JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 5:55 min • April 30th, 2023
- Najpierw umieść uśpioną mysz na desce sekcyjnej. Tuż nad brzuchem przeciąć skórę i otrzewną. Nakłuj przeponę i przetnij wzdłuż żeber i klatki piersiowej aż do tchawicy. Wykonaj małe nacięcie w tchawicy. Delikatnie włóż igłę do tchawicy, nie uszkadzając cariny i przymocuj ją kleszczami. Wstrzyknąć do płuc agarozę o niskiej temperaturze topnienia o normalnej temperaturze ciała. Powoli wyjąć strzykawkę i trzymać igłę w środku, aby zapobiec cofaniu się agarozy.
Wlej zimny PBS do płuc, aby pobudzić żelowanie agarozy. Wyjmij igłę i przymocuj tchawicę kleszczami, aby uniknąć cofania się niezestalonej agarozy. Rozetnij mostek, przytrzymaj tchawicę kleszczami i przetnij ją nożyczkami. Wyciągnij płuca z jamy klatki piersiowej. Oddziel płaty w pożywce. Umieścić w studzienkach obrazowych w warunkach fizjologicznych do mikroskopii. Agaroza zachowuje morfologię płuc w temperaturach fizjologicznych, które pomagają obserwować żywe interakcje komórkowe. W poniższym protokole zademonstrujemy obrazowanie płuc na żywo ex vivo w celu zbadania interakcji między komórkami rakowymi a komórkami zrębu.
- Aby przygotować płuca do obrazowania na żywo ex vivo, zacznij od unieruchomienia myszy na pokrywie z pianki polistyrenowej pokrytej kawałkiem nasączenia i wysterylizuj zwierzę 70% etanolem. Następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych wykonaj poprzeczne nacięcie nadbrzusza przez skórę, a następnie podobne nacięcie przez otrzewną. Następnie, przesuwając deskę sekcyjną do pozycji pionowej, przecinaj aortę zstępującą tak, aby krew zbierała się w jamie brzusznej, a nie w klatce piersiowej.
Wytnij mały otwór w przeponie, aby uwolnić podciśnienie, a następnie przetnij wzdłuż klatki piersiowej, aby wyciąć przeponę i uwidocznić płuca. Za pomocą nożyczek chirurgicznych przetnij skórę aż do tchawicy nad klatką piersiową, pozostawiając żebra nienaruszone. Następnie oddziel skórę od klatki piersiowej i usuń otaczającą tkankę łączną, aby odsłonić tchawicę, uważając, aby nie uszkodzić samej tchawicy. Wytnij mały otwór o średnicy około 1 milimetra w odsłoniętej tchawicy równolegle do pierścieni chrzęstnych jak najbliżej krtani, nie przecinając całkowicie tchawicy.
Następnie delikatnie włóż igłę o rozmiarze 20 na 4 do 5 milimetrów do tchawicy bez żadnej siły przeciwnej. Koniec igły powinien być widoczny przez tchawicę. Napełnij strzykawkę 400 mikrolitrami agarozy o temperaturze 37 stopni Celsjusza 2% o niskiej temperaturze topnienia, a następnie ustabilizuj igłę kleszczami. Trzymając deskę sekcyjną w pozycji pionowej, powoli wkraplaj całą ilość ciepłej agarozy przez igłę do płuc. Po napompowaniu płuc odłącz strzykawkę, trzymając igłę w tchawicy i wlej około 50 mililitrów PBS o temperaturze 20 stopni Celsjusza na płuca, aby pomóc w ustawieniu agarozy.
Gdy agaroza zastygnie, usuń igłę i użyj kleszczyków, aby zamknąć tchawicę, aby zapobiec wyciekowi niezestalonej agarozy. Teraz otwórz klatkę piersiową dalej przez sternotomię i chwyć tchawicę kleszczami. Następnie za pomocą nożyczek chirurgicznych całkowicie przeciąć tchawicę. Aby usunąć płuca, delikatnie pociągnij tchawicę do góry, odetnij tkankę łączną i przełyk i całkowicie wyciągnij płuca z jamy klatki piersiowej.
Zanurz tkankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza RPMI 1640, aby zmyć nadmiar krwi. Za pomocą nożyczek i kleszczy odetnij główne oskrzela trzonu płata na wnęce i delikatnie oddziel płaty płuc. Przenieś płaty do jednego dołka 24-dołkowej płytki obrazowej płaską powierzchnią w dół i przykryj tkankę 100 mikrolitrami 37 stopni Celsjusza RPMI 1640. Umieść kilka 15-mililitrowych okrągłych szkiełek mikroskopowych na wierzchu płatów, aby zapobiec ich unoszeniu się, i wlej ciepły PBS do otaczających studzienek, aby zapobiec parowaniu pożywki. Następnie włóż 24-dołkową płytkę do komory klimatycznej i przenieś komorę do stolika mikroskopu konfokalnego.