Decellularyzacja poduszek tłuszczowych sutka: wyprowadzanie hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej z poduszek tłuszczowych sutka
JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 6:41 min • April 30th, 2023
Loading...
Przegląd
Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje protokół decelularyzacji poduszek tłuszczowych gruczołów mlekowych myszy (MFPs), mający na celu zachowanie macierzy zewnątrzkomórkowej przy jednoczesnym usunięciu komponentów komórkowych. Proces obejmuje wielokrotne etapy płukania i lizy z wykorzystaniem różnych odczynników, aby zapewnić skuteczną decelularyzację.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Inżynieria tkankowa
- Medycyna regeneracyjna
Wstęp
- Decelularyzacja jest kluczowa dla tworzenia rusztowań do inżynierii tkankowej.
- MFP są cenne w badaniu biologii gruczołu piersiowego i opracowywaniu biomateriałów.
- Zachowanie struktury macierzy zewnątrzkomórkowej jest niezbędne dla przyszłej repopulacji komórkowej.
- Do lizy komórek przy jednoczesnym zachowaniu integralności macierzy stosuje się różne odczynniki chemiczne.
Cel badania
- Opracowanie niezawodnej metody decelularyzacji mysich MFP.
- Ocena skuteczności różnych odczynników w zachowaniu macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Dostarczenie szczegółowego protokołu dla badaczy zajmujących się inżynierią tkankową.
Zastosowane metody
- Inkubacja MFPs w roztworze trypsyny z EDTA.
- Zastosowanie Triton X-100 i kwasu deoksycholowego do lizy komórek.
- Etapy płukania wodą dejonizowaną oraz PBS w celu usunięcia szczątków komórkowych.
- Przechowywanie zdecelularyzowanych tkanek w temperaturze -80 °C do przyszłego wykorzystania.
Główne wyniki
- Skuteczne usunięcie składników komórkowych przy jednoczesnym zachowaniu macierzy zewnątrzkomórkowej.
- Protokół wykazał powtarzalność i skuteczność w wielu próbach.
- Decelularyzowane MFPs zachowały integralność strukturalną odpowiednią do dalszych zastosowań.
Wnioski
- Opisany protokół zapewnia kompleksowe podejście do decelularyzacji MFP.
- W przyszłych badaniach te decelularyzowane macierze mogą zostać wykorzystane w różnych zastosowaniach w inżynierii tkankowej.
- Metodę tę można dostosować do innych tkanek wymagających podobnych procesów decelularyzacji.
Najczęściej zadawane pytania
Czym jest decelularyzacja?
Decelularyzacja to proces usuwania komponentów komórkowych z tkanek przy jednoczesnym zachowaniu macierzy pozakomórkowej.
Dlaczego macierz pozakomórkowa jest ważna?
Macierz pozakomórkowa zapewnia wsparcie strukturalne i sygnały biochemiczne niezbędne do funkcjonowania komórek i regeneracji tkanek.
Jakich odczynników używa się w procesie decelularyzacji?
Do powszechnie stosowanych odczynników należą Trypsyna-EDTA, Triton X-100, kwas deoksycholowy oraz kwas nadoctowy.
W jaki sposób przechowywane są odkomórkowane tkanki?
Tkanki zdecelularyzowane przechowuje się zazwyczaj w temperaturze -80 °C, aby zachować ich integralność.
Czy ten protokół można zastosować do innych tkanek?
Tak, protokół ten można dostosować do decelularyzacji różnych typów tkanek.
