Przygotowanie tkanki mózgu myszy do immunoelektromikroskopii

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie tkanki mózgu myszy do immunomikroskopii elektronowej. Jest to realizowane poprzez wstępną fiksację mózgu za pomocą perfuzji zwierzęcia. Drugim krokiem procedury jest przecięcie mózgu i przetworzenie otrzymanych przekrojów do analiz immunohistochemicznych.

Trzecim krokiem procedury jest osuszanie, odwadnianie i zatapianie przekrojów. Ostatnim etapem procedury jest wycinanie ultracienkich sekcji. W rezultacie można uzyskać obrazy o wysokiej rozdzielczości przestrzennej, przedstawiające rozkład różnych białek w obrębie różnych obszarów i typów komórek ośrodkowego układu nerwowego.

Witajcie, nazywam się Maria Trombley i reprezentuję Laboratorium Esca w Katedrze Neurobiologii i Anatomii na Uniwersytecie w Rochester. Dzisiaj zaprezentujemy Państwu procedurę przygotowania tkanki mózgowej myszy do immuno-mikroskopii elektronowej. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania interakcji między mikroglejem a synapsami podczas rozwoju, plastyczności zależnej od doświadczenia oraz w procesie starzenia.

Przejdźmy do części praktycznej. Po utrwaleniu mózgu myszy poprzez perfuzję wewnątrzsercową, poddaj go postfiksacji w około 10 mililitrach formaldehydu w temperaturze 4°C przez dwie godziny. Przepłucz mózg w temperaturze 4°C w 1x PBS trzykrotnie po 10 minut każdego płukania, używając wibratora i lodowatego 1x PBS, a następnie niezwłocznie przetnij mózg w poprzecznych sekcjach o grubości 50 mikronów.

Za pomocą cienkiego pędzla przenieś wybrane przekroje do fiolki szklanej wypełnionej 1x PBS w temperaturze 4°C. Pozostałe przekroje przechowuj w krioprotektancie w temperaturze -20°C przez maksymalnie kilka lat bez zmian. W każdej fiolce szklanej przetwarzaj do 10 swobodnie pływających przekrojów do barwienia.

Za pomocą pipety transferowej zastąp roztwór 1X PBS świeżym 0,1% borowodorkiem sodu w PBS; wymień roztwory szybko, aby zapobiec wyschnięciu skrawków. Inkubuj przez 30 minut, a następnie przemyj skrawki roztworem 1X PBS trzy razy po 10 minut każdorazowo. Uważając, aby usunąć wszystkie pęcherzyki powietrza, zablokuj niespecyficzne wiązania, stosując 1X PBS zawierający 0,5% żelatyny i 5% surowicy normalnej odpowiedniej dla przeciwciała wtórnego, które zostanie użyte.

Inkubować przez dwie godziny. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym. Inkubować przez 48 godzin.

Płukać 1x PBS trzy razy przez 10 minut. Następnie inkubować z wtórnym przeciwciałem sprzężonym z biotyną, rozcieńczonym w roztworze blokującym, przez dwie godziny. Płukać trzy razy przez 10 minut w 1x PBS, analogicznie jak wcześniej.

Inkubować ze streptawidyną z peroksydazą chrzanową rozcieńczoną w roztworze blokującym przez jedną godzinę. Przepłukać przekroje jednokrotnie w jednym XPBS i dwukrotnie w jednym XTBS przez 10 minut każdego płukania. Aby uwidocznić znakowanie, inkubować przekroje ze świeżo przygotowanym roztworem zawierającym 0,05% dab i 0,01% nadtlenku wodoru w jednym XTBS.

Gdy barwienie stanie się widocznie ciemnobrązowe lub reakcja będzie trwała przez pięć minut, należy wypłukać przekroje roztworem XTBS, aby zatrzymać reakcję. Następnie wypłukać raz roztworem XTBS i dwukrotnie roztworem 1x PB, po 10 minut each. W dygestorium, używając cienkiego pędzla, przenieść przekroje do wieloodtworowej płytki hodowlanej wypełnionej roztworem 1XPB.

Usuń PB z jednej dołki, używając pędzelka do natychmiastowego rozpłaszczenia przekrojów. Przed przejściem do następnej dołki dodaj roztwór 1% osmium tetroxide w 1x PB, a następnie inkubuj w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przenieś przekroje OSM do szklanych fiolek.

Płukać jeden raz w XPB przez trzy cykle po 10 minut. Odwodnić przekroje w rosnących stężeniach etanolu. Następnie zastosować tlenek propylenu zgodnie z opisem w części tekstowej niniejszego protokołu.

