Analiza cyklu komórkowego: podejście do badania regulacji cyklu komórkowego komórek raka płuc transfekowanych miRNA
JoVE Encyclopedia of Experiments
Badania nad rakiem
0 wyświetleń • 3:34 min • April 30th, 2023
- MikroRNA lub miRNA to mały, niekodujący RNA. Po transfekcji mRNA lub wprowadzeniu do komórki tworzy kompleks białkowy miRNA. Kompleks celuje i wiąże się ze specyficznym mRNA i negatywnie reguluje jego ekspresję, zatrzymując postęp cyklu komórkowego.
Aby rozpocząć analizę, dodaj odpowiedni utrwalacz odwadniający do zebranej kultury komórek raka płuc transfekowanych miRNA. Utrwalacz konserwuje komórki, a także przenika błonę komórkową. Potraktuj komórki mieszaniną jodku propidyny, fluorescencyjnego barwnika kwasu nukleinowego i enzymu rybonukleazy.
Barwnik dostaje się do komórek i barwi zarówno DNA, jak i RNA. Enzymy specyficznie degradują RNA, umożliwiając optymalną kwantyfikację DNA. Użyj cytometru przepływowego, aby określić proporcję komórek zatrzymanych w różnych fazach cyklu komórkowego na podstawie intensywności fluorescencji poszczególnych komórek.
Komórki w fazie spoczynku i wzrostu mają niższą zawartość DNA, a co za tym idzie, niższą intensywność fluorescencji. Komórki w fazie Gap 2 z dwukrotnie większą ilością DNA wytwarzają dwukrotnie większą intensywność fluorescencji. Komórki w fazie syntezy DNA indukują wartość fluorescencji między pozostałymi dwiema populacjami. Poniższy protokół przeanalizuje regulację cyklu komórkowego komórek raka płuc leczonych miRNA, mierząc ich zawartość DNA za pomocą barwienia PI i cytometrii przepływowej.
- Transfekcja komórek zgodnie z opisem we wcześniejszej części tego filmu. Zbierz komórki z każdej próbki w oddzielnych sterylnych probówkach o pojemności 15 mililitrów przez trypsynizację. Następnie przemyć komórki dwukrotnie 1X PBS przez odwirowanie przy 751 g przez 5 minut, a następnie usunąć supernatant. Ponownie zawiesić i rozbić granulkę, dodając 200 mikrolitrów lodowatego 1X PBS przez pipetowanie.
Dodaj kroplami 2 mililitry 70% lodowatego etanolu do probówki, delikatnie obracając probówkę, aby utrwalić komórki. Inkubuj probówki przez 30 minut w temperaturze pokojowej i umieść je w 4 stopniach Celsjusza na 1 godzinę. Wyjmij probówki z 4 stopni Celsjusza i odwiruj.
Dodać 2 ml lodowatego PBS i odwirować, a następnie usunąć supernatant przez odwirowanie. Dodać 500 mikrolitrów 1X PBS zawierającego jodek propidyny i rybonukleazę A o stężeniach odpowiednio 50 i 200 mikrogramów na mililitr do każdej próbki i inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Przenieść próbki do odpowiednich probówek chroniących przed światłem i uruchomić cytometr przepływowy.
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje rolę mikroRNA (miRNA) w regulacji cyklu komórkowego komórek raka płuca. Wykorzystując cytometrię przepływową oraz barwienie jodkiem propidyny, badanie ma na celu ilościowe oznaczenie zawartości DNA i analizę faz cyklu komórkowego w komórkach traktowanych miRNA.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia komórki
- Onkologia
- Badania nad mikroRNA
Wstęp
- MikroRNA to małe, niekodujące cząsteczki RNA, które regulują ekspresję genów.
- Odgrywają one kluczową rolę w różnych procesach komórkowych, w tym w cyklu komórkowym.
- Zrozumienie wpływu miRNA na komórki raka płuca może dostarczyć cennych informacji na temat biologii nowotworów.
- Cytometria przepływowa jest potężnym narzędziem do analizy dynamiki cyklu komórkowego.
Cel badania
- Analiza wpływu miRNA na cykl komórkowy komórek raka płuca.
- Pomiar zawartości DNA przy użyciu barwienia jodkiem propidyny.
- Wyznaczenie proporcji komórek w poszczególnych fazach cyklu komórkowego.
Zastosowane metody
- Transfekcja komórek raka płuca miRNA.
- Zbiór i utrwalanie komórek przy użyciu fiksaty dehydratującej.
- Barwienie komórek jodkiem propidynyum i enzymem rybonukleazą.
- Analiza metodą cytometrii przepływowej w celu oceny intensywności fluorescencji i zawartości DNA.
Główne wyniki
- Komórki w różnych fazach cyklu komórkowego wykazywały zróżnicowaną intensywność fluorescencji.
- Komórki w fazie spoczynku i fazie wzrostu wykazywały niższą zawartość DNA.
- Komórki w fazie G2 miały dwukrotnie wyższą intensywność fluorescencji w porównaniu do komórek w fazie spoczynku.
- Komórki w fazie syntezy DNA wykazywały pośrednie wartości fluorescencji.
Wnioski
- transfekcja miRNA znacząco wpływa na przebieg cyklu komórkowego w komórkach raka płuc.
- Cytometria przepływowa jest skuteczną metodą analizy faz cyklu komórkowego na podstawie zawartości DNA.
