Name: Przygotowanie tkanki mózgowej myszy do mikroskopii immunoelektronowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-20T17:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Poznaj metodę przygotowania tkanki mózgowej myszy do immunoelektronowej mikroskopii. Protokół obejmuje perfuzję przez serce, barwienie immunoperoksydazowe i cięcie ultracienkich sekcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Shao-Ming Lu i Harrisowi A. Gelbardowi za udostępnienie pompy perystaltycznej i wibratomu, a także Karen L. Bentley i Gayle Schneider z Electron Microscope Research Core Facility Uniwersytetu Medycznego w Rochester za pomoc techniczną. Praca ta była finansowana z grantów NIH (EY019277), Whitehall Foundation, Burroughs Wellcome Fund oraz Alfred P. Sloan Foundation przyznanych A.K.M.. M.-È.T. otrzymuje finansowanie w ramach stypendium podoktorskiego z Fonds de la recherche en santé du Québec (FRSQ).

1. Perfuzja zwierząt
<ol>
 <li>Dzień przed perfuzją przygotować: 
 - 2 L buforu fosforanowego (PB; 100 mM, pH 7.4) oraz 1 L soli fizjologicznej buforowanej fosforanem sodu (PBS; 0.9% NaCl w 50 mM PB, pH 7.4) w wodzie dwukrotnie destylowanej. Przechowywać PBS oraz 1 L PB w temperaturze 4°C. Będą one wykorzystane do perfuzji i immunocytochemii przed zatopieniem w medium. 
 - 1 L 4,0% roztworu utrwalającego paraformaldehydu (PFA, pH 7.4), który wystarczy do perfuzji 6 myszy. W tym celu pod dygestorium podgrzać 1 L PB. Odważyć 40 g granularnego paraformaldehydu (PFA) i wsypać do roztworu PB, gdy osiągnie on temperaturę 60°C. Po całkowitym rozpuszczeniu PFA i uzyskaniu klarownego roztworu, schłodzić go do temperatury pokojowej (RT) i przechowywać w 4°C.</li>
 <li>W dniu perfuzji przygotować pod dygestorium 500 mL 3,5% roztworu akroleiny w PB. Następnie przefiltrować roztwory 3,5% akroleiny i 4,0% PFA za pomocą papieru filtracyjnego.</li>
 <li>W celu znieczulenia myszy wstrzyknąć pentobarbital sodu (80 mg/kg) do otrzewnej za pomocą igły 27G o długości ½".</li>
 <li>Podczas perfuzji do krwiobiegu myszy kolejno zostanie wprowadzone 50 mL PBS, 75 mL akroleiny oraz 150 mL PFA. Aby przygotować pompę perystaltyczną, napełnić wężyk PBS i przymocować na jednym jego końcu igłę motylkową 23G o długości ¾". Drugi koniec wężyka zanurzyć w roztworze do perfuzji (PBS, akroleinie lub PFA). Ustawić prędkość pompy perystaltycznej na 20-25 mL/min dla myszy młodocianych i dorosłych. Przez cały czas trwania perfuzji należy uważać, aby w wężyku nie tworzyły się pęcherzyki powietrza.</li>
 <li>Przed przystąpieniem do procedury odczekać, aż znieczulona mysz przestanie reagować na bodźce bólowe, np. uciśnięcie ogona. Położyć zwierzę w kuwecie sekcyjnej i przymocować łapy taśmą. Za pomocą pęsety i nożyczek rozciąć skórę i otworzyć jamę klatki piersiowej, aby odsłonić serce. Aby zminimalizować niedokrwienie mózgu, perfuzję należy rozpocząć szybko. Przeciąć prawy przedsionek małymi nożyczkami i uruchomić pompę perystaltyczną. Trzymając serce pęsetą, wprowadzić igłę motylkową do wierzchołka lewej komory.</li>
 <li>Przy zmianie roztworu zatrzymać pompę perystaltyczną, przenieść wężyk z jednego roztworu do drugiego i natychmiast ponownie uruchomić pompę.</li>
 <li>Po przepłukaniu 150 mL PFA zatrzymać pompę perystaltyczną. Małymi nożyczkami odciąć głowę, rozciąć skórę i przełamać czaszkę między oczami. Za pomocą małej pęsety ostrożnie usuwać fragmenty czaszki, aż do momentu, gdy mózg będzie można łatwo wyciągnąć. Utrawić mózg (post-fixation) przez 2 godziny w temperaturze 4°C w PFA. Przemyć 3 razy po 10 minut w PBS.</li>
 <li>Natychmiast pociąć mózg w przekrojach poprzecznych (skrawki o grubości 50 μm) w schłodzonym w lodzie PBS przy użyciu wibratomu. Za pomocą cienkiego pędzla przenieść skrawki wybrane do immunocytochemii do szklanej fiolki zawierającej PBS. Pozostałe skrawki przechowywać w temperaturze -20°C w krioprotektorze (30% glikolu etylenowego i 30% glicerolu w PBS) przez okres do kilku lat.</li>
</ol>
2. Immunocytochemia przed zatopieniem
<ol>
 <li>W przypadku immunocytochemii preparaty są przetwarzane w formie wolno pływającej w szklanych fiolkach. Przez cały czas trwania procedury należy starannie dbać o to, aby preparaty nie wyschły.</li>
