Analiza cyklu komórkowego: podejście do badania regulacji cyklu komórkowego komórek raka płuc transfekowanych miRNA

- MikroRNA lub miRNA to mały, niekodujący RNA. Po transfekcji mRNA lub wprowadzeniu do komórki tworzy kompleks białkowy miRNA. Kompleks celuje i wiąże się ze specyficznym mRNA i negatywnie reguluje jego ekspresję, zatrzymując postęp cyklu komórkowego.

Aby rozpocząć analizę, dodaj odpowiedni utrwalacz odwadniający do zebranej kultury komórek raka płuc transfekowanych miRNA. Utrwalacz konserwuje komórki, a także przenika błonę komórkową. Potraktuj komórki mieszaniną jodku propidyny, fluorescencyjnego barwnika kwasu nukleinowego i enzymu rybonukleazy.

Barwnik dostaje się do komórek i barwi zarówno DNA, jak i RNA. Enzymy specyficznie degradują RNA, umożliwiając optymalną kwantyfikację DNA. Użyj cytometru przepływowego, aby określić proporcję komórek zatrzymanych w różnych fazach cyklu komórkowego na podstawie intensywności fluorescencji poszczególnych komórek.

Komórki w fazie spoczynku i wzrostu mają niższą zawartość DNA, a co za tym idzie, niższą intensywność fluorescencji. Komórki w fazie Gap 2 z dwukrotnie większą ilością DNA wytwarzają dwukrotnie większą intensywność fluorescencji. Komórki w fazie syntezy DNA indukują wartość fluorescencji między pozostałymi dwiema populacjami. Poniższy protokół przeanalizuje regulację cyklu komórkowego komórek raka płuc leczonych miRNA, mierząc ich zawartość DNA za pomocą barwienia PI i cytometrii przepływowej.

- Transfekcja komórek zgodnie z opisem we wcześniejszej części tego filmu. Zbierz komórki z każdej próbki w oddzielnych sterylnych probówkach o pojemności 15 mililitrów przez trypsynizację. Następnie przemyć komórki dwukrotnie 1X PBS przez odwirowanie przy 751 g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Ponownie zawiesić i rozbić granulkę, dodając 200 mikrolitrów lodowatego 1X PBS przez pipetowanie.

Dodaj kroplami 2 mililitry 70% lodowatego etanolu do probówki, delikatnie obracając probówkę, aby utrwalić komórki. Inkubuj probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej i umieść je w 4 stopniach Celsjusza na 1 godzinę. Wyjmij probówki z 4 stopni Celsjusza i odwiruj.

Dodać 2 ml lodowatego PBS i odwirować, a następnie usunąć supernatant przez odwirowanie. Dodać 500 mikrolitrów 1X PBS zawierającego jodek propidyny i rybonukleazę A o stężeniach odpowiednio 50 i 200 mikrogramów na mililitr do każdej próbki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść próbki do odpowiednich probówek chroniących przed światłem i uruchomić cytometr przepływowy.