby odróżnić zabarwioną tkankę od żywicy. Wycinaj skrawki półcienkie, aż granica między tkanką a żywicą znajdzie się mniej więcej w połowie grubości skrawka. Zastąp nóż szklany nożem diamentowym i napełnij kuwetę wodą dwukrotnie destylowaną.
Przetnij srebro do uzyskania ultra cienkich przekrojów. Wykonaj sekcje o grubości od 60 do 80 nanometrów. Używając precyzyjnej pęsety odwróconej, ostrożnie zbierz sekcje na miedziane siatki wspierające.
Osusz siatki na papierze filtracyjnym, aby zwiększyć kontrast. Za pomocą precyzyjnej pęsety odwróconej przenieś siatkę do kropli cytrynianu ołowiu na dwie minuty. Delikatnie wypłucz siatkę, zanurzając ją kolejno w trzech kąpielach z wody dwukrotnie destylowanej.
Osusz siatkę na papierze filtracyjnym i przechowuj w pudełku na siatki do późniejszej analizy za pomocą mikroskopu elektronowego. Obejrzyj siatki pod mikroskopem elektronowym, aby zwizualizować immunobarwienie, a także morfologię elementów komórkowych, w tym organelli wewnątrzkomórkowych oraz relacje zachodzące między nimi.
Tutaj przedstawiono reprezentacyjne barwienie immunohistoryczne dla IBA1 w badaniu mikroskopowym w świetle przechodzącym. Rozkład komórkowy IBA1 jest ograniczony do mikrogleju, co potwierdza jego swoistość na poziomie mikroskopii elektronowej. Widoczne są zabarwione immunohistorycznie ciała komórek oraz wypustki mikrogleju IBA1.
Barwienie immunoperoksydazowe DAB przejawia się w postaci gęstego elektronowo osadu. Inne przykłady immunobarwionych wypustek mikrogleju IBA1 wykazują różne rozmiary i kształty. Większe powiększenie ukazuje różnorodne organelle wewnątrzkomórkowe w jednej z wypustek mikrogleju, a także zależności ultrastrukturalne między inną wypustką mikrogleju a pobliskimi elementami neuropilu, w tym synapsami.
Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przygotowania tkanki mózgu myszy do immuno-elektronowej mikroskopii. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby ściśle przestrzegać wszystkich kroków i delikatnie manipulować tkanką mózgu. To wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół opisuje etapy przygotowania tkanki mózgu myszy do immuno-mikroskopii elektronowej. Obejmuje on perfuzję przezsercową, sekcjonowanie mózgu oraz barwienie immunoperoksydazowe.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Histologia
- Immunohistochemia
Wstęp
- Zrozumienie rozmieszczenia białek w ośrodkowym układzie nerwowym jest kluczowe dla badań z zakresu neuronauki.
- Immunomikroskopia elektronowa umożliwia uzyskanie obrazów o wysokiej rozdzielczości przestrzennej.
- Właściwe przygotowanie tkanki mózgowej jest niezbędne dla uzyskania dokładnych wyników.
- Niniejszy protokół został opracowany dla badaczy pracujących na modelach mysich.
Cel badania
- Przygotowanie tkanki mózgu myszy do szczegółowych badań.
- Wizualizacja rozmieszczenia białek w różnych obszarach mózgu.
- Pogłębienie wiedzy na temat struktur komórkowych w ośrodkowym układzie nerwowym.
Zastosowane metody
- Perfuzja przezsercowa w celu utrwalenia mózgu.
- Sekcjonowanie mózgu do immunohistochemii.
- Zatapianie i odwadnianie skrawków mózgu.
- Wycinanie ultra-cienkich skrawków do mikroskopii elektronowej.
Główne wyniki
- Pomyślnie przygotowano tkankę mózgową do immunomikroskopii elektronowej.
- Uzyskano obrazy o wysokiej rozdzielczości ukazujące rozkład białek.
- Wykazano skuteczność opisanego protokołu.
- Przedstawiono wgląd w struktury komórkowe w ośrodkowym układzie nerwowym.
Wnioski
- Protokół jest skuteczny w przygotowaniu tkanki mózgu myszy.