 <li>Najpierw należy usunąć PBS za pomocą pipety transferowej i natychmiast zastąpić go świeżym roztworem 0,1% borowodorku sodu w PBS na 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
 <li>Preparaty należy płukać w PBS 3 razy po 10 minut, usuwając wszystkie pęcherzyki powietrza, a następnie inkubować przez 2 godziny w RT w roztworze blokującym składającym się z PBS zawierającego 0,5% żelatyny i 5% surowicy prawidłowej zwierzęcia, u którego wytworzono przeciwciało wtórne (surowica kozia w niniejszym przykładzie barwienia Iba1).</li>
 <li>Inkubować przez 48 godzin z przeciwciałem pierwszorzędowym w roztworze blokującym. W przypadku barwienia Iba1 należy zastosować królicze przeciwciało anty-Iba1 (1:1000).</li>
 <li>Preparaty należy płukać w PBS 3 razy po 10 minut i inkubować w przeciwciałach wtórnych sprzężonych z biotyną (1:1000) w roztworze blokującym przez 2 godziny w RT. 
 W przypadku barwienia Iba1 należy zastosować kozie przeciwciała anty-królicze IgGs.</li>
 <li>Preparaty należy płukać w PBS 3 razy po 10 minut i inkubować ze streptawidyną-peroksydazą chrzanową (1:1000) w roztworze blokującym przez 1 godzinę w RT.</li>
 <li>Preparaty należy płukać w PBS przez 10 minut oraz w soli buforowanej Tris/HCl (TBS; 50 mM, pH 7,4) 2 razy po 10 minut. Aby uwidocznić znakowanie, należy inkubować preparaty z 0,05% DAB i 0,01% nadtlenkiem wodoru w TBS (roztwór świeżo przygotowany). Gdy barwienie stanie się ciemnobrązowe (patrz przykład na Rysunku 1), należy przerwać reakcję poprzez płukanie w TBS. W każdym przypadku reakcję należy zakończyć po maksymalnie 5 minutach. Preparaty należy płukać w TBS przez 10 minut oraz w PB 2 razy po 10 minut.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do mikroskopii elektronowej
<ol>
 <li>Przenieść skrawki do PB w wielodołkowej płytce hodowlanej za pomocą cienkiego pędzla. Przygotować 1% roztwór tetraoksydy osmu w PB pod dygestorium. Usunąć PB z dołków płytki hodowlanej i rozprostować skrawki cienkim pędzlem. Natychmiast zanurzyć skrawki w 1% tetraoksydzie osmu na 30 minut w RT.</li>
 <li>Przenieść skrawki do szklanych fiolek, wypłukać PB 3 razy po 10 minut, a następnie odwodnić poprzez 2-minutowe zanurzenia w rosnących stężeniach etanolu: 2 razy 35%, po 1 razie 50%, 70%, 80%, 90% i 95%, 3 razy 100%, a następnie 3 razy w tlenku propylenu.</li>
 <li>Aby przygotować żywicę Durcupan, połączyć 20 g komponentu A, 20 g komponentu B, 0,6 g komponentu C i 0,4 g komponentu D w jednorazowym zlewce, dokładnie wymieszać do uzyskania jednolitego koloru i przelać do aluminiowej łódki wagowej. W razie potrzeby można przygotować bloki żywiczne, wlewając żywicę do form do zatapiania i utwardzając w piecu w temperaturze 55°C przez 48-72 godziny.</li>
 <li>Używając cienkiego pędzla wypłukanego w tlenku propylenu, wyjąć skrawki z tlenku propylenu i zanurzyć w żywicy Durcupan w celu impregnacji przez noc w RT.</li>
 <li>Następnego dnia umieścić aluminiową łódkę wagową w piecu w temperaturze 55°C na 10 minut, aby zmiękczyć żywicę. Za pomocą pędzla wypłukanego w tlenku propylenu pokryć folię do zatapiania ACLAR cienką warstwą żywicy, ułożyć skrawki, przykryć drugą folią do zatapiania i równomiernie rozłożyć na wierzchu lekkie obciążniki (około 2 g; np. plastikowe zakrętki od szklanych fiolek), aby pomóc w rozprowadzeniu żywicy. W celu polimeryzacji żywicy inkubować w piecu przez 48-72 godziny (w temperaturze 55°C).</li>
 <li>Po polimeryzacji usunąć lekkie obciążniki i folię do zatapiania znajdującą się nad skrawkami. Pod mikroskopem binokularnym wybrać kwadratowe obszary zainteresowania (około 2x2 mm) i ostrożnie wyciąć je z folii za pomocą żyletki.</li>
 <li>Przykleić obszary zainteresowania do końców bloków żywicznych za pomocą Superglue i utwardzić w piecu w temperaturze 55°C przez 1 godzinę.</li>
 <li>W ramach przygotowania do skrawania, przyciąć blok żywiczny do kształtu trapezu równoramiennego za pomocą żyletki.</li>
 <li>Używając ultramikrotomu i noża szklanego, usunąć klej i żywicę z powierzchni tkanki. Napełnić łódzkę noża szklanego wodą dwukrotnie destylowaną i wykonać kilka skrawków półcienkich (o grubości 0,5-1 μm).</li>
