JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:19 min • April 30th, 2023
Lentiwirus jest retrowirusem, który zawiera materiał genetyczny RNA. Wirus ten zapewnia skuteczną i stabilną metodę wprowadzania transgenów do linii komórek nowotworowych. Zacznij od dodania neuraminidazy do probówki zawierającej lentiwirusa, który wyraża zielone białko fluorescencyjne lub GFP. Trzymaj probówkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby zwiększyć skuteczność wiązania wirusa.
Następnie odwirować probówkę zawierającą zawiesinę komórek nowotworowych, aby utworzyć osad. Dodaj pożywkę mammosfery zawierającą polibren, aby ponownie zawiesić komórki. Polybrene to polimer kationowy, który zwiększa skuteczność infekcji lentiwirusowych. Teraz umieść optymalną liczbę komórek nowotworowych na studzience na sześciodołkowej płytce do hodowli tkankowej. Dodaj wymaganą ilość lentiwirusa do każdej studzienki płytki hodowlanej.
Zakręć płytką, aby wymieszać zawartość i utrzymuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 96 godzin przy ciągłym dopływie dwutlenku węgla. Lentiwirus wnika do komórki i uwalnia RNA. Odwrotna transkryptaza wirusa przekształca RNA w dwuniciowy DNA, który integruje się z genomem gospodarza. Umieść płytkę pod mikroskopem fluorescencyjnym i monitoruj komórki pod kątem udanej transdukcji. Transdukowane komórki fluoryzują z powodu ekspresji GFP.
W przykładowym protokole przeprowadzimy transdukcję komórek nowotworowych zdysocjowanych PDX za pomocą wektorów lentiwirusowych.
Aby transdukować komórki nowotworowe, odwiruj izolowane komórki do ponownego zawieszenia w dwóch mililitrach pożywki mammosfery. Po zliczeniu ponownie odwirować komórki i ponownie zawiesić osad w dwóch mililitrach pożywki mammosfery, uzupełnionej 20 mikrolitrami polibrenu. Następnie płytka 2 razy 10 do piątej żywotnej komórki nowotworowej na studzienkę w bardzo niskiej przylegającej sześciodołkowej płytce do hodowli tkankowej i cząstkach lentiwirusowych do komórek przy wielokrotności infekcji 10.
Zakręć płytką, aby wymieszać wirusa z komórkami i inkubować kokultury w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez maksymalnie 96 godzin, dodając 500 mikrolitrów świeżej pożywki mammosfery po pierwszych 24 godzinach. Gdy co najmniej 10% komórek jest dodatnich pod względem GFP, przenieś transdukowane komórki z co najmniej jednej studzienki do 15-mililitrowej stożkowej rurki na lodzie i umyj studzienkę jednym mililitrem pożywki mammosferowej.
Połącz płuczkę z komórkami i odwiruj komórki nowotworowe w 10 mililitrach HBSS plus HEPES. Na koniec ponownie zawieś komórki w 50 mikrolitrach ekstraktu z macierzy podstawnej na lodzie i załaduj osadzone komórki do 0,5 mililitrowej strzykawki insulinowej w celu reimplantacji.