Pożywka kondycjonowana narządowo: Generowanie pożywki z pobranych komórek narządów do badań nad rakiem z przerzutami

Niektóre narządy wytwarzają czynniki rozpuszczalne i stają się preferencyjnymi miejscami dla przerzutów raka piersi. Kondycjonowane podłoże przygotowane z tych pobranych komórek narządów może pomóc w identyfikacji i badaniu takich czynników.

Zacznij od umieszczenia pobranego narządu, takiego jak wątroba, w probówce zawierającej zimny PBS i obracania rurki w górę iw dół, aby usunąć resztki krwi z narządu. Umieść narząd na szalce Petriego. I za pomocą skalpela pokrój narząd w kostkę na małe kawałki.

Ponownie zawiesić te kawałki w probówce zawierającej podłoże podstawowe uzupełnione antybiotykiem w celu wsparcia wzrostu komórek i zapobieżenia zanieczyszczeniu. Teraz wlej zawiesinę komórkową do płytki hodowlanej i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza z ciągłym dopływem dwutlenku węgla przez wymagany czas.

Podczas inkubacji komórki te uwalniają metabolity, czynniki wzrostu, białka macierzy zewnątrzkomórkowej do pożywki. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówki wirówkowej i dodaj świeżą pożywkę, aby ją rozcieńczyć. Odwirować probówkę i przefiltrować supernatant, który jest kondycjonowanym podłożem, do świeżej probówki.

W poniższym protokole przygotujemy kondycjonowane pożywki z płuc i mózgu myszy w celu zbadania przerzutowego zachowania komórek raka piersi.

Aby wytworzyć pożywkę kondycjonowaną w płucach, należy trzykrotnie odwrócić rurki tkanki płucnej, aby usunąć resztki krwi z narządów. Następnie zastąp pranie świeżym, zimnym PBS i powtarzaj, aż sól fizjologiczna będzie wolna od krwi.

Następnie przenieś płuca do jednej szklanej szalki Petriego o powierzchni 60 milimetrów kwadratowych na mysz i użyj dwóch sterylnych ostrzy skalpela, aby zmielić tkanki z wielokrotnym krojeniem tam iz powrotem.

Gdy fragmenty tkanek osiągną wielkość około 1 milimetra sześciennego, ponownie zawiesić kawałki w odpowiedniej objętości pożywki DMEM/F-12 uzupełnionej antybiotykami i inkubować tkanki w jednym dołku 6-dołkowej płytki na mysz w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2.

Po 24 godzinach przenieść całą zawartość każdej studzienki do pojedynczych 50-mililitrowych stożkowych probówek i rozcieńczyć kondycjonowaną pożywkę trzema równoważnymi objętościami świeżej pożywki DMEM/F-12 na probówkę.

Odwirować probówki, aby usunąć wszelkie duże kawałki tkanki. Następnie przełóż kondycjonowane podłoże przez sitko strzykawkowe o średnicy 0,22 mikrona w pojedynczą stożkową probówkę o pojemności 50 mililitrów.