 <li>Przenieść skrawki na szkiełko SuperFrost za pomocą pętelki. Osuszyć skrawki, kładąc szkiełko na płycie grzewczej w temperaturze 80°C przez 1 minutę. Przykryć kilkoma kroplami 0,1% barwnika błękitu toluidyny (2 g boranu sodu i 0,2 g błękitu toluidyny w 200 mL wody dwukrotnie destylowanej) na 1 minutę. Wypłukać nadmiar barwnika wodą dwukrotnie destylowaną. Badanie skrawków pod mikroskopem świetlnym pozwoli odróżnić zabarwioną tkankę od żywicy (Rycina 2).</li>
 <li>Kontynuować skrawanie, aż granica między tkanką a żywicą dotrze do środka skrawków. Należy pamiętać, że poniższa procedura wymaga przeszkolenia. Zastąpić nóż szklany nożem diamentowym i napełnić łódzkę wodą dwukrotnie destylowaną. Wyciąć ultrascienkie skrawki srebrne lub srebrno-złote (o grubości 60-80 nm) i ostrożnie zebrać je na siatkach miedzianych za pomocą cienkich pęset odwróconych. Osuszyć siatki na papierze filtracyjnym.</li>
 <li>Aby zwiększyć kontrast, skrawki ultrascienkie można zabarwić cytrynianem ołowiu (0,03 g cytrynianu ołowiu i 0,1 mL 10N wodorotlenku sodu w 10 mL wody dwukrotnie destylowanej1). Używając cienkich pęset odwróconych, przenieść siatkę do kropli cytrynianu ołowiu na 2 minuty. Wyjąć siatkę i delikatnie wypłukać w 3 kolejnych kąpielach wody dwukrotnie destylowanej. Na koniec osuszyć siatki na papierze filtracyjnym i przechowywać je w pudełku na siatki do czasu badania w mikroskopie elektronowym (Ryciny 3-6).</li>
</ol>
4. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig1.jpg" alt="Barwienie tkanki mózgowej, obraz mikroskopowy, gęstość komórek, histologia, badanie naukowe." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 1"> 
 Rycina 1. Przekrój barwiony przeciwciałami anty-Iba1 w świetle mikroskopu optycznego. Rozkład komórkowy Iba1 ogranicza się do mikrogleju, co wykazuje swoistość immunobarwienia. Pasek skali=100 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig2.jpg" alt="Histologia, barwiony przekrój tkanki, obraz mikroskopowy, granica tkanka-żywica, badanie struktury komórkowej." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 2"> 
 Rysunek 2. Półcienki przekrój barwiony błękitem toluidyny w świetle mikroskopu optycznego. Zwróć uwagę na granicę między tkanką a żywicą, gdzie immunostaining będzie najbardziej intensywny w mikroskopie elektronowym.
<img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig3.jpg" alt="Ultrastruktura komórkowa, obraz z mikroskopu elektronowego, organelle, błona, badanie biologii komórki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 3"> 
 Rycina 3. Ultracienki przekrój przedstawiający perikaryon i wypustki mikrogleju immunopozytywne względem Iba1 na poziomie mikroskopii elektronowej. Elementy strukturalne dodatnie dla Iba1 rozpoznawane są po elektronowo gęstym osadzie immunoperoksydazy-DAB. Pasek skali=2 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig4.jpg" alt="Struktura komórkowa na mikrografii elektronowej; mikroskopia, organelle, szczegółowa anatomia komórki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 4"> 
 Rycina 4. Ultracienki przekrój przedstawiający Iba1-immunopozytywne wypustki mikrogleju o różnych rozmiarach i kształtach na poziomie mikroskopii elektronowej. Pasek skali=2 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig5.jpg" alt="Struktura komórkowa, obraz z mikroskopu elektronowego; wizualizacja organelli; analiza wewnątrzkomórkowa." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rysunek 5"> 
 Rysunek 5. Ultracienki przekrój przedstawiający w większym powiększeniu wypustkę mikrogleju Iba1-dodatnią z Rysunku 4, umożliwiający identyfikację jej organelli wewnątrzkomórkowych. Pasek skali=1 μm.
<img src="/files/ftp_upload/2021/2021fig6.jpg" alt="Struktura komórkowa, mikrograf elektronowy; badanie ultrastruktury, mikroskopia, badania biologii komórki." data-altupdatedat="1788235205000" data-alt="Rycina 6"> 
 Rycina 6. Ultracienki przekrój ukazujący przy większym powiększeniu zależności ultrastrukturalne między wypustką mikrogleju dodatnią pod kątem Iba1 a pobliskimi elementami neuropila, w tym synapsami. Pasek skali=1μm.