Za pomocą cienkiego pędzla opłukanego w tlenku propylenu przenieś skrawki do świeżo przygotowanej żywicy dupant. W celu impregnacji przez noc, włóż naczynie zawierające skrawki do pieca w temperaturze 55 stopni Celsjusza na 10 minut. Aby zmiękczyć żywicę, użyj pędzla opłukanego w tlenku propylenu, by pokryć folię do zatapiania chlor cienką warstwą żywicy.

Przenieś przekrój na folię i przykryj go drugą folią do zatapiania. Rozmieść równomiernie na górze obciążniki o masie około 2 g, aby ułatwić rozprowadzenie żywicy. Pozostaw żywicę do polimeryzacji w temperaturze 55 °C przez 48 do 72 godzin w inkubatorze. Po polimeryzacji usuń obciążniki z górnej warstwy folii do zatapiania pod mikroskopem binokularnym.

Wybierz obszary zainteresowania o wymiarach dwa na dwa milimetry i wytnij je z folii za pomocą żyletki. Przyklej wybrane obszary do końców bloków żywicznych za pomocą kleju typu Super Glue. Inkubuj w temperaturze 55 °C przez jedną godzinę.

Za pomocą żyletki przytnąć blok żywicy do kształtu trapezu równoramiennego, który jest optymalny dla ultrascieńkiego przylepiania (suctioning). Używając mikrotomu i noża szklanego, usunąć klej z powierzchni tkanki, aby uzyskać płaską powierzchnię do przylepiania.

Napełnić korytko noża szklanego wodą dwukrotnie destylowaną i wyciąć kilka przekrojów o grubości od 0,5 do 1 µm. Za pomocą pętelki przenieść przekroje na szkiełko Superfrost. Suszyć na płycie grzewczej o temperaturze 80 °C przez jedną minutę, a następnie barwić błękitem toluidynowym w stężeniu 0,1% przez jedną minutę.

Używając butelki z atomizerem, wypłucz nadmiar barwnika wodą dwukrotnie destylowaną. Pod mikroskopem świetlnym zbadaj skrawki, aby odróżnić zabarwioną tkankę od żywicy. Wycinaj skrawki półcienkie, aż granica między tkanką a żywicą znajdzie się mniej więcej w połowie grubości skrawka. Zastąp nóż szklany nożem diamentowym i napełnij korytko wodą dwukrotnie destylowaną.

Przetnij próbkę srebra do uzyskania ultra cienkich plastrów. Wykonaj sekcje o grubości od 60 do 80 nanometrów. Użyj precyzyjnych pincet odwróconych, aby ostrożnie zebrać sekcje na siatkach miedzianych.

Osusz siatki na papierze filtracyjnym w celu poprawy kontrastu. Używając precyzyjnych pincet odwróconych, przenieś siatkę do kropli cytrynianu ołowiu na dwie minuty. Delikatnie opłucz siatkę, zanurzając ją kolejno w trzech kąpielach z podwójnie destylowanej wody.

Osusz siatkę na papierze filtracyjnym, a następnie przechowuj w pudełku na siatki do późniejszego badania pod mikroskopem elektronowym. Badaj siatki pod mikroskopem elektronowym w celu wizualizacji immunobarwienia, a także morfologii elementów komórkowych, organelli wewnątrzkomórkowych oraz ich wzajemnych relacji.

Tutaj przedstawiono reprezentatywne barwienie immunocytochemiczne dla IBA1 na poziomie mikroskopii świetlnej. Rozkład komórkowy IBA1 jest ograniczony do mikrogleju, co potwierdza jego swoistość na poziomie mikroskopii elektronowej. Widoczne są zabarwione immunocytochemicznie perikariony i wypustki mikrogleju IBA1.

Barwienie immunoperoksydazą DAB przejawia się jako elektronowo gęsty osad. Inne przykłady immunobarwionych wypustek mikrogleju IBA1 wykazują różne rozmiary i kształty. Przy większym powiększeniu widoczne są różne organelle wewnątrz jednej z wypustek mikrogleju, a także ultrastrukturalne zależności między inną wypustką mikrogleju a pobliskimi elementami neuropilu, w tym synapsami.

Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przygotowania tkanki mózgowej myszy do immuno-mikroskopii elektronowej. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby rygorystycznie przestrzegać wszystkich kroków i ostrożnie manipulować tkanką mózgową. To wszystko.

Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.