Analiza cyklu komórkowego: podejście do badania regulacji cyklu komórkowego komórek raka płuc transfekowanych miRNA

- MikroRNA lub miRNA to mały, niekodujący RNA. Po transfekcji mRNA lub wprowadzeniu do komórki tworzy kompleks białkowy miRNA. Kompleks celuje i wiąże się ze specyficznym mRNA i negatywnie reguluje jego ekspresję, zatrzymując postęp cyklu komórkowego.

Aby rozpocząć analizę, dodaj odpowiedni utrwalacz odwadniający do zebranej kultury komórek raka płuc transfekowanych miRNA. Utrwalacz konserwuje komórki, a także przenika błonę komórkową. Potraktuj komórki mieszaniną jodku propidyny, fluorescencyjnego barwnika kwasu nukleinowego i enzymu rybonukleazy.

Barwnik dostaje się do komórek i barwi zarówno DNA, jak i RNA. Enzymy specyficznie degradują RNA, umożliwiając optymalną kwantyfikację DNA. Użyj cytometru przepływowego, aby określić proporcję komórek zatrzymanych w różnych fazach cyklu komórkowego na podstawie intensywności fluorescencji poszczególnych komórek.

Komórki w fazie spoczynku i wzrostu mają niższą zawartość DNA, a co za tym idzie, niższą intensywność fluorescencji. Komórki w fazie Gap 2 z dwukrotnie większą ilością DNA wytwarzają dwukrotnie większą intensywność fluorescencji. Komórki w fazie syntezy DNA indukują wartość fluorescencji między pozostałymi dwiema populacjami. Pon