<ol><li>Venable, J. H., Coggeshall, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified+lead+citrate+stain+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simplified lead citrate stain for use in electron microscopy.</a> J Cell Biol. 25, 407-407 (1965).</li>
<li>Riad, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatodendritic+localization+of+5-HT1A+and+preterminal+axonal+localization+of+5-HT1B+serotonin+receptors+in+adult+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Somatodendritic localization of 5-HT1A and preterminal axonal localization of 5-HT1B serotonin receptors in adult rat brain.</a> J Comp Neurol. 417 (2), 181-181 (2000).</li>
<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+EphA4+in+axon+terminals+and+dendritic+spines+of+adult+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Localization of EphA4 in axon terminals and dendritic spines of adult rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 501 (5), 691-691 (2007).</li>
<li>Tremblay, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+course+of+EphA4+cellular+and+subcellular+localization+in+the+postnatal+rat+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Developmental course of EphA4 cellular and subcellular localization in the postnatal rat hippocampus.</a> J Comp Neurol. 512 (6), 798-798 (2009).</li>
<li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-synaptic+and+post-synaptic+localization+of+EphA4+and+EphB2+in+adult+mouse+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Pre-synaptic and post-synaptic localization of EphA4 and EphB2 in adult mouse forebrain.</a> J Neurochem. 106 (2), 682-682 (2008).</li>
<li>Bouvier, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EphA4+is+localized+in+clathrin-coated+and+synaptic+vesicles+in+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">EphA4 is localized in clathrin-coated and synaptic vesicles in adult mouse brain.</a> J Neurochem. , (2010).</li>
</ol>

