Test tworzenia kolonii miękkiego agaru: metoda testowania wpływu nowych związków na proliferację komórek rakowych

Na początek weź odpowiednie stężenie stopionej agarozy do stożkowej probówki i dodaj do niej pożądaną ilość ciepłej pożywki hodowlanej. Delikatnie odwróć, aby wymieszać zawartość. Dodaj tę mieszaninę do każdego dołka sześciodołkowej płytki i pozwól jej zestalić się. To jest dolna warstwa. Następnie potraktuj komórki rakowe interesującym Cię związkiem i dodaj wymagane stężenie agarozy.

Teraz wlej tę mieszaninę zawierającą żądaną liczbę komórek na mililitr do każdej studzienki. Jest to warstwa zawierająca komórkę. Gdy podłoże zastygnie, inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez tydzień. Przygotuj warstwę zasilającą, mieszając agarozę z pożywką i uzupełnij tę mieszaninę interesującym Cię związkiem. Delikatnie dodaj tę warstwę podajnika do każdej studzienki, pozwól jej zestalić się i inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Powtarzaj tę procedurę karmienia co tydzień, aby uzupełnić komórki pożywką, aż utworzą się kolonie. Jeśli interesujący nas związek jest inhibitorem rakotwórczości, zahamuje wzrost komórek, co spowoduje powstanie kilku kolonii w studzienkach. W poniższym protokole przeprowadzimy test tworzenia miękkiego kolonii agaru w celu zbadania wpływu inhibitorów PADI na rakotwórczość komórek raka piersi.

Rozpocznij tę procedurę od przygotowania 3% 2-hydroksyetyloagarozy. Do czystej, suchej szklanej butelki o pojemności 100 mililitrów dodaj 0,9 grama agarozy 2-hydroksyetylu, a następnie 30 mililitrów wody destylowanej. Podgrzej mieszaninę w kuchence mikrofalowej przez 15 sekund i delikatnie zamieszaj. Powtarzaj ten krok, aż proszek agarozy całkowicie się rozpuści. Następnie należy sterylizować butelkę z roztworem w autoklawie przez 15 minut.

Przed dalszym użyciem pozostawić roztwór agarozy do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Podgrzej kilka pipet o pojemności pięciu mililitrów i 10 mililitrów w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aby zapobiec zastyganiu agarozy w pipecie podczas obsługi. Częściowo poluzuj pokrywkę butelki i podgrzewaj w kuchence mikrofalowej gotowy 3% roztwór 2-hydroksyetyloagarozy przez 15 sekund. Następnie delikatnie zamieszaj roztwór i wstaw do kuchenki mikrofalowej przez kolejne 15 sekund.

Zachowaj ostrożność podczas wirowania roztworu agarozy, ponieważ roztwór unosi się pod wpływem powietrza i może się rozlać. Jeśli w butelce znajdują się resztki stałego żelu, podgrzewaj w kuchence mikrofalowej jeszcze przez kilka sekund. Trzymaj butelkę zawierającą roztwór agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 45 stopni Celsjusza podczas kolejnych kroków, aby zapobiec przedwczesnemu zestaleniu się roztworu agarozy.

Następnie przenieś 12 mililitrów podgrzanego podłoża za pomocą wstępnie podgrzanych pipet do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Natychmiast dodaj trzy mililitry 3% roztworu agarozy i delikatnie odwróć stożkową rurkę, aby wymieszać agarozę z pożywką. Następnie delikatnie dodaj dwa mililitry tej mieszaniny do każdej studzienki sześciodołkowej płytki hodowlanej, nie tworząc żadnych pęcherzyków powietrza. Inkubować sześciodołkową płytkę hodowlaną poziomo na płaskiej powierzchni w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną godzinę, aby mieszanina mogła się zestalić.

Po zestaleniu się mieszaniny umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut. Dolna warstwa jest teraz gotowa do użycia.

Trudnym aspektem tej procedury jest upewnienie się, że wszystkie komórki są rozmieszczone równomiernie i że stopiony żel agarozowy nie zestala się przed dodaniem do każdej studzienki, aby upewnić się, że komórki są mieszane w pożywce przed dodaniem płynnego żelu agarozowego. Dodatkowo pipety są wcześniej wstępnie podgrzewane, aby zapobiec zastyganiu roztworów podczas obsługi.

Aby przygotować warstwę zawierającą komórkę, najpierw trypsynizuj MCF10DCIS komórki i rozcieńcz je do stężenia komórek 40 000 komórek na mililitr. Następnie weź osiem mililitrów pożywki za pomocą wstępnie podgrzanych pipet i przenieś do sterylnej stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów. Natychmiast dodaj dwa mililitry 3% agarozy do stożkowej probówki i delikatnie odwróć, aby wymieszać agarozę z pożywką. Unikaj tworzenia się pęcherzyków.

Następnie weź dwa mililitry komórek i potraktuj je dwoma mikromolowymi BB-chloramidyną w DMSO lub samym DMSO jako kontrolą. Po poddaniu działaniu substancji należy wymieszać komórki z 0,6% agarozą w rozcieńczeniu jeden do jednego, aby uzyskać końcowe stężenie jednego mikromolowego BB-chlor-amidyny. Następnie weź jeden mililitr mieszaniny komórkowo-agarozowej i delikatnie dodaj do dolnej warstwy sześciodołkowej płytki hodowlanej.

Umieść sześciodołkową płytkę hodowlaną poziomo na płaskiej powierzchni w temperaturze czterech stopni Celsjusza na co najmniej 15 minut, aby umożliwić zestalenie się wierzchniej warstwy. Po zestaleniu się mieszaniny umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na tydzień przed dodaniem warstwy zasilającej. Rozpocznij przygotowanie warstwy karmienia od podgrzewania w kuchence mikrofalowej gotowego 3% roztworu 2-hydroksyetyloagarozy, jak poprzednio, i wyrównania butelki z roztworem agarozy w łaźni wodnej o temperaturze 45 stopni Celsjusza.

Wymieszaj jeden mililitr 3% roztworu agarozy z dziewięcioma mililitrami ciepłej pożywki w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów i delikatnie odwróć, aby wymieszać agarozę z pożywką. Unikaj tworzenia się pęcherzyków powietrza. Po potraktowaniu mieszaniny BB-chlor-amidyną, delikatnie dodać jeden mililitr mieszaniny do każdego dołka sześciodołkowej płytki hodowlanej zawierającej dolną i miękką warstwę. Następnie umieść sześciodołkową płytkę hodowlaną poziomo na płaskiej powierzchni w temperaturze czterech stopni Celsjusza na co najmniej 15 minut, aby mieszanina mogła się zestalić.

Po zestaleniu się warstwy podajnika umieść płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Powtarzaj tę procedurę karmienia co tydzień, nakładając jeden mililitr 0,3% roztworu do leczenia pożywką agarozową na istniejącą warstwę zasilającą, aby uzupełnić komórki nową pożywką, aż do zaobserwowania tworzenia kolonii.