- Immunomikroskopia elektronowa pozwala na szczegółowe określenie lokalizacji białek.
- Metodę tę można zastosować w różnych badaniach z zakresu neuronauk.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy protokół umożliwia obrazowanie lokalizacji białek w tkance mózgu myszy z wysoką rozdzielczością, co wspiera walidację celu i ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie odkrywania leków w neurobiologii. Dzięki połączeniu immunocytochemii z transmisyjną mikroskopią elektronową badacze mogą precyzyjnie oceniać subkomórkowy rozkład celów terapeutycznych, co pozwala na weryfikację hipotez we wczesnej fazie badań oraz priorytetyzację portfela projektów. Metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad angażowaniem celu i modulacją szlaków sygnałowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez wizualizację ekspresji białek w określonych przedziałach neuronalnych i glejowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ultrastrukturalne potwierdzenie swoistości przeciwciał oraz wiązania z celem w zdefiniowanych typach komórek.
- Wartość prognostyczna: Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez rozstrzyganie powiązań z organellami wewnątrzkomórkowymi oraz relacji synaptycznych białek docelowych.
Przesiewy i opracowanie testu
- Gotowość do analizy: Pozwala na przygotowanie zestandaryzowanych, powtarzalnych preparatów tkanek odpowiednich do ilościowego przesiewania immunohistochemicznego.
- Wyniki ilościowe: Umożliwia pomiar gęstości białek oraz lokalizacji ultrastrukturalnej w dendrytach, aksonach i synapsach.
- Ponowne wykorzystanie platformy: Tworzy zwalidowany schemat postępowania do oceny rozkładu celu w różnych obszarach mózgu oraz modelach chorób.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Ułatwia badanie zmian w celach terapeutycznych w modelach neurodegeneracyjnych i neurorozwojowych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy odkrycia molekularne z walidacją ultrastrukturalną w systemach przedklinicznych.
- Decyzje w oparciu o ryzyko: Dostarcza informacji dla kryteriów go/no-go, ujawniając wiązania poza celem lub nieoczekiwaną lokalizację komórkową.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od identyfikacji celu po walidację przedkliniczną, umożliwiając iteracyjne ulepszanie kandydatów na terapeutyki w oparciu o dane dotyczące subkomórkowej dystrybucji białek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez ujawnianie ekspresji celu w mikrogleju, astrocytach, neuronach i domenach podkomórkowych.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki immunohistochemiczne do porównywania zaangażowania celu w różnych warunkach.
- Analityka: Zapewnia wysokorozdzielcze odczyty przestrzenne, które pomagają zespołom korelować lokalizację białek z efektami funkcjonalnymi.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z nienaruszoną architekturą tkanki, wspierając dopasowanie biomarkerów i walidację mechanicystyczną.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do charakterystyki celów w OUN w ramach wielu projektów i obszarów terapeutycznych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Pewność prognostyczna w walidacji celów, redukcja niejednoznaczności mechanistycznej oraz wyjaśnienie udziału szlaków sygnałowych.
- Wartość operacyjna: Standaryzacja przygotowania tkanek, powtarzalność pomiędzy sekcjami oraz skalowalność w badaniach przesiewowych wielu celów.
- Wartość strategiczna: Ulepszone decyzje typu go/no-go, efektywność kapitałowa dzięki wczesnemu ograniczaniu ryzyka oraz zredukowane ryzyko biologicznej porażki na późnych etapach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowane wzorce ekspresji subkomórkowej.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej w zakresie perfuzyjnej fiksacji, immunohistochemii oraz technik mikroskopii elektronowej.
- Zależy od dostępu do mikrotomów, ultramikrotomów i transmisyjnych mikroskopów elektronowych.
- Konieczna jest standaryzacja walidacji przeciwciał, warunków blokowania oraz kontroli reakcji DAB pomiędzy zespołami.
- Wymaga rozważenia adaptacji metod w zależności od różnych regionów mózgu, etapów rozwoju i modeli chorobowych.
- Ograniczona przez dostępność tkanek, artefakty fiksacyjne oraz konieczność niezwykle starannego obchodzenia się z próbkami w celu zachowania ultrastruktury.