Znaczenie dla przemysłu
Hydrożele zydecelularyzowanej tkanki tłuszczowej piersi stanowią powtarzalny model in vitro do badania mikrośrodowiska tkanki piersi po napromieniowaniu, wspierając mechanistyczną redukcję ryzyka w procesie walidacji celów onkologicznych. Podejście to umożliwia zwiększenie pewności prognostycznej w zakresie oddziaływań między guzami a zrębem poprzez zachowanie natywnej architektury macierzy zewnątrzkomórkowej po irradiacji. Metoda ta jest zgodna z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, które wymagają systemów istotnych z punktu widzenia choroby do screeningu fenotypowego i identyfikacji związków wiodących.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie zachowania komórek nowotworowych w kontekście zmejdyfikowanego promieniowaniem zrębu w celu wyjaśnienia mechanizmów patogennych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowany hydrożel macierzy zewnątrzkomórkowej do spójnych analiz angażowania celu.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Wspiera przygotowanie zwalidowanych macierzy biologicznych do późniejszego przesiewania związków w modelach tkanek napromienionych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność testów dzięki protokołom decelularyzacji, które zachowują kluczowe sygnały stromaalne.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Ułatwia przejście od etapu odkrycia do walidacji przedklinicznej poprzez modelowanie reakcji tkanki piersi człowieka na promieniowanie.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem analizy ryzyka dzięki zastosowaniu hydrożeli, które odtwarzają sztywność i skład tkanki po leczeniu.
Integracja potoków i przepływów pracy
Proces decelularyzacji pozwala na wykorzystanie hydrożeli pochodzących z tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego jako systemu istotnego w kontekście chorobowym, łączącego walidację celów z przedklinicznym badaniem skuteczności w onkologii.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących oddziaływań między zrąb a guzem po ekspozycji na promieniowanie poprzez zachowanie biofizyki macierzy.
- Przesiewanie: Dostarcza standaryzowane hydrożele umożliwiające ilościowy odczyt inwazji, proliferacji i sygnalizacji komórek nowotworowych w napromieniowanych mikrośrodowiskach.
- Analityka: Generuje mierzalne parametry macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak retencja kolagenu i zawartość glikozaminoglikanów, w celu porównania warunków terapeutycznych.
- Badania translacyjne: Modeluje indukowane promieniowaniem zmiany w zrąbie, istotne dla odpowiedzi na radioterapię oraz mechanizmów oporności.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do oceny modyfikatorów zrębu, radioczułników oraz terapii celowanych w mikrośrodowisko w różnych projektach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w systemach kokultury guza i zrębu.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność modeli tkanek napromieniowanych w badaniach wysokoprzepustowych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez wczesną identyfikację związków modulujących fenotypy zrębu zmienione przez promieniowanie.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów onkologicznych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o zaangażowanie zrębu w kontekście popromiennym.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie manipulacji tkankami, chemii decelularyzacji oraz charakteryzacji macierzy pozakomórkowej.
- Zależy od dostępu do wirówki, filtracji sterylnej oraz przechowywania w niskiej temperaturze (-80°C) w celu konserwacji hydrożelu.
- Wymaga standaryzacji dawek napromieniowania i źródeł tkanek w celu zapewnienia spójności między partiami.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania protokołu przy zastosowaniu ludzkich lub alternatywnych mysich źródeł tkanki tłuszczowej.
- Obejmuje ograniczenia praktyczne, takie jak wydajność usuwania resztkowego DNA oraz potencjalna utrata związanych z macierzą czynników wzrostu podczas przedłużonego płukania.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Dlaczego decelularyzacja jest istotna dla walidacji celu w modelach tkanek napromieniowanych?
Decelularyzacja usuwa komponenty komórkowe przy jednoczesnym zachowaniu macierzy pozakomórkowej, co pozwala badaczom na wyizolowanie wpływu zrostu na zachowanie guza po napromieniowaniu. Wspiera to walidację celu poprzez wyjaśnienie, czy obserwowane efekty wynikają z sygnalizacji zrostu, a nie z pozostałych artefaktów komórkowych. Metoda ta zwiększa pewność co do mechanizmów działania celu, zapewniając zdefiniowane, wolne od komórek mikrośrodowisko.
W jaki sposób wyizolowanie macierzy zewnątkomórkowej jako niezależnej zmiennej wpisuje się w proces odkrywania leków onkologicznych?
Poprzez decelularyzację poduszek tłuszczowych gruczołu piersiowego, macierz zewnątrzkomórkowa staje się regulowaną zmienną niezależną, co pozwala badać jej wpływ na fenotypy komórek nowotworowych. Umożliwia to zespołom badawczym ocenę, w jaki sposób stroma zmieniona przez promieniowanie moduluje odpowiedź na leki, bez zakłóceń wynikających ze zmienności komórkowej. Izolacja tej zmiennej sprzyja wczesnym etapom odkryć, umożliwiając mechanistyczną minimalizację ryzyka podejść ukierunkowanych na stromę przed zastosowaniem złożonych modeli kokultur.