Nie zgłoszono żadnych konfliktów interesów.

W niniejszej pracy opisaliśmy protokół przygotowania tkanki mózgu myszy do immunomikroskopii elektronowej, który przy rygorystycznym przestrzeganiu procedur zapewnia doskonały kompromis pomiędzy optymalną konserwacją ultrastrukturalną a detekcją immunocytochemiczną.
W połączeniu z TEM metoda ta umożliwia rozróżnienie elementów komórkowych o niewielu charakterystycznych cechach i kryteriach identyfikacji. W szczególności barwienie immunoperoksydazowe DAB na Iba1 pozwala na identyfikację ciał k...

<table><tbody><tr><td>Pentobarbital sodu (Nembutal)</td><td>OVATION Pharmaceuticals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Papier filtracyjny 315 24 cm</td><td>VWR international</td><td>28331-081</td><td></td></tr><tr><td>*Akroleina purum (&amp;#8805;95%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>01680</td><td></td></tr><tr><td>Borowodorek sodu (&amp;#8805;98%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452173</td><td></td></tr><tr><td>*Paraformaldehyd w granulkach (PFA) (95%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244</td><td></td></tr><tr><td>Normalne surowica kozia</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>005-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Królicze przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko Iba1</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>019-19741</td><td>Przechowywać w -20&amp;#x00B0;C, 1:1 w glicerolu</td></tr><tr><td>Biotynylowany sprzężony fragment F(ab&amp;rsquo;)2 przeciwciała koziego przeciwko króliczym IgG, specyficzny dla fragmentu Fc</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-066-046</td><td>Przechowywać w -20&amp;#x00B0;C, 1:1 w glicerolu</td></tr><tr><td>Streptawidyna sprzężona z peroksydazą</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>016-030-084</td><td>Przechowywać w -20&amp;#x00B0;C, 1:1 w glicerolu</td></tr><tr><td>*4% roztwór tetratlenku osmu</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>19150</td><td>Wrażliwy na światło</td></tr><tr><td>Tlenek propylenu (&amp;#8805;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>82325</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowe zlewki polipropylenowe (50 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-291-10</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiowe naczynia wagowe (70 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9261784</td><td></td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa Durcupan</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>14040</td><td></td></tr><tr><td>Forma do zatapiania</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70907</td><td></td></tr><tr><td>Medium montażowe DPX do histologii</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>44581</td><td></td></tr><tr><td>Lamelki z podkładem żelatynowym</td><td>VWR international</td><td>100241-864</td><td></td></tr><tr><td>Folie do zatapiania ACLAR (7,8 mm)</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>50425</td><td></td></tr><tr><td>Forma kapsułkowa</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70150</td><td></td></tr><tr><td>Wysokowydajny superklej</td><td>Corporate Express</td><td>LOC30379</td><td></td></tr><tr><td>Perfect loop do ultracienkich przekrojów</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>70944</td><td></td></tr><tr><td>Lamelki Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-178-277</td><td></td></tr><tr><td>Nóż diamentowy ultra 45&amp;#x00B0; (2,5-3,5 mm)</td><td>Diatome</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry ryb zimnowodnych (~45%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;p class=&quot;jove_content">*Podczas pracy z akroleiną, paraformaldehydem i osmem należy zawsze pracować pod dygestorium, stosować rękawice nitrylowe oraz odpowiednio utylizować odpady.&lt;/p&gt;</td></tr></tbody></table>

