Jaki jest główny zastosowanie tego protokołu?

Protokół jest stosowany do analizy zmian ekspresji białek związanych z cyklem komórkowym.

Jak leczenie microRNA wpływa na poziomy białek?

Leczenie microRNA może znacząco zmienić ekspresję białek zaangażowanych w cykl komórkowy.

Jakie są kluczowe kroki w przygotowywaniu mikroarray?

Kluczowe kroki obejmują biotinylację białek, blokowanie slajdu i inkubację z buforami detekcyjnymi.

Dlaczego blokowanie jest ważne w tym protokole?

Blokowanie zapobiega niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał, zapewniając dokładne wyniki.

Jaka technologia jest używana do analizy mikroarray?

Do wykrywania fluorescencyjnych sygnałów z związanych białek używany jest skaner mikroarray.

Jak są ilościowo oceniane wyniki?

Wyniki są ilościowo oceniane na podstawie intensywności fluorescencyjnych sygnałów wykrytych przez skaner.

Mikromacierz przeciwciał: technika badania ekspresji białek w komórkach raka płuc leczonych miRNA

JoVE Encyclopedia of Experiments

Cancer Research

0 views • 3:02 min • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- Zacznij od dodania roztworu biotyny i buforu znakującego do próbki białka. Inkubować, aby ułatwić przyłączanie biotyny do białek. Dodaj odczynnik zatrzymujący i wiruj. Następnie umieść szkiełko mikromacierzy przeciwciał w naczyniu zawierającym odczynnik blokujący, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu przeciwciał. Umyj szkiełko wodą podwójnie destylowaną, aby usunąć roztwór blokujący. Umieść szkiełko z mikromatrycą w komorze. Wymieszać biotynylowaną próbkę białka z roztworem sprzęgającym i dodać do szkiełka, aby ułatwić wiązanie docelowych białek z odpowiadającymi im przeciwciałami. Przenieść szkiełko do naczynia zawierającego bufor do przemywania i zastąpić bufor wodą podwójnie destylowaną. Następnie umieść szkiełko w buforze detencyjnym zawierającym znakowaną fluorescencyjnie streptawidynę, aby ułatwić jej wiązanie z biotynylowanymi białkami.

Inkubuj naczynie w ciemności, aby utrzymać intensywność fluorescencji. Wyjmij szkiełko i umieść je w skanerze z mikromacierzą. Skaner poszukuje sygnałów fluorescencyjnych ze streptawidyny związanych z białkiem docelowym. Na podstawie intensywności fluorescencji oprogramowanie analizuje stopień ekspresji białek. W poniższym protokole wykonujemy mikromacierz przeciwciał do analizy zmian w ekspresji genów związanych z cyklem komórkowym.

- Eksperyment ten ma na celu zidentyfikowanie wszystkich zmian ekspresji białek szlaku cyklu komórkowego w wyniku leczenia mikroRNA. Pobrać próbki białka zgodnie z procedurą opisaną w rozdziale dotyczącym transfekcji i oznaczyć ilościowo za pomocą testu BCA. Wyjmij szkiełka z minus 4 stopni Celsjusza na godzinę przed eksperymentem, aby doprowadzić do temperatury pokojowej i usunąć wilgoć. Pobrać 70 mikrogramów próbek białka i przygotować preparaty podstawowe zgodnie z instrukcją producenta, która jest również opisana krok po kroku w części tekstowej.

W tym miejscu należy zauważyć, że prawidłowe mycie szkiełek ultraczystą wodą dejonizowaną jest kolejnym ważnym krokiem, ponieważ pomoże to zmniejszyć tło slajdów. Ponadto w tym eksperymencie bardzo ważne jest, aby nie wysuszać szkiełek z próbkami aż do ostatniego etapu. Na koniec zeskanuj slajd za pomocą mikromacierzy i przeanalizuj dane.