Jakie ilościowe pomiary zmiennych zależnych umożliwiają ocenę oddziaływań między guzami a zrębem w decelularyzowanych hydrożelach?
Pomiary ilościowe, takie jak głębokość inwazji komórek nowotworowych, tempo proliferacji i sygnalizacja fosforylacyjna, służą jako zmienne zależne do oceny wpływu zrębu. Odczyty te są możliwe dzięki standaryzowanej platformie hydrożelowej, która zapewnia stały skład i sztywność macierzy zewnątrzkomórkowej. Śledzenie tych zmiennych w różnych warunkach pomaga zidentyfikować związki, które zaburzają pronowotworową sygnalizację zrębu.
Dlaczego wymagania dotyczące powtarzalności są istotne dla współpracy międzyfunkcyjnej w badaniach nad hydrożelami macierzy zewnątrzkomórkowej?
Replikacja zapewnia, że decelularyzowane hydrożele zachowują spójne właściwości biochemiczne i biofizyczne pomiędzy partiami, co jest niezbędne dla niezawodnej wymiany danych między zespołami zajmującymi się biologią, chemią i farmakologią. Standaryzacja etapów płukania, lizy i sterylizacji zmniejsza zmienność zawartości kolagenu oraz stopień zachowania glikozaminoglikanów. Taka powtarzalność umożliwia pewne przekazywanie wyników między grupami zajmującymi się odkrywaniem leków a grupami przedklinicznymi oceniającymi kandydaty celowane w stroma.
Jakie możliwości analizy statystycznej są wymagane przed wdrożeniem hydrożeli z decelularyzowanej tkanki tłuszczowej piersi w procesach przesiewowych?
Zespoły wymagają możliwości przeprowadzenia porównawczych analiz statystycznych (np. testów t, ANOVA) dla punktów końcowych ilościowych, takich jak migracja komórek nowotworowych lub intensywność sygnalizacji, w różnych warunkach hydrożelowych. Umożliwia to obiektywną ocenę, czy zmienione promieniowaniem podścielisko istotnie moduluje zachowanie guza lub odpowiedź na lek. Taka analiza jest kluczowa dla podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w oparciu o stopień zaangażowania celu w podścielisku oraz dane dotyczące mechanistycznego ograniczania ryzyka.
08:16
Rusztowania serca noworodków: nowe matryce do badań regeneracyjnych
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
09:53
Protokół decelularyzacji ślimaków myszy w inżynierii tkankowej ucha wewnętrznego
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
08:02
Wytwarzanie bezkomórkowych rusztowań matrycowych pochodzących z chrząstki
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
08:49
Inżynieria trójwymiarowych tkanek nabłonkowych osadzonych w macierzy zewnątrzkomórkowej
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
11:19
Wytwarzanie pianek i mikronośników pochodzących z macierzy zewnątrzkomórkowej jako specyficznych tkankowo platform do hodowli i dostarczania komórek
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
09:59
Przenoszenie zdolności tworzenia gruczołu sutkowego między komórkami podstawnego nabłonka sutka a komórkami luminalnymi sutka za pośrednictwem pęcherzyków zewnątrzkomórkowych/egzosomów
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
08:41
Przetwarzanie ludzkiej tkanki serca w kierunku samoorganizującego się hydrożelu macierzy zewnątrzkomórkowej do zastosowań in vitro i in vivo
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
08:10
Porównywalna decelularyzacja eksplantatów tkanek serca płodu i dorosłych jako platformy podobne do 3D do badań in vitro
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
06:01
Produkcja włókien macierzy zewnątrzkomórkowej poprzez protektorową hodowlę komórek z pustych włókien
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
11:01
Badanie normalnych efektów promieniowania tkanek za pomocą hydrożeli macierzy zewnątrzkomórkowej
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 15 sierpnia 2026