Test ekstrakcji RNA: metoda ekstrakcji RNA z transfekowanych komórek raka płuc miRNA

- Na początek wysiew komórki raka płuc w kolbie T zawierającej pożywkę do hodowli tkankowej i pozwól jej rosnąć przez noc. Następnie zawiesić miRNA ze środkiem transfekującym do pożywki transfekcyjnej. Usuń pożywkę i dodaj pożywkę transfekcyjną, która wprowadzi miRNA do komórek rakowych. miRNA to niekodująca cząsteczka RNA, która wiąże się z komplementarną sekwencją mRNA i blokuje ekspresję genów. Inkubować kolbę przez żądany czas.

Następnie zastąp pożywkę pożywką do hodowli tkankowych i hoduj przez noc. Dodaj trypsynę do dysocjacji komórek. Przenieść mieszaninę do probówki wirówkowej zawierającej PBS i odwirować ją. Usuń supernatant i dodaj bufor do lizy komórek i dodaj ultra czysty etanol do wytrącenia. Umieść mieszaninę w kolumnie oddzielającej w celu oczyszczenia kwasu nukleinowego i odwirowania.

Usunąć przepływ i dodać bufor do płukania, aby usunąć zmieloną błonę komórkową i odwirować. Usunąć bufor płuczący i dodać DNazę z buforem do mineralizacji DNazy w celu usunięcia DNA z próbki i odwirowania. Dodaj bufor przygotowawczy RNA, aby wyizolować RNA i odwirować. Zebrać RNA obecne w supernatancie. W poniższym protokole wykonamy ekstrakcję RNA z komórek raka płuc leczonych miRNA.

- Najpierw wysiewaj komórki rakowe w odpowiedniej kolbie wystarczającej do ekstrakcji RNA i białka w celu przeprowadzenia ekspresji genów za pomocą qPCR lub analizy mikromacierzy. Następnie inkubować przez noc z pożywką uzupełnioną 10% FBS i 1% penicyliną-streptomycyną.

Następnego dnia przygotuj próbkę mikroRNA do transfekcji, rozcieńczając mikroRNA 143 i mikroRNA 506 w pożywce, w stężeniu 100 nanomolowych każde. Wyjąć kolbę z inkubatora i wyjąć pożywkę. Umyć 1 x PBS.

Wszystkie niepoddane działaniu substancji kontrole będą zawierały tylko niekompletne pożywki z komórkami. Inkubować komórki z pożywką do transfekcji przez sześć godzin w inkubatorze. Po sześciu godzinach wyjmij pożywkę i zastąp ją 4 mililitrami świeżej, kompletnej pożywki. Zbierz komórki po 24 godzinach i 48 godzinach przez trypsynizację.

Następnie przemyć dwukrotnie 1x PBS w każdej probówce i usunąć supernatant. Aby przeprowadzić ekstrakcję RNA w późniejszym czasie, należy zamrozić komórki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

- Ekstrakcję RNA przeprowadzono przy użyciu zestawu RNA, zgodnie z instrukcjami producenta. Najpierw wyjmij probówki z minus 80 stopni Celsjusza i pozostaw do rozmrożenia.

- Dodaj 300 mikrolitrów buforu do lizy i pipetuj w górę iw dół, aby przerwać błonę komórkową. Dodaj równą objętość 100% ultra czystego etanolu. Następnie dobrze wymieszaj i umieść w kolumnie oddzielającej. Odwirować i usunąć przepływ.

Dodaj 400 mikrolitrów buforu płuczącego i odwiruj, aby usunąć bufor. Dodać 5 mikrolitrów DNAzy I z 75 mikrolitrami buforu do trawienia DNA w każdej próbce i inkubować przez 15 minut. Następnie przemyj próbkę 400 mikrolitrowym buforem przygotowawczym RNA.

Następnie przemyć dwukrotnie buforem do przemywania RNA. Teraz dodaj wodę wolną od nukleaz do kolumny, odwiruj, a następnie zbierz RNA. Zmierz stężenie RNA, na tym etapie można wysłać 2 mikrogramy próbki RNA do sekwencjonowania RNA.