- Zrozumienie roli miRNA może doprowadzić do opracowania nowych strategii terapeutycznych w leczeniu nowotworów.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ilościowa analiza cyklu komórkowego w komórkach raka płuc przetransfekowanych miRNA umożliwia precyzyjne badanie mechanizmów regulacji cyklu komórkowego istotnych dla odkrywania leków onkologicznych. Pomiar zawartości DNA z wykorzystaniem cytometrii przepływowej dostarcza przydatnych danych do walidacji celów terapeutycznych i ograniczania ryzyka mechanistycznego we wczesnych etapach programów terapeutycznych. Podejście to zwiększa wiarygodność predykcyjną w kluczowych punktach zwrotnych procesu badawczo-rozwojowego w onkologii.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią ocenę zatrzymania cyklu komórkowego indukowanego przez miRNA w modelach nowotworowych istotnych dla danej choroby.
- Wspiera walidację funkcjonalną celów regulujących cykl komórkowy poprzez ilościową analizę zawartości DNA.
- Ułatwia analizę mechanistyczną i ograniczanie ryzyka poprzez rozróżnienie efektów wpływających na poszczególne fazy cyklu komórkowego.
- Dostarcza danych prognostycznych służących do wstępnej selekcji kandydatów miRNA w portfolio onkologicznym.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ustanawia znormalizowany, powtarzalny test cytometrii przepływowej do ilościowego wyznaczania faz cyklu komórkowego.
- Dostarcza wyników ilościowych odpowiednich do wysokoprzepustowego przesiewu bibliotek miRNA lub związków chemicznych.
- Umożliwia solidne porównanie interwencji hamujących proliferację w różnych grupach eksperymentalnych.
- Wspiera skalowalność testu i ponowne wykorzystanie platformy w szerszych zastosowaniach onkologicznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia zestawienie danych dotyczących zatrzymania cyklu komórkowego in vitro z przedklinicznymi modelami hamowania wzrostu guza.
- Zapewnia ciągłość przejścia od mechanistycznych badań w fazie odkryć do translacyjnego opracowania biomarkerów.
- Wspiera podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju kandydatów na terapeutyki oparte na miRNA w oparciu o analizę ryzyka.
- Zwiększa wartość prognostyczną dla późniejszych badań nad skutecznością w ramach programów onkologicznych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta analiza cyklu komórkowego oparta na cytometrii przepływowej wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, wspierając zarówno walidację celów, jak i identyfikację wiodących cząsteczek w badaniach onkologicznych.
- Biologia odkrywcza: Ilościowo określa wpływ miRNA na progresję cyklu komórkowego, wyjaśniając szlaki regulacyjne w komórkach nowotworowych.
- Przesiewanie: Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty do oceny kandydackich miRNA lub związków.
- Analityka: Umożliwia statystyczne porównanie rozkładu faz cyklu komórkowego w różnych warunkach doświadczalnych.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki mechanistyczne in vitro z przedklinicznymi modelami wzrostu guza, gdy jest to wspierane przez dane.
- Zastosowanie w przedsiębiorstwach: Oferuje zestandaryzowany test możliwy do adaptacji dla różnych linii komórkowych nowotworów i celów miRNA.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w programach onkologicznych ukierunkowanych na cykl komórkowy.
- Wartość operacyjna: Zapewnia zestandaryzowane, skalowalne i powtarzalne przepływy pracy analizy cyklu komórkowego.
- Wartość strategiczna: Poprawia proces podejmowania decyzji go/no-go oraz alokację kapitału poprzez dostarczenie rzetelnych danych mechanistycznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów miRNA i regulatorów cyklu komórkowego w onkologicznych potokach badawczych z uwzględnieniem korekty o ryzyko.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie cytometrii przepływowej oraz technik transfekcji kwasów nukleowych.
- Wymaga dostępu do aparatury do cytometrii przepływowej oraz odczynników do fluorescencyjnego oznaczania ilości DNA.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów przygotowania próbek i analizy danych pomiędzy zespołami.
- Metoda jest dostosowalna do różnych linii komórek nowotworowych, przy czym wymagana jest optymalizacja protokołu dla konkretnych systemów modelowych.
- Dokładna kwantyfikacja faz zależy od rygorystycznej kontroli degradacji RNA oraz barwienia DNA.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmaceutyków
Czasowe śledzenie progresji cyklu komórkowego za pomocą cytometrii przepływowej bez konieczności synchronizacji
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Oparta na obrazowaniu i cytometrii przepływowej analiza położenia komórki i cyklu komórkowego w sferoidach czerniaka 3D
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Badanie ekspresji genów regulowanej cyklem komórkowym za pomocą dwóch uzupełniających się protokołów synchronizacji komórek
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Analiza pozycji cyklu komórkowego w komórkach ssaków
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Test ekstrakcji RNA: metoda ekstrakcji RNA z transfekowanych komórek raka płuc miRNA
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Mikromacierz przeciwciał: technika badania ekspresji białek w komórkach raka płuc leczonych miRNA
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Profilowanie regulowanych estrogenem mikroRNA w komórkach raka piersi
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Kliniczno-patologiczna analiza ekspresji miRNA w tkankach raka piersi przy użyciu hybrydyzacji miRNA in situ
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Po drugiej stronie lustra: mikroskopia poklatkowa i podłużne śledzenie pojedynczych komórek w celu zbadania terapii przeciwnowotworowych
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Analiza skojarzonych zabiegów miRNA w celu regulacji cyklu komórkowego i angiogenezy
Powiązane filmy
0 Wyświetlenia
Ostatnia aktualizacja: 22 sierpnia 2026