przygotowanie tkanki mózgu myszy do immunoelektromikroskopii

Preparation of Mouse Brain Tissue for Immunoelectron Microscopy

Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) jest niezwykle użyteczna do wizualizacji z wysoką rozdzielczością przestrzenną przedziałów subkomórkowych mikrogleju, oligodendrocytów, astrocytów i neuronów (dendryty, kolce dendrytyczne, aksony, zakończenia aksonalne, perikaryon) w ośrodkowym układzie nerwowym, a także ich organelli wewnątrzkomórkowych i cytoszkieletu. W połączeniu z TEM, immunocytochemia przedzatapiająca pozwala na rozróżnienie elementów komórkowych o niewielkiej liczbie charakterystycznych cech i kryteriów identyfikacji (np. perikaryonów i wypustek mikrogleju przy użyciu przeciwciała przeciwko specyficznemu dla mikrogleju markerowi Iba1 (ionized calcium binding adaptor molecule 1; przedstawionemu w niniejszej pracy)), identyfikację zawartości neuroprzekaźników w elementach komórkowych (np. serotoninergicznych) oraz określenie ultrastrukturalnej lokalizacji białek rozpuszczalnych lub związanych z błoną (np. receptorów 5 HT1A i EphA4). W niniejszym protokole opisujemy metodę perfuzji przezsercowej myszy utrwalaczem z akroleiną, wycięcia i sekcjonowania mózgu, a także barwienie immunoperoksydazowo-diaminobenzydynowe (DAB), zatapianie w żywicy i przygotowywanie ultrascienkich przekrojów z sekcji mózgu. Po zakończeniu tych procedur materiał poddany immunobarwieniu jest gotowy do badania za pomocą TEM. Przy rygorystycznym przestrzeganiu tej techniki możliwe jest uzyskanie doskonałego kompromisu między optymalną konserwacją ultrastruktury a detekcją immunocytochemiczną.

Opisujemy protokół perfuzji transkardiakalnej u myszy, usuwania i sekcjonowania mózgu, a także barwienia immunoperoksydazowego, zatapiania w żywicy i przygotowywania ultracienkich przekrojów z sekcji mózgu. Po zakończeniu tych procedur materiał poddany immunobarwieniu jest gotowy do badania za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgu myszy do immunoelektromikroskopii

Transmisyjna mikroskopia elektronowa (TEM) jest niezwykle użyteczna w wizualizacji przedziałów subkomórkowych mikrogleju, oligodendrocytów, astrocytów i neuronów...

Ogólnym celem tej procedury jest przygotowanie tkanki mózgu myszy do immuno-mikroskopii elektronowej. Jest to realizowane poprzez wstępną fiksację mózgu za pomocą perfuzji zwierzęcia. Drugim etapem procedury jest pocięcie mózgu i opracowanie przekrojów do immunohistochemii.Trzecim etapem procedury jest osuszanie, odwadnianie i zatapianie przekrojów. Ostatnim etapem procedury jest przygotowanie ultracienkich skrawków. W rezultacie można uzyskać wyniki ukazujące z wysoką rozdzielczością przestrzenną rozkład różnych białek w obrębie różnych obszarów i typów komórek ośrodkowego układu nerwowego.Witajcie, jestem Maria Trombley z Laboratorium Esca w Katedrze Neurobiologii i Anatomii na Uniwersytecie w Rochester. Dzisiaj przedstawimy procedurę przygotowania tkanki mózgu myszy do immuno-elektronowej mikroskopii. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania interakcji między mikroglejem a synapsami podczas rozwoju, plastyczności zależnej od doświadczenia oraz starzenia się.Zacznijmy zatem. Po utrwaleniu mózgu myszy za pomocą perfuzji wewnątrzsercowej, przeprowadź postfiksację w około 10 mililitrach formaldehydu w temperaturze 4°C przez dwie godziny. Przemyj mózg w temperaturze 4°C w 1X PBS trzykrotnie przez 10 minut podczas każdego płukania, używając wibratora i lodowatego 1X PBS, a następnie niezwłocznie przetnij mózg w poprzeczne sekcje o grubości 50 mikronów.Za pomocą cienkiego pędzla przenieść wybrane skrawki do fiolki szklanej wypełnionej 4°C XPBS. Pozostałe skrawki przechowywać w krioprotektancie w temperaturze -20°C przez maksymalnie kilka lat bez zmian. W każdej fiolce szklanej procesować maksymalnie 10 swobodnie pływających skrawków do barwienia.Za pomocą pipety transferowej zastąp roztwór XPBS świeżym 0,1% borowodorkiem sodu w PBS; wymień roztwory szybko, aby zapobiec wyschnięciu skrawków. Inkubuj przez 30 minut, a następnie przepłucz skrawki roztworem XPBS 3 razy po 10 minut każdy. Dbając o usunięcie wszystkich pęcherzyków powietrza, zablokuj skrawki roztworem XPBS zawierającym 0,5% żelatyny i 5% surowicy normalnej odpowiedniej dla przeciwciała wtórnego, które zostanie użyte.Inkubować przez dwie godziny. Dodać przeciwciało pierwszorzędowe rozcieńczone w roztworze blokującym. Inkubować przez 48 godzin.Płucz w 1X PBS 3 razy przez 10 minut. Następnie inkubuj przez dwie godziny z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z biotyną, rozcieńczonym w roztworze blokującym. Płucz trzy razy przez 10 minut w 1X PBS w ten sam sposób co wcześniej.Inkubować ze streptawidyną sprzężoną z peroksydazą chrzanową rozcieńczoną w roztworze blokującym przez jedną godzinę. Przepłukać skrawki jednokrotnie w jednym XPBS i dwukrotnie w jednym XTBS przez 10 minut każdego z etapów. Aby uwidocznić znakowanie, inkubować skrawki ze świeżo przygotowanym roztworem zawierającym 0,05% DAB i 0,01% nadtlenku wodoru w jednym XTBS.Gdy barwienie stanie się widocznie ciemnobrązowe lub gdy reakcja potrwa pięć minut, należy przepłukać preparaty roztworem XTBS, aby zatrzymać reakcję. Następnie przepłukać raz roztworem XTBS i dwukrotnie roztworem 1x PB przez 10 minut za każdym razem. W dygestorium, używając cienkiego pędzla, przenieść preparaty do wielodołkowej płytki hodowlanej wypełnionej roztworem 1x PB.Usunąć PB z jednej dołki za pomocą cienkiego pędzla, aby natychmiast rozpłaszczyć przekroje. Przed przejściem do następnej dołki dodać roztwór 1% tetratlenku osmu w jednym x PB, a następnie inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Przenieść przekroje w OSM do szklanych fiolek.Płukać w roztworze XPB trzykrotnie przez 10 minut. Odwodnić przekroje w roztworach etanolu o rosnącym stężeniu. Następnie zastosować tlenek propylenu zgodnie z opisem w części tekstowej niniejszego protokołu.Używając cienkiego pędzla wypłukanego w tlenku propylenu, przenieś skrawki do świeżo przygotowanej żywicy dupant. W przypadku impregnacji nocnej umieść szalkę z próbkami w piecu w temperaturze 55 degree Celsius na 10 minut. Aby zmiękczyć żywicę, użyj pędzla wypłukanego w tlenku propylenu, aby pokryć folię do zatapiania chlor cienką warstwą żywicy.Przenieś przekrój na folię i przykryj go drugą folią do zatapiania. Rozmieść równomiernie na wierzchu obciążniki o masie około 2 g, aby wspomóc rozpływanie się żywicy. Pozostaw żywicę do polimeryzacji w temperaturze 55 °C przez 48 do 72 godzin w inkubatorze. Po polimeryzacji usuń obciążniki z górnej warstwy folii do zatapiania pod mikroskopem binokularnym.Wybierz obszary zainteresowania o wymiarach dwóch na dwa milimetry i wytnij je z folii za pomocą żyletki. Przyklej obszary zainteresowania do końcówek bloków żywicznych za pomocą kleju typu Super Glue. Utwardzaj w inkubatorze w temperaturze 55 °C przez jedną godzinę.Używając żyletki, przytnij blok żywiczny do kształtu trapezu równoramiennego, który jest optymalny dla ultra cienkiegoy skrawania metodą ssania. Za pomocą mikrotomu i noża szklanego usuń klej z powierzchni tkanki, aby uzyskać płaską powierzchnię do ssania.Napełnij rynienkę noża szklanego wodą dwukrotnie destylowaną i wykonaj kilka cięć o grubości od 0.5 do 1 µm. Użyj pętelki PerfectLoop, aby przenieść skrawki na szkiełko SuperFrost. Susz na płycie grzewczej o temperaturze 80 °C przez jedną minutę, a następnie barw 0,1% błękitem toluidyny przez jedną minutę.Za pomocą butelki z rozpylaczem wypłucz nadmiar barwnika wodą dwukrotnie destylowaną. Pod mikroskopem świetlnym obejrzyj skrawki, aby odróżnić zabarwioną tkankę od żywicy. Wycinaj skrawki półcienkie, aż granica między tkanką a żywicą znajdzie się mniej więcej w połowie grubości skrawka. Zastąp nóż szklany nożem diamentowym i napełnij kuwetę wodą dwukrotnie destylowaną.Przetnij srebro do uzyskania ultra cienkich przekrojów. Wykonaj sekcje o grubości od 60 do 80 nanometrów. Używając precyzyjnej pęsety odwróconej, ostrożnie zbierz sekcje na miedziane siatki wspierające.Osusz siatki na papierze filtracyjnym, aby zwiększyć kontrast. Za pomocą precyzyjnej pęsety odwróconej przenieś siatkę do kropli cytrynianu ołowiu na dwie minuty. Delikatnie wypłucz siatkę, zanurzając ją kolejno w trzech kąpielach z wody dwukrotnie destylowanej.Osusz siatkę na papierze filtracyjnym i przechowuj w pudełku na siatki do późniejszej analizy za pomocą mikroskopu elektronowego. Obejrzyj siatki pod mikroskopem elektronowym, aby zwizualizować immunobarwienie, a także morfologię elementów komórkowych, w tym organelli wewnątrzkomórkowych oraz relacje zachodzące między nimi.Tutaj przedstawiono reprezentacyjne barwienie immunohistoryczne dla IBA1 w badaniu mikroskopowym w świetle przechodzącym. Rozkład komórkowy IBA1 jest ograniczony do mikrogleju, co potwierdza jego swoistość na poziomie mikroskopii elektronowej. Widoczne są zabarwione immunohistorycznie ciała komórek oraz wypustki mikrogleju IBA1.Barwienie immunoperoksydazowe DAB przejawia się w postaci gęstego elektronowo osadu. Inne przykłady immunobarwionych wypustek mikrogleju IBA1 wykazują różne rozmiary i kształty. Większe powiększenie ukazuje różnorodne organelle wewnątrzkomórkowe w jednej z wypustek mikrogleju, a także zależności ultrastrukturalne między inną wypustką mikrogleju a pobliskimi elementami neuropilu, w tym synapsami.Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przygotowania tkanki mózgu myszy do immuno-elektronowej mikroskopii. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby ściśle przestrzegać wszystkich kroków i delikatnie manipulować tkanką mózgu. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.

preparation-of-mouse-brain-tissue-for-immunoelectron-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przygotowanie tkanki mózgu myszy do mikroskopii immunoelektronowej

Ten film pokazuje immunohistochemiczne barwienie włókien cholinergicznych w jądrze podstawnym regionu Meynerta w sekcjach mózgu myszy. Skrawki są blokowane i leczone pierwotną przeciwko acetylotransferazie choliny, a następnie biotynylowanym przeciwciałom drugorzędowym. Dodaje się kompleksy awidyna-biotyna-peroksydaza, które wiążą się z przeciwciałami drugorzędowymi, a następnie z substratem chromogennym. Skrawki są następnie odwadniane i montowane przed wizualizacją pod mikroskopem.

Immunohistochemiczne barwienie włókien nerwowych w jądrze podstawnym Meynera mózgu myszy

Źródło: Kummari, E., et. al., Mikrodysekcja wychwytywania laserowego - demonstracja izolacji pojedynczych neuronów dopaminowych i całego brzusznego obszaru nakrywki., J. Vis. exp. (2015)W tym filmie demonstrujemy protokół immunohistochemiczny dla neuronów dopaminowych w skrawkach tkanki mózgowej do późniejszej mikrodysekcji wychwytu laserowego.

Immunohistochemia wycinków tkanki mózgowej myszy do celowania w neurony dopaminowe

Źródło: Schönherr, S., et. al. Połączono znakowanie immunologiczne replik optogenetycznych i zamrażalniczo-łamliwych w celu zbadania specyficznego dla danych wejściowych rozmieszczenia receptorów glutaminianu w ciele migdałowatym myszy. J. Vis. Exp. (2016)Ten film demonstruje znakowanie immunologiczne pękniętych przez zamrożenie replik tkanki mózgowej myszy do mikroskopii elektronowej. Pęknięte i pokryte repliki są trawione w celu odsłonięcia receptorów. Przeciwciała pierwszorzędowe i...

Znakowanie immunologiczne białek błony neuronalnej w pękniętej przez lód próbce tkanki mózgowej myszy

Źródło: Louth, E. L.,  i inni. Obrazowanie neuronów w grubych odcinkach mózgu metodą Golgiego-Coxa. J. Vis. Exp. (2017)Ten film demonstruje obrazowanie neuronów w grubym fragmencie mózgu zabarwionym metodą Golgiego-Coxa, ustawiając górną i dolną granicę ostrości oraz rejestrując nakładające się obrazy. Obrazowanych jest wiele lokalizacji, aby zapewnić szczegółowe projekcje neuronów, które są łączone w celu stworzenia reprezentacji 3D.

Obrazowanie mikroskopowe neuronów w wycinku mózgu myszy przy użyciu metalicznego barwienia metodą Golgiego-Coxa

W tym artykule opisujemy pełną procedurę eksperymentalną mającą na celu zrekonstrukcję, z wysoką rozdzielczością, anatomii mózgu fluorescencyjnie znakowanych myszy. Opisany protokół obejmuje przygotowanie i oczyszczanie próbki, montaż próbki do obrazowania, przetwarzanie końcowe danych oraz wizualizację wieloskalową.

Tomografia optyczna całych mózgów myszy z rozdzielczością mikronową z konfokalną mikroskopią arkuszową światła

Tutaj oferujemy łatwy, tani i efektywny czasowo protokół chemicznego utrwalania tkanki mózgowej naczelnych za pomocą utrwalacza akroleiny, co pozwala na długoterminową konserwację, która jest zgodna z immunohistochemią dla transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Przygotowanie tkanki mózgowej naczelnych innych niż ludzie do wstępnego zatopienia immunohistochemii i mikroskopii elektronowej

Tutaj opisujemy ilościowe podejście do określania rozkładu białka synaptycznego względem białka markerowego za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego, mikroskopii konfokalnej i analizy komputerowej.

Kwantyfikacja niejednorodnego rozmieszczenia białka synaptycznego w mózgu myszy za pomocą immunofluorescencji

Ten raport opisuje kompleksowe metody przygotowania zamrożonych wycinków siatkówki myszy do immunohistochemii (IHC).  Opisane metody obejmują rozwarstwienie tylnej części gałki ocznej, utrwalanie paraformaldehydu, osadzanie w pożywkach o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) i orientację tkanki, cięcie i barwienie immunologiczne.

Przygotowanie kriosekcji siatkówki myszy do immunohistochemii

Ten protokół opisuje metodę łączenia fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) i immunohistochemii fluorescencji (IHC) zarówno w świeżo mrożonych, jak i stałych sekcjach mózgu myszy, w celu uzyskania wieloznakowego sygnału FISH i fluorescencji IHC. IHC celował w białka cytoplazmatyczne i przyłączone do błony.

Połączenie hybrydyzacji fluorescencji in situ multipleksowej z immunohistochemią fluorescencyjną na świeżo zamrożonych lub utrwalonych wycinkach mózgu myszy

Ten protokół opisuje skuteczne i powtarzalne podejście do badań histologicznych mózgu myszy, w tym perfuzję, sekcję mózgu, swobodne barwienie immunologiczne, montowanie tkanek i obrazowanie.

Swobodne barwienie immunologiczne mózgów myszy

Możliwość trwałego oznaczania komórek macierzystych i ich potomstwa za pomocą fluoroforu za pomocą indukowalnej linii myszy śledzącej transgeniczną linię genealogiczną pozwala na przestrzenną i czasową analizę aktywacji, proliferacji, migracji i/lub różnicowania in vivo. Śledzenie linii może ujawnić nowe informacje na temat zaangażowania w linię, odpowiedzi na interwencję (interwencje) i multipotencji.

Śledzenie linii indukowalnych fluorescencyjnie znakowanych komórek macierzystych w mózgu dorosłej myszy

Poznaj metodę przygotowania tkanki mózgowej myszy do immunoelektronowej mikroskopii. Protokół obejmuje perfuzję przez serce, barwienie immunoperoksydazowe i cięcie ultracienkich sekcji.

Przygotowanie tkanki mózgu myszy do immunoelektromikroskopii

Przeglądaj